無創(chuàng)DNA檢測在胎兒鼻骨發(fā)育異常中的應(yīng)用價(jià)值

張艷萍，鐘世林，董晶，王賀，鄧玉清

無創(chuàng)DNA產(chǎn)前檢測是通過獲取孕婦外周血中胎兒游離DNA片段，應(yīng)用高通量測序技術(shù)，結(jié)合生物信息分析，檢測胎兒染色體異常的一種產(chǎn)前檢測方法。DNA高通量測序技術(shù)具有所需樣本量少、高通量、敏感度高、特異度高和無創(chuàng)性等優(yōu)點(diǎn)[1-2]，被越來越多的孕婦所接受。近年來，其檢測范圍從最初的檢測三種最常見的非整倍體疾病逐步延伸至染色體微缺失微重復(fù)疾病的檢測。本研究回顧性分析北京大學(xué)深圳醫(yī)院2018年3月至2020年3月期間，孕期已行無創(chuàng)DNA檢測并在產(chǎn)前超聲提示胎兒鼻骨發(fā)育異常行介入性產(chǎn)前診斷的孕婦，通過染色體核型和染色體微陣列分析(chromosome microarray analysis，CMA)檢測結(jié)果對無創(chuàng)DNA檢測結(jié)果進(jìn)行分析，了解無創(chuàng)DNA檢測結(jié)果與染色體核型和CMA檢測結(jié)果的關(guān)系，從而更好地指導(dǎo)臨床工作中胎兒鼻骨發(fā)育異常病例是否需要進(jìn)一步行介入性產(chǎn)前診斷。

1 對象和方法

1.1 研究對象

選取2018年3月至2020年3月期間，孕期定期產(chǎn)檢，并在孕12周后行唐氏篩查及無創(chuàng)DNA檢測的孕婦，孕期產(chǎn)前超聲提示胎兒鼻骨發(fā)育異常后就診北京大學(xué)深圳醫(yī)院產(chǎn)前診斷中心，經(jīng)獲得產(chǎn)前診斷遺傳咨詢資格的醫(yī)生解釋后，決定進(jìn)一步行介入性產(chǎn)前診斷的81例孕婦的資料，進(jìn)行回顧性分析，孕婦年齡17～44歲，平均(29.79±4.38)歲，孕周17+3～35周，平均(24.3±3.2)周。

1.2 方法

1.2.1 無創(chuàng)DNA檢測 簽署知情同意書及保險(xiǎn)單后，抽取靜脈血5 mL，4℃ 條件下送深圳華大基因醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)室進(jìn)行檢測。

1.2.2 胎兒超聲 鼻骨缺失為胎兒面部正中矢狀面、橫切面和冠狀面均未顯示鼻骨聲像，鼻骨發(fā)育不良包括鼻骨短小、一側(cè)鼻骨缺失或鼻骨骨化差，鼻骨短小指鼻骨長度小于同孕周正常值的2.5百分位[3]。

1.2.3 介入性產(chǎn)前診斷 孕婦及家屬簽署介入性產(chǎn)前診斷同意書后，由我院產(chǎn)前診斷中心操作熟練的醫(yī)生在超聲引導(dǎo)下采集胎兒樣本，孕17～26周行羊水穿刺術(shù)，孕26周以上行臍帶穿刺術(shù)。

1.2.4 染色體核型檢測 方法按照標(biāo)準(zhǔn)常規(guī)方法對胎兒羊水細(xì)胞或臍血細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)及胎兒染色體G顯帶核型分析。染色體核型命名根據(jù)《人類遺傳學(xué)國際命名體制ISCN(2016)》。

1.2.5 染色體微陣列分析檢測 采用Affymetrix CytoScan芯片檢測基因組中引起DNA拷貝數(shù)不平衡改變的微缺失與微重復(fù)，其臨床意義分為多態(tài)、致病性、不明確、可能致病、可能良性5種。

