植物精油的抑菌機理及對細菌群體感應(yīng)系統(tǒng)的研究進展

◆作者：聶振昌 陶正國 陸豫 邱聲祥 余勃 趙麗云

◆單位：廣州立達爾生物科技有限公司

植物精油是從天然植物中萃取出來的一種芳香性的物質(zhì)，是植物的次生代謝產(chǎn)物，具有不溶于水，易溶于極性少的有機溶劑，分子量小，穩(wěn)定性差，揮發(fā)性強，并具有一定的生物活性等特點。植物精油在香料產(chǎn)業(yè)、醫(yī)療應(yīng)用、農(nóng)業(yè)病害防治等方面都有廣泛的研究與應(yīng)用。最近幾年抗生素在畜牧業(yè)被管理得越來越嚴格，植物精油作為一類功能性的添加劑被研究得越來越多，尤其在抑菌、抗氧化、抗炎、維護動物腸道健康等方面研究。而在抑菌性的機理研究上，大多數(shù)停留在如何控制細菌繁殖的機理研究，普遍認為植物精油通過破壞細菌細胞膜的結(jié)構(gòu)完整性，從而增加細胞膜的通透性，使細胞內(nèi)的物質(zhì)流失，最終導(dǎo)致細胞萎縮或者破裂而死亡，或者通過與細胞內(nèi)的蛋白質(zhì)、核酸等大分子物質(zhì)結(jié)合，從而使其喪失功能而導(dǎo)致細胞死亡。

群體感應(yīng)是在不同細菌間或者細菌與宿主之間，細菌為爭奪有限的資源，通過破壞一種依賴于群體感應(yīng)的細菌可以使另一種細菌獲得生存優(yōu)勢；如果能夠破壞細菌之間的交流，對于防治依賴于群體感應(yīng)調(diào)節(jié)其致病性的細菌是十分有效的，對于這樣的機制稱為群體淬滅，作為一種新型的抑制病害的方式，不是通過殺菌來抑制病原菌，而是通過抑制細菌的致病因子來削弱其致病力（劉鵬等，2007）。因此，對細菌的群體感應(yīng)系統(tǒng)及其抑制機制的研究越來越受到人們的重視，本文從植物精油的常見抑菌機理研究、細菌的群體感應(yīng)的介紹及植物精油干擾群體感應(yīng)系統(tǒng)的機理3方面進行回顧與闡述總結(jié)。

1 植物精油抑菌效果及機理

植物精油具有綠色天然、無藥物殘留、無抗藥性等特點，抗生素在畜牧業(yè)上的應(yīng)用受到越來越多的限制，植物精油在抑菌抗菌上的作用受到人們越來越多的重視，從而掀起了利用植物精油代替抗生素的研究與應(yīng)用熱潮。根據(jù)相關(guān)的研究，植物精油確實具有不俗的抑菌及替抗效果。如吳克剛等（2017）對8種植物精油對腸道常見微生物體外抑菌效果做了相關(guān)研究，發(fā)現(xiàn)植物精油對7種腸道微生物均有一定程度的抑菌作用，最低抑菌濃度基本在125～3000μL/L，其綜合抑殺菌能力最好的是醛類的肉桂油和酚類的牛至油，最低抑菌濃度在125～500μL/L。魏磊等（2016）研究發(fā)現(xiàn)在質(zhì)量濃度0.391～25.000 mg/mL時，12種市售植物精油（羅勒油、大蒜油、山蒼子油、藍桉油、安息香油、檸檬草油、丁香油、百里香油、牛至油、肉桂醛、香芹酚和百里香酚）對3種雞源常見致病菌（大腸桿菌、雞白痢沙門氏菌和金黃色葡萄球菌）具有不同程度的抑制作用。汪中興等（2014）也研究了3種飼用精油（肉桂油、牛至油和百里香油）及其主要成分對豬源致病菌大腸桿菌K88和沙門菌A72的抑菌作用，其中肉桂油及肉桂醛的最低抑菌濃度（MIC）最低，為400～800μL/L；百里香油及百里香酚的作用次之，MIC為1600μL/L；牛至油及香芹酚的作用最差，MIC為1 600～3200μL/L。而 徐 靜 等（2021）通過研究市售較多的肉桂醛、香芹酚、百里香酚、丁香酚、桉葉素對大腸桿菌的抑菌效果、得出肉桂醛、香芹酚，百里香酚抑菌效果最好，MIC均在0.64～1.28mg/mL。

