銀鯧cck和cart4基因的克隆、表達及攝食水母對其表達模式的影響

練詩雅，王亞冰,王 倩,陳 潤,李云凱,周俊芳，彭士明

(1.上海海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院，上海 201306；2.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院東海水產(chǎn)研究所，上海 200090；3.上海海洋大學(xué)海洋科學(xué)學(xué)院，上海 201306)

銀鯧(Pampusargenteus)隸屬鱸形目，鯧亞目，鯧科，鯧屬，因其肉質(zhì)細嫩、肌間刺較少，且營養(yǎng)豐富，所以具有較高的市場價值與需求，是我國重要的海產(chǎn)經(jīng)濟魚類之一[1]。20 世紀(jì)80 年代，我國已陸續(xù)開展了有關(guān)銀鯧繁殖生物學(xué)方面的研究工作，至今已在銀鯧的人工繁育及育苗等方面取得豐碩的研究成果[2-4]。近年的研究發(fā)現(xiàn)，銀鯧對水母具有明顯的攝食偏好，對海月水母(Aureliaaurita)的日攝食量超出其自身體質(zhì)量的10余倍[5]，利用碳氮穩(wěn)定同位素技術(shù)分析后發(fā)現(xiàn)，水母對銀鯧的餌料貢獻率最高可達54%[6]。然而，目前關(guān)于銀鯧對水母存在攝食偏好行為的內(nèi)在機理尚不清楚。

cck和cart基因是涉及魚類攝食的重要內(nèi)分泌調(diào)控因子。cck基因是胃腸功能的關(guān)鍵調(diào)節(jié)基因，也是包括魚類在內(nèi)的脊椎動物的重要飽腹感信號，與食欲調(diào)節(jié)有關(guān)[7-10]。目前，在一些魚類的中樞神經(jīng)系統(tǒng)和外周組織中均發(fā)現(xiàn)了Cck內(nèi)分泌因子，如金魚(Carassiusauratus)[11-12]、虹鱒(Oncorhynchusmykiss)[13]、大西洋鯡(Clupeaharengus)[14]、大西洋鮭(Salmonsalar)[15]、黑青斑河鲀(Tetraodonnigroviridis)和牙鲆(Paralichthysolivaceus)[16]。Cart被認為是調(diào)節(jié)嚙齒動物和人類的體重和食物攝入的重要神經(jīng)遞質(zhì)[17-18]，在大鼠(Rattusnorvegicus)中初次發(fā)現(xiàn)[19]，其在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中起著至關(guān)重要的作用，能影響多種生理功能，包括攝食行為、應(yīng)激反應(yīng)、免疫功能、自主調(diào)節(jié)、體液平衡、代謝過程、性功能和內(nèi)分泌控制[20-21]等。與Cck不同的是，它不僅具有短期效應(yīng)，還具有長期效應(yīng)，且其對攝食的抑制作用存在劑量依賴性[22]。

本研究以銀鯧為對象，在銀鯧有和無攝食水母的轉(zhuǎn)錄組文庫分別獲得了cck和cart4基因的片段，通過RACE 技術(shù)克隆了銀鯧cck和cart4全長基因, 并通過Real-time PCR技術(shù)分析了cck和cart4基因在不同組織中的表達水平及攝食水母對兩個基因表達模式的影響,以期為探究銀鯧對水母攝食偏好的調(diào)控機制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗用魚