1.3 隨訪

交代所有在我院行介入性產(chǎn)前診斷手術(shù)的孕婦術(shù)后3天復(fù)診，術(shù)后1周及產(chǎn)后有產(chǎn)前診斷中心專職工作人員電話咨詢孕婦胎兒及新生兒情況。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 22.0 統(tǒng)計(jì)軟件錄入數(shù)據(jù)，計(jì)數(shù)資料采用頻數(shù)及率表示，采用χ2檢驗(yàn)比較鼻骨異常者無創(chuàng)DNA檢測異常與年齡是否存在顯著性差異。采用χ2檢驗(yàn)了解無創(chuàng)DNA對鼻骨異常孕婦染色體及CMA異常檢出情況，以及唐氏篩查聯(lián)合無創(chuàng)DNA檢測對鼻骨異常孕婦染色體及CMA異常檢出情況。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

81例孕婦中，共有62例接受羊水穿刺，19例接受臍帶穿刺，81例孕婦無一例出現(xiàn)術(shù)后流產(chǎn)、宮內(nèi)感染、胎膜破裂等并發(fā)癥。共檢出染色體核型異常7例，占8.64%(7/81)，其中21-三體6例(染色體核型47，XN，+21)，染色體不平衡易位1例(染色體核型46，XN，der(7)t(7;11)(p22;q21)pat)。CMA結(jié)果異常19例，占23.46%(19/81)，致病性結(jié)果異常9例，占11.11%(9/81)，其中21-三體6例(染色體21q11.2-q22.3重復(fù)33.08Mb)，致病性微重復(fù)3例(分別為染色體17p12重復(fù)1.40Mb；染色體1q21.1～q21.2重復(fù)1.90Mb；染色體11q21～q25重復(fù)41.01Mb)，意義不明確片段10例。其中9例經(jīng)染色體核型分析及CMA檢測確診為染色體致病性異常胎兒的孕婦選擇終止妊娠，其余72例孕婦繼續(xù)妊娠，定期產(chǎn)檢，通過孕婦預(yù)產(chǎn)期估計(jì)孕婦分娩后電話咨詢新生兒情況，有1例胎兒染色體核型結(jié)果正常，CMA結(jié)果為意義不明確片段(7q11.23～q21.11雜合性缺失5.07Mb)，新生兒生后檢查發(fā)現(xiàn)尿道下裂、先天性心臟病，目前一般情況平穩(wěn)，其余新生兒出生后電話隨訪均正?！，F(xiàn)將鼻骨異常不同情況的染色體核型及CMA結(jié)果進(jìn)行進(jìn)一步分析。

2.1 孕婦不同年齡段出現(xiàn)鼻骨異常胎兒染色體及染色體微陣列分析結(jié)果比較

81例鼻骨發(fā)育異常胎兒，根據(jù)孕婦年齡將其分為兩組(<35歲組、≥35歲組)，不同年齡孕婦合并鼻骨發(fā)育異常時(shí)無創(chuàng)DNA檢測異常率比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=1.761，P=0.185)，詳見表1。

表1 無創(chuàng)DNA檢測結(jié)果與年齡的關(guān)系

2.2 無創(chuàng)DNA檢測預(yù)測染色體核型及染色體微陣列分析的價(jià)值

接受了介入性產(chǎn)前診斷手術(shù)的81例孕婦在孕期均已行無創(chuàng)DNA檢測，將81例孕婦分為無創(chuàng)DNA檢測低風(fēng)險(xiǎn)組和高風(fēng)險(xiǎn)組，兩組病例染色體核型結(jié)果及CMA結(jié)果詳見表2?？梢姡瑹o創(chuàng)DNA高風(fēng)險(xiǎn)胎兒染色體異常及CMA致病性異常發(fā)生率較無創(chuàng)DNA檢測低風(fēng)險(xiǎn)增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=68.503，P<0.001；χ2=51.84，P<0.001)。無創(chuàng)DNA高風(fēng)險(xiǎn)時(shí)發(fā)現(xiàn)胎兒染色體異常的敏感度85.71%，特異度100%，陽性預(yù)測值100%，陰性預(yù)測值98.67%；無創(chuàng)DNA高風(fēng)險(xiǎn)時(shí)發(fā)現(xiàn)胎兒CMA致病性異常的敏感度66.67%，特異度100%，陽性預(yù)測值100%，陰性預(yù)測值96%。