對于植物精油的抑菌原理，Martin等（1988）研究表明，香葉醇可以通過降低磷脂細胞的活性，抑制微生物細胞膜的疏水性。羅曼等（2006）通過透射電鏡對黃曲霉細胞進行觀察，發(fā)現(xiàn)檸檬醛使線粒體DNA復(fù)制系統(tǒng)發(fā)生損傷，受檸檬醛損傷后的線粒體形態(tài)會發(fā)生畸變。張彬等（2015）對肉桂醛的抑菌機理研究發(fā)現(xiàn)，肉桂醛對大腸桿菌及金黃色葡萄球菌的MIC為0.25μL/L，而通過電鏡檢查發(fā)現(xiàn)大腸桿菌及金黃色葡萄球菌的菌體細胞大量坍陷，細胞膜表面不平整，隨著肉桂醛濃度的增大，菌體出現(xiàn)溶脹、扭曲、凹陷，形態(tài)遭到嚴重破壞，同時對菌液檢測發(fā)現(xiàn)了大量的蛋白質(zhì)及核酸物質(zhì)；而謝強等（2014）在研究香芹酚對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌細胞膜的影響中，同樣觀察到香芹酚對這些細菌細胞膜的完整性、通透性及細胞內(nèi)物質(zhì)相類似的影響。通過這些研究，說明肉桂醛與香芹酚等植物精油的醛酚類成分通過對菌體細胞膜產(chǎn)生了破壞性的影響，通過膜電位的檢測也發(fā)現(xiàn)肉桂醛減低了細胞膜電位，影響了菌體的代謝。以上研究系統(tǒng)地闡述了植物精油的抑菌機理，即可分別通過破壞細菌細胞形態(tài)，影響細胞膜完整性及通透性，使胞內(nèi)物質(zhì)流失，影響胞內(nèi)功能物質(zhì)如蛋白質(zhì)或核酸的功能發(fā)揮；同時減低膜電位，影響新陳代謝活性等，最終導(dǎo)致細菌死亡。

目前，植物精油對致病菌的抑菌作用及機制都有了相關(guān)的研究與探討，主要研究對細菌數(shù)量的抑制作用，而對細菌的致病或者毒性作用的機制研究不多，而細菌的群體感應(yīng)效應(yīng)反映了細菌與細菌間通過信息交流分泌對宿主有害的物質(zhì)來保護自己，從而發(fā)揮其對宿主的侵害，因此，研究植物精油對細菌的群體感應(yīng)的抑制作用，對補充植物精油對細菌致病機理具有深刻的意義。

2 細菌的群體感應(yīng)