200尾健康的銀鯧(151.1±4.6)g飼養(yǎng)于2個8 m×4 m×1.8 m的水泥池中，每個水泥池100尾，保持水泥池內(nèi)溫度25 ℃，鹽度20～22。每天分別于08∶00和17∶00投喂2次根據(jù)本課題組前期的研究成果配置銀鯧的人工配合飼料[1]，每天換50%水(07∶30)。馴養(yǎng)2周后，選取1個水泥池，除了投喂人工配合飼料，每天還額外投喂銀鯧體質(zhì)量3%的新鮮水母(傘蓋3～5 cm，)，于每日17∶00與配合飼料一起投喂。將未投喂水母的一組命名為對照組，投喂水母的一組命名為試驗組，實驗周期20 d(基于轉(zhuǎn)錄組學(xué)的時空表達分析發(fā)現(xiàn)，實驗維持20 d后與營養(yǎng)相關(guān)主要基因的表達基本趨于穩(wěn)態(tài))。第20天投喂結(jié)束后停食24 h，從每個水泥池中分別隨機選取36尾魚，經(jīng)丁香酚麻醉(100 mg·L-1)后解剖采集中腸、腦、鰓、肝臟、性腺、腎臟和肌肉組織，每6尾魚的相同組織合并后放入一個無菌管中混勻作為一個樣品，所有樣品經(jīng)液氮速凍后，置于-80 ℃保存。

1.2 銀鯧總RNA的提取

銀鯧各個組織的混合樣品總RNA提取按照RNAiso Plus(Total RNA提取試劑)試劑盒說明書操作，使用酚氯仿混合抽提去除蛋白，使用GenovaNano測定總RNA的濃度和純度，觀察A260/A280比率確定RNA的完整性，并用瓊脂糖凝膠電泳檢測。

第一鏈cDNA合成根據(jù)PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser(Perfect Real Time)說明書操作步驟進行。合成后的產(chǎn)物放于-20 ℃冰箱里保存。RACE的cDNA合成按照SMARTer RACE 5′/3′試劑盒中的說明進行。所獲得的RACE反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物用于后續(xù)的PCR擴增，并于-20 ℃保存。

1.3 銀鯧cck、cart4基因的全長克隆

本研究從銀鯧中腸(對照組與試驗組)的轉(zhuǎn)錄組文庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra/PRJNA736245)中分別篩選得到了cck和cart4基因的片段。將cck和cart4基因的序列與NCBI數(shù)據(jù)庫比對，該片段與魚類的cck和cart4基因具有極高的相似度。以此片段為模板，參照引物設(shè)計原則，使用Primer designing tool(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/)在線引物設(shè)計軟件進行引物設(shè)計(表1)。參照5′3′ RACE試劑盒中操作說明，采用巢式PCR對銀鯧cck和cart4基因5′3′端序列進行克隆。PCR反應(yīng)程序為預(yù)變性95 ℃ 3 min，變性94 ℃ 30 s，退火55 ℃ 30 s，延伸72 ℃ 30 s，修復(fù)延伸72 ℃ 7 min，30個循環(huán)。

表1 本文所用引物

將上述PCR產(chǎn)物用1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，按膠回收試劑盒[生工生物工程(上海)]使用說明書進行操作回收。將純化后的產(chǎn)物參照質(zhì)粒連接說明書連接到pMD18-T載體上。將已連接PCR產(chǎn)物的pMD18-T載體按照說明轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細胞(DH5α)中。過夜培養(yǎng)后，根據(jù)藍白斑規(guī)則，挑選陽性單克隆結(jié)果進行擴增培養(yǎng)，將培養(yǎng)好的菌液送至生工生物工程(上海)股份有限公司進行測序。

1.4 生物信息學(xué)分析

在NCBI網(wǎng)站上的ORF程序(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html)中分析了cck和cart4基因的全長cDNA序列。對ORF進行Blast比對，檢驗其與其他物種的同基因的相似度和一致性。用DNAMAN 6.0 軟件進行序列拼接以及序列比對分析。用BLASTX 和BLASTN 程序(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)比較已知物種的cck和cart4基因序列。系統(tǒng)進化樹分析使用MEGA 5.1進行，用Bootstrap法重復(fù)計算 1 000次。信號肽分裂位點用SignalP Ver.4.0程序[SignalP 4.0 Server(dtu.dk)]進行測定。