表2 無創(chuàng)DNA結(jié)果與染色體核型及CMA結(jié)果的關(guān)系

2.3 唐氏篩查聯(lián)合無創(chuàng)DNA檢測預(yù)測染色體核型及染色體微陣列分析的價(jià)值

本研究中有76例孕婦同時(shí)行唐氏篩查及無創(chuàng)DNA檢測，將其按照唐氏篩查結(jié)果分為低風(fēng)險(xiǎn)(T21<1/1 000或T18<1/1 000)，臨界風(fēng)險(xiǎn)(1/1 000≤T21<1/270，1/1 000≤T18<1/350)，高風(fēng)險(xiǎn)(T21≥1/270或T18≥1/350)，結(jié)合無創(chuàng)DNA結(jié)果共同了解無創(chuàng)DNA對胎兒染色體及CMA結(jié)果的預(yù)測價(jià)值(詳見表3)。唐氏篩查臨界風(fēng)險(xiǎn)病例只有3例，無創(chuàng)DNA均為低風(fēng)險(xiǎn)，染色體結(jié)果及CMA結(jié)果均未見異常，分析時(shí)將其納入唐氏篩查低風(fēng)險(xiǎn)組計(jì)算。唐氏篩查高風(fēng)險(xiǎn)并無創(chuàng)DNA高風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測胎兒染色體異常的敏感度66.67%、特異度100%、陽性預(yù)測值100%、陰性預(yù)測值97.37%；預(yù)測胎兒CMA致病性異常的敏感度50%、特異度100%、陽性預(yù)測值100%、陰性預(yù)測值94.44%。唐氏篩查低風(fēng)險(xiǎn)并無創(chuàng)DNA低風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測胎兒染色體正常的敏感度88.57%、特異度100%、陽性預(yù)測值100%、陰性預(yù)測值42.86%；預(yù)測胎兒CMA非致病性異常的敏感度89.71%、特異度87.5%、陽性預(yù)測值98.39%、陰性預(yù)測值50%。其中，有1例唐氏篩查低風(fēng)險(xiǎn)，無創(chuàng)DNA低風(fēng)險(xiǎn)，超聲提示鼻骨缺如，胎兒染色體核型46，XN，CMA結(jié)果為致病性，(染色體17p12重復(fù)1.40Mb)；有1例唐氏篩查高風(fēng)險(xiǎn)，無創(chuàng)DNA低風(fēng)險(xiǎn)，超聲鼻骨缺如，胎兒染色體核型46，XN，CMA結(jié)果為致病性(染色體1q21.1～q21.2重復(fù)1.90Mb)；1例唐氏篩查高風(fēng)險(xiǎn)，無創(chuàng)DNA低風(fēng)險(xiǎn)，超聲鼻骨缺如并脊柱椎管內(nèi)囊性結(jié)構(gòu)，羊水檢查染色體核型46，XN，CMA結(jié)果為致病性(染色體11q21～q25重復(fù)41.01Mb)，這3例孕婦均選擇引產(chǎn)。

表3 聯(lián)合篩查結(jié)果與染色體核型及CMA結(jié)果的關(guān)系

3 討論

傳統(tǒng)的血清學(xué)篩查評估胎兒染色體異常的準(zhǔn)確率及敏感度不夠，假陽性率較高，長期以來很多研究者都在尋找一種安全、可靠的產(chǎn)前篩查方法。1997年Lo等[4]首次從孕育男胎的孕婦血清和血漿中提取并檢測到了男性胎兒DNA，隨后研究發(fā)現(xiàn)最早在妊娠第7周就可以在孕婦的血清中檢測到胎兒DNA，其濃度會隨著孕周的增加而上升[5]。隨著高通量測序技術(shù)的廣泛推廣，無創(chuàng)DNA產(chǎn)前檢測技術(shù)成為產(chǎn)前篩查的新模式。研究提示，無創(chuàng)DNA產(chǎn)前檢測對21-三體綜合征的總臨床敏感性為99.5%，對18-三體綜合征的總臨床敏感性為93.1%，對13-三體綜合征的總臨床敏感性為92.7%[6]。朱賽娟等[7]對其醫(yī)院800例無創(chuàng)DNA陽性結(jié)果與胎兒染色體核型結(jié)果對比中，發(fā)現(xiàn)無創(chuàng)DNA產(chǎn)前檢測對21-三體、18-三體、13-三體和性染色體非整倍體的陽性預(yù)測值是81.6%、68.2%、8.1%和41.2%，對其他染色體非整倍體的陽性預(yù)測值是1.6%，對拷貝數(shù)變異(copy number variation,CNV)的陽性預(yù)測值是54.5%。在本研究中，81例經(jīng)就診我院產(chǎn)前診斷中心咨詢并選擇進(jìn)一步行介入性產(chǎn)前診斷的孕婦，在孕期均已行無創(chuàng)DNA檢測。其中無創(chuàng)DNA T21高風(fēng)險(xiǎn)6例，經(jīng)產(chǎn)前診斷證實(shí)為21-三體，說明當(dāng)無創(chuàng)DNA高風(fēng)險(xiǎn)合并胎兒超聲指標(biāo)異常時(shí)，咨詢過程中應(yīng)高度重視，并強(qiáng)烈建議行介入性產(chǎn)前診斷。本研究中無創(chuàng)DNA檢測6例T21高風(fēng)險(xiǎn)均被檢出，敏感度達(dá)100%。本研究中無創(chuàng)DNA檢測低風(fēng)險(xiǎn)75例，經(jīng)產(chǎn)前診斷證實(shí)為染色體不平衡易位1例(染色體核型46，XN，der(7)t(7;11)(p22;q21)pat)，另CMA檢測多發(fā)現(xiàn)致病性微重復(fù)2例(分別為染色體17p12重復(fù)1.40Mb；染色體1q21.1～q21.2重復(fù)1.90 Mb)。染色體微缺失微重復(fù)綜合征(chromosome microdeletion and microduplication syndrome,CMMS)是由于染色體微小片段缺失或重復(fù)，使正?；虬l(fā)生改變而導(dǎo)致的染色體病，會導(dǎo)致先天性畸形、器官功能障礙、生長發(fā)育遲緩、智力障礙等，占新生兒先天性疾病的1%～2%，給家庭和社會造成嚴(yán)重的負(fù)擔(dān)[8]。一項(xiàng)大規(guī)模的無創(chuàng)DNA產(chǎn)前檢測隨訪數(shù)據(jù)研究了無創(chuàng)產(chǎn)前篩查技術(shù)在染色體非整倍體和全基因組微缺失/微重復(fù)綜合征檢測中的應(yīng)用價(jià)值，研究表明，無創(chuàng)DNA產(chǎn)前檢測對于其他罕見常染色體非整倍體的綜合PPV為29%，對性染色體非整倍體的PPV為46.7%，對CMMS總的陽性預(yù)測值為40.8%[9]。無創(chuàng)DNA技術(shù)也存在局限性[10]，國際產(chǎn)前診斷協(xié)會也建議，無創(chuàng)DNA檢測應(yīng)局限于臨床意義重大的疾病或明確定義的嚴(yán)重疾病，對一些臨床意義不明確的CMMS，對結(jié)果判讀和臨床處理可能面臨較大的風(fēng)險(xiǎn)，提示我們在臨床咨詢中遇到無創(chuàng)DNA低風(fēng)險(xiǎn)時(shí)，也不能考慮胎兒無染色體相關(guān)疾病而放松警惕，需根據(jù)實(shí)際情況對孕婦提出正確的咨詢指導(dǎo)意見[11]。