1.5 銀鯧cck和cart4基因組織表達

根據(jù)銀鯧cck和cart4基因的cDNA序列，在其開放閱讀框內(nèi)用Primer5.0在線設(shè)計Real-time PCR引物，并用瓊脂糖凝膠電泳檢測目的片段的正確性。引物列表見表1。根據(jù)1.2所采集樣品RNA的濃度，分別取各組織中1 μg總RNA用作逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的模板進行反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA。以cDNA為模板，以β-actin基因為內(nèi)參基因，用Real-time PCR檢測cck和cart4基因在不同組織CT值，采用2-ΔΔCT方法分析其表達模式以及攝食水母對其表達模式的影響(Livak and Schmittgen, 2001)。Real-time PCR反應(yīng)體系為25 μL, 包括2×UltraSYBR MixTure Supermix12.5 μL、上下游引物各0.5 μL、ddH2O 10.5 μL、cDNA模板1 μL。RT-PCR 反應(yīng)程序設(shè)置為(three steps)：Step 1：95 ℃ 10 min；Step 2：94 ℃ 15 s、60 ℃ 1 min、40 Cycles；Step 3：65～95 ℃，增量0.5 ℃ 5 sec(繪制熔解曲線)。

1.6 統(tǒng)計學(xué)分析

本研究所用數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，用SPSS 20.0進行統(tǒng)計分析，用one-way ANOVA方法對cck和cart4基因在不同組織的表達量進行顯著性檢驗和多重比較分析(P<0.05)。用獨立樣本t檢驗分析攝食水母對cck和cart4基因表達模式的影響，P<0.05為差異顯著，P<0.01為差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 銀鯧cck基因的克隆及序列結(jié)構(gòu)分析

通過RACE方法在銀鯧中成功獲得了cck基因(GenBank登錄號：MZ592785)全長序列。cck基因全長1 125 bp，5′-非翻譯區(qū)(5′-UTR)長42 bp，3′-UTR長679 bp，包含一個405 bp的開放閱讀框(ORF)，編碼合成一個134氨基酸的蛋白(圖1)。3′端發(fā)現(xiàn)多聚腺苷酸加尾信號(polyadenylation signal)和poly(A)尾巴，起始密碼子為ATG，終止密碼子為TAA(圖1)。位于3′-RACE PCR產(chǎn)物上的終止密碼子和poly(A)尾巴表明了cck基因的序列的完整性(圖1)。cck基因的氨基酸序列包含一個由21個氨基酸組成的信號肽(1～21位氨基酸)和一個典型的Cck家族的特征序列八肽(115～122位氨基酸)(圖2)。用BlastP 程序?qū)ck進行比對，結(jié)果顯示，銀鯧Cck與大口黑鱸(Micropterussalmoides)Cck的同源性最高(87.59%)，且與其他魚類同源性均高于67.88%(圖3)。由MEGA5.1構(gòu)建的多物種Cck系統(tǒng)進化樹(圖4)顯示，硬骨魚類Cck獨立于哺乳類(人類Homosapiens、蘇門答臘猩猩Pongoabelii、小鼠Musmusculus和奶牛Bostaurus)、軟體動物(蝦夷扇貝Mizuhopectenyessoensis)單獨聚成的一支，且銀鯧Cck與鮭形目(大西洋鮭)、狗魚目(白斑狗魚Esox lucius)、金眼鯛目(赤鋸鱗魚Myripristis murdjan)、合鰓魚目(黃鱔Monopterus albus)進化關(guān)系較遠，但與同為鱸形目的大口黑鱸聚在一個分支上，親緣關(guān)系最近。

圖1 銀鯧cck基因的核酸和氨基酸序列

圖2 用I-TASSER分析Cck的3D結(jié)構(gòu)

圖3 基于銀鯧和其他物種Cck序列的序列比對

圖4 銀鯧和其他物種Cck序列的系統(tǒng)進化樹

2.2 銀鯧cart4基因的克隆及序列結(jié)構(gòu)分析

通過RACE的方法在銀鯧中成功獲得一個cart的全長基因，使用BLAST比對發(fā)現(xiàn),銀鯧的cart基因和其他魚類cart4基因高度相近，因此將本研究中克隆得到的cart基因命名為cart4(GenBank登錄號：MZ592784)。銀鯧cart4基因全長865 bp，5′-UTR長133 bp，3′-UTR長400 bp，包含一個333 bp的ORF，編碼合成一個110氨基酸的蛋白(圖5)。3′端發(fā)現(xiàn)poly(A)尾巴，起始密碼子為ATG，終止密碼子為TAA(圖5)。位于3′-RACE PCR產(chǎn)物上的終止密碼子和poly(A)尾巴表明了cart4基因的序列的完整性(圖5)。Cart4氨基酸序列包含一個由24個氨基酸組成的信號肽(1～24位氨基酸)和一個名為CART的結(jié)構(gòu)域(45～110位氨基酸)(圖6)。用BlastP 程序?qū)art4氨基酸序列進行比對，結(jié)果顯示銀鯧Cart4與劍魚(Xiphiasgladius)Cart4同源性最高達91.82%，與其他魚類同源性均高于60.00%(圖7)。通過MEGA5.1構(gòu)建的多物種Cart4系統(tǒng)進化樹(圖8)顯示，硬骨魚類Cart4獨立于哺乳類(人類、大鼠)、野豬(Susscrofa)和雞(Gallusgallus))、兩棲動物(飾紋姬蛙Microhylaornate和非洲爪蟾Xenopustropicalis)而單獨聚為一支，并且銀鯧Cart4與鯉形目(銀鯽Carassiusgibelio)、鮭形目(虹鱒)、鳉形目(青鳉Oryziasmelastigma)進化關(guān)系較遠，但與同為鱸形目的劍魚聚在一個分支上，親緣關(guān)系最近。

圖5 銀鯧 cart4 基因的核酸和氨基酸序列

圖6 I-TASSER分析Cart4的3D結(jié)構(gòu)

圖7 基于銀鯧和其他物種Cart4氨基酸序列的序列比對

圖8 銀鯧和其他物種Cart4序列的系統(tǒng)進化樹

2.3 銀鯧cck基因的組織表達模式及攝食水母對其表達規(guī)律的影響

cck基因在不同組織的表達模式及攝食水母對其表達規(guī)律的影響見圖9。cck基因在中腸、腦、鰓、肝臟、性腺、腎臟和肌肉中均有表達，對照組在中腸表達量最高(P<0.05)，而試驗組在腦中表達量最高(P<0.05)。其中無論是否攝食水母，cck在中腸、腦、鰓和肌肉中表達量均較高(P<0.05)。試驗組與對照組相比，cck在腦、肝臟和腎臟中的表達量極顯著增加(P<0.01)，在肌肉中的表達量略有增加，但差異不顯著(P>0.05)，而在中腸、鰓和性腺中的表達量極顯著下降(P<0.01)。

圖9 攝食水母對銀鯧cck基因不同組織中相對表達量的影響

2.4 銀鯧cart4基因的組織表達模式及攝食水母對其表達規(guī)律的影響

如圖10所示，cart4基因在中腸、腦、鰓、肝臟、性腺、腎臟和肌肉中均有表達，且攝食或未攝食水母的銀鯧cart4基因在腦中表達量均為最高(P<0.05)。其中，對照組cart4在中腸、腦、肝臟和肌肉中表達量均較高(P<0.05)。試驗組與對照組相比，在腦中的表達量極顯著增加(P<0.01)，而在性腺中顯著下降(P<0.05)，在中腸、鰓、肝臟和肌肉中極顯著下降(P<0.01)。