在本研究中，有76例孕婦在孕期同時(shí)行唐氏篩查及無創(chuàng)DNA檢測，從數(shù)據(jù)中可得知孕期唐氏篩查低風(fēng)險(xiǎn)或臨界風(fēng)險(xiǎn)，且無創(chuàng)DNA檢測低風(fēng)險(xiǎn)時(shí)，鼻骨發(fā)育異常的胎兒染色體核型異常發(fā)生率為0%(0/63)，致病性CMA異常的發(fā)生率為1.59%(1/63)，有1例染色體17p12重復(fù)1.40Mb通過CMA檢測發(fā)現(xiàn)；孕期唐氏篩查高風(fēng)險(xiǎn)，且無創(chuàng)DNA檢測低風(fēng)險(xiǎn)時(shí)，染色體核型異常發(fā)生率為11.1%(1/9)，有1例染色體不平衡易位通過染色體核型分析發(fā)現(xiàn)，致病性CMA異常的發(fā)生率為22.2%(2/9)，有1例染色體1q21.1～q21.2重復(fù)1.90Mb；1例染色體11q21～q25重復(fù)41.01Mb，這3例病例無創(chuàng)DNA檢測結(jié)果均為低風(fēng)險(xiǎn)，但通過CMA檢測均證實(shí)胎兒存在致病性染色體微重復(fù)改變，避免了出生缺陷。染色體微陣列分析技術(shù)能夠在全基因組水平檢測染色體不平衡的CNV，除了能夠檢出非整倍體異常，還能檢測低水平CNV，染色體雜合性缺失等染色體異常，進(jìn)一步檢測染色體微缺失或微重復(fù)，較染色體核型分析具有更高的分辨率和敏感度[12]，在本研究中的病例均行胎兒染色體核型分析及CMA分析，其中共檢出染色體核型異常7例，占11.96%(7/81)，CMA結(jié)果異常19例，占23.46%(19/81)，其中致病性CMA異常9例，CMA檢測較染色體核型分析多檢出兩例致病性微重復(fù)(分別為染色體17p12重復(fù)1.40Mb；染色體1q21.1～q21.2重復(fù)1.90Mb)。近年來，歐美[13]及我國[14]先后指出CMA檢測可提高有臨床意義的拷貝數(shù)變異的檢出率，產(chǎn)前超聲發(fā)現(xiàn)胎兒超聲檢查異常時(shí)可考慮行CMA檢測。郭莉等[15]在其研究中就發(fā)現(xiàn)在G顯帶78例陰性結(jié)果中，CMA檢出2例拷貝數(shù)變異，增加陽性檢出率2.56%，這2例病例1例引產(chǎn)，1例失訪。

在臨床咨詢工作中，我們經(jīng)常會遇到一些孕期唐氏篩查低風(fēng)險(xiǎn)、無創(chuàng)DNA檢測低風(fēng)險(xiǎn)，超聲提示胎兒鼻骨發(fā)育不良的孕婦，拒絕介入性產(chǎn)前診斷治療。辜秋陽等[16]在其研究中，298例因胎兒鼻骨發(fā)育異常進(jìn)一步檢查的孕婦，選擇行無創(chuàng)DNA檢測的孕婦有171例，且其研究中也建議如孕婦胎兒僅存在鼻骨缺失時(shí)，仍可考慮行無創(chuàng)DNA檢測作為產(chǎn)前篩查，一定程度上有效減少了孕婦侵入性產(chǎn)前診斷人數(shù)，也降低了流產(chǎn)風(fēng)險(xiǎn)[16]。但是，在本研究中也提示了無創(chuàng)DNA檢測可能漏診一些染色體拷貝數(shù)變異的病例，如為致病性改變的新生兒出生后，將對家庭和社會都造成巨大的負(fù)擔(dān)，無創(chuàng)DNA還不能完全取代介入性產(chǎn)前診斷。所以在臨床咨詢過程中，我們要詳細(xì)告知胎兒超聲異常的相關(guān)風(fēng)險(xiǎn)，根據(jù)孕婦和胎兒的具體實(shí)際情況，制定最適合孕婦的進(jìn)一步產(chǎn)前診斷方案。

由于本研究是回顧性分析，所以未能對其他超聲提示鼻骨異常僅行無創(chuàng)DNA檢測的孕婦做進(jìn)一步隨訪，所得出的數(shù)據(jù)也有偏差。如果能在后續(xù)的研究工作中將更多的病例進(jìn)一步納入研究，并制定一個(gè)最經(jīng)濟(jì)、創(chuàng)傷最小、最能讓孕婦及家屬接受的產(chǎn)前篩查及診斷方案，這將是我們未來繼續(xù)研究的方向。