圖10 攝食水母對銀鯧cart4基因不同組織中相對表達量的影響

3 討論

3.1 銀鯧cck基因的生物信息學(xué)分析

銀鯧cck基因的氨基酸序列包含一個信號肽和一個典型的Cck家族的特征序列八肽。在八肽中，第116位氨基酸殘基酪氨酸發(fā)現(xiàn)硫化修飾，該結(jié)果與異齒裂腹魚(Schizothoraxo′connori)[23]、齊口裂腹魚(Schizothoraxprenanti)[24]和草魚(Ctenopharyngodonidella)[25]等其他魚類中的研究結(jié)果相同。推測其是激活cck基因受體與之結(jié)合的活性位點。Cck蛋白序列中段在種間差異較大，但N端和C端序列的差異較小，且八肽在整個生物進化過程中極度保守，推測其在不同物種中行使著相似的功能。將銀鯧Cck與其他物種Cck進行同源比較，發(fā)現(xiàn)銀鯧Cck與大口黑鱸的Cck相似度最高為87.59%，與其他魚類同源性均高于67.88%，表明cck基因在整個魚類進化過程中均較為保守。

3.2 銀鯧cart4基因的生物信息學(xué)分析

銀鯧cart4基因的氨基酸序列包含一個信號肽和一個名為CART的結(jié)構(gòu)域。其是一種厭食肽，含有3個二硫橋的C端部分是影響銀鯧對食物攝取活動調(diào)節(jié)物質(zhì)分子的生物活性部分。該結(jié)果與齊口裂腹魚[26]、南方鲇(Silurusmeridionalis)[27]等其他魚類的研究結(jié)果相似，Cart4蛋白序列中段種間差異較大，但N端和C端序列的差異較小，且cart4基因的結(jié)構(gòu)域在整個生物進化過程中均較為保守，推測其在不同物種中行使著相似的功能。并且將銀鯧Cart4與其他物種編碼氨基酸進行同源比較發(fā)現(xiàn)，不同物種Cart4存在差異，如銀鯧Cart4與劍魚Cart4同源性最高達91.82%，與其他魚類同源也均高于63.06%，表明cart4基因在整個魚類進化過程中較為保守。

3.3 銀鯧cck的組織表達模式及攝食水母對其表達規(guī)律的影響

Cck表達的蛋白質(zhì)是以多種大分子形式存在于小腸黏膜、腦和周圍神經(jīng)組織中[28-29], 多為可以使膽囊收縮的腦-腸肽物質(zhì)[30]。Cck具有廣泛的生物活性, 主要包括調(diào)節(jié)攝食[31]、促進胰腺分泌[32]、促進膽囊收縮[33]、調(diào)節(jié)胃腸道運動[34]等多種功能，其中調(diào)節(jié)攝食的功能主要表現(xiàn)為降低攝食量、減短攝食時間以及增加飽感。GIBBS等[35]證實了Cck內(nèi)分泌因子的產(chǎn)生和飽足感的產(chǎn)生對攝食的影響是一致的，即均是由內(nèi)源性Cck的生理學(xué)作用引起的。由于Cck是一種腦-腸肽物質(zhì)，所以一般在腦和腸中表達量較高[36]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，銀鯧cck基因在中腸和腦中表達量較高，也進一步印證了上述的研究報道，此外在草魚[25]、虹鱒[13]、大西洋鮭[15]等魚類中也得出了相似的研究結(jié)果。Cck是一種餐后飽感信號因子[37]。YUAN等[24]在齊口裂腹魚中觀察到下丘腦和前腸中cck基因的表達量在餐后3 h都顯著升高。在金魚中，腦中cck基因的表達量同樣在餐后2 h有明顯的升高, 并有持續(xù)升高的趨勢。本研究在攝食后取樣，試驗組腦部cck基因的表達量極顯著高于對照組，可以推測攝食水母可以使銀鯧產(chǎn)生更強的飽腹感。已有的研究表明，cck的表達量受腸管內(nèi)容物的調(diào)節(jié)，當(dāng)腸管充滿時，cck的表達量較低，而在排空時cck的表達量較高[10]。本研究發(fā)現(xiàn)，試驗組腸道cck基因的表達量極顯著低于對照組，由此可以推測銀鯧在攝食水母后，由于水母中較高的水分含量，導(dǎo)致腸管充塞度較高，這可能是銀鯧攝食水母后腸道cck基因明顯下調(diào)的原因之一。

3.4 銀鯧cart4的組織表達及攝食水母對其表達規(guī)律的影響

在哺乳動物中發(fā)現(xiàn)Cart主要在腦內(nèi)與動物自發(fā)活動和激發(fā)性興奮相關(guān)的區(qū)域[22]以及在腸道系統(tǒng)和迷走神經(jīng)系統(tǒng)中表達[38]。其中Cart在下丘腦中廣泛表達，在弓狀核、室旁核、下丘腦背內(nèi)側(cè)核和下丘腦外側(cè)核密集表達[39-41]。弓狀核到下丘腦外側(cè)核和室旁核的通路可能介導(dǎo)飽足信息。另一種可能是直接從弓狀核延伸到伏隔核殼部，或間接通過下丘腦外側(cè)核-室旁核[42]的通路，并在伏隔核殼部中觸發(fā)獎賞體驗。下丘腦神經(jīng)元組內(nèi)的Cart回路處理能量穩(wěn)態(tài)[43]，而與伏隔核殼部的連接可能介導(dǎo)了食物獎賞反應(yīng)[44]。cart基因除了調(diào)節(jié)飽腹感和獎勵機制[45]，還在抑制動物攝食量的同時影響動物的攝食行為[22]。在異齒裂腹魚的研究中發(fā)現(xiàn)，攝食后cart基因在腦組織的相對表達量下降，且隨著攝食后時間逐漸延長其表達量持續(xù)降低，說明cart基因并不是異齒裂腹魚的飽感信號因子[26]，但在本研究中，試驗組cart基因在不同組織的表達量均極顯著高于對照組，而袁登越[38]對齊口裂腹魚的研究中發(fā)現(xiàn)，餐后組下丘腦cart基因的表達量顯著高于餐前組，同樣在斑點叉尾鮰(Ictaluruspunetaus)的研究中也發(fā)現(xiàn)，其腦組織cart基因的表達量在餐后1.5 h顯著升高[46]，所以推測Cart4是銀鯧的飽感信號因子。但由于腦部又分為弓狀核、室旁核、下丘腦背內(nèi)側(cè)核、下丘腦外側(cè)核和伏隔核殼部，其中弓狀核-室旁核和下丘腦背內(nèi)側(cè)核-下丘腦外側(cè)核屬于兩個獨立的回路，即飽腹感和獎勵機制。而本實驗使用的是整個腦部組織，所以無法準(zhǔn)確判斷試驗組腦部cart基因表達量的增加是由于弓狀核-室旁核和下丘腦背內(nèi)側(cè)核-下丘腦外側(cè)核回路共同增加還是其中一個回路的增加高于另一回路的降低。有研究表明，下丘腦背內(nèi)側(cè)核和下丘腦外側(cè)核中的Cart可能參與了促食欲效應(yīng)的激活[47]，結(jié)合cck基因腦部的表達量，可以推測實驗組銀鯧腦部弓狀核-室旁核回路cart4基因表達量是高于對照組的。假設(shè)下丘腦背內(nèi)側(cè)核和下丘腦外側(cè)核回路是正向反饋作用，則可以說明攝食水母可以使銀鯧得到更大的滿足感。有研究表明，魚類下丘腦cart基因的表達量與食物攝入量的增加呈反比[48]，在本實驗中試驗組腦部cart基因的表達量極顯著高于對照組，結(jié)合腦部和腸道cck基因的表達規(guī)律，可以推測銀鯧攝食較少量的水母就能獲得更好的飽腹感。