所謂群體感應(yīng)（QS）就是一種細菌細胞與細胞間的通訊系統(tǒng)，當細菌種群密度達到一定閾值時，能夠向環(huán)境中釋放特定的信號分子，從而表現(xiàn)出單一細胞無法完成的一系列生理功能與行為，進而使細菌能更好地適應(yīng)生存環(huán)境，如毒素的分泌、生物發(fā)光、生物被膜的形成等（Turan NB等，2017）。20世紀70年代，Hasting等（1979）對費氏弧菌（Vibrio fischeri）和哈維氏弧菌（Vibrio harceyi）的發(fā)光機制進行研究，發(fā)現(xiàn)了細菌細胞間存在著細菌群體感應(yīng)，后來細菌群體感應(yīng)受到了科研工作者越來越多的關(guān)注，直到1994年，F(xiàn)uqua等根據(jù)費氏弧菌、哈維氏弧菌、銅綠假單胞菌（PA）等的密度依賴現(xiàn)象，正式將這種細菌間的通訊機制命名為QS，目前的研究已經(jīng)證明細菌的多種行為是受到群體感應(yīng)的調(diào)控，如細菌的運動性、生物膜的形成、毒力因子的分泌、生物發(fā)光、抗生素的產(chǎn)生等（Miller M B等，2008），之后的研究中也陸續(xù)發(fā)現(xiàn)群體感應(yīng)系統(tǒng)在各種細菌中是普遍存在的。隨著研究越來越深入，相關(guān)研究闡明了群體感應(yīng)過程包括信號分子的產(chǎn)生、信號分子在介質(zhì)中積累到閾值濃度、受體識別信號分子、根據(jù)信號-受體復(fù)合體的濃度進行一系列的基因表達這4個階段（Adonizio A L等，2006）。

3 信號分子

根據(jù)相關(guān)報道，發(fā)現(xiàn)信號分子具有較低的分子量，根據(jù)信號分子的種類和機制，將細菌群體感應(yīng)系統(tǒng)分為以下幾個類型：①自體誘導(dǎo)劑?；呓z氨酸內(nèi) 酯（Acyl-homoserine,AHLs），這種類型常見于革蘭氏陰性菌；②寡肽類（Autoinducing peptides,AIPs）類，常見于革蘭氏陽性菌；③呋喃硼酸二酯自身誘導(dǎo)物-2（Auto-inducer,AI-2）類，為革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌均有；④其它信號分子，如喹諾酮（PQS）、AI-3、羥基-棕櫚酸甲酯（PAME）等（LEE J等，2015）。至于細菌通過何種方式對這些信號分子進行調(diào)控，根據(jù)對相關(guān)模式菌如銅綠假單胞菌的研究發(fā)現(xiàn)，至少包含了3種群體感應(yīng)系統(tǒng)，分別為las、rhl、pqs系統(tǒng)，并呈現(xiàn)出級聯(lián)調(diào)控的特點。

4 群體感應(yīng)淬滅

隨著群體感應(yīng)作用效應(yīng)和信號分子作用機制的研究深入，人們設(shè)想通過群體淬滅入手，即通過破壞細菌之間的信息交流，從而控制細菌生物膜的形成與毒力因子的表達(劉鵬等，2007)。如Davies等（1998）研究發(fā)現(xiàn)沒有合成信號分子能力的銅綠假單胞菌形成的生物膜與母株所形成的生物膜相比，生物膜比較松散，而且對十二烷基鈉的抵抗性大大減低。因此群體感應(yīng)的抑制機制與群體感應(yīng)抑制劑（QSI）的研究具有很大的研究價值，并發(fā)現(xiàn)了一些自然或人工合成的物質(zhì)對細菌群體感應(yīng)具有抑制作用，其抑制的方式主要有降低轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)蛋白的活性、抑制信號分子的合成、降解信號分子等（齊枝花等，2005）。相關(guān)的研究發(fā)現(xiàn)，QSI輕微抑制或者不抑制細菌的生長繁殖，不會給細菌產(chǎn)生耐藥性提供有利的選擇壓力，因此，有望成為彌補傳統(tǒng)抗生素的一種新型抗菌藥物。

5 群體感應(yīng)抑制劑-植物精油

植物在微生物長期進化過程中，進化出一些抑制細菌群體感應(yīng)的機制，產(chǎn)生的QSI可以控制病原細菌，為激活自身免疫防御爭取時間（Zhang L H等，2003）。植物精油來自天然植物，具有綠色環(huán)保、安全無毒、廣泛的抗菌活性、分子量小以及高抗群體感應(yīng)等特性，因此植物精油具有成為一種天然理想的QSI的潛力（曾桃花等，2021）。

根據(jù)相關(guān)報道，植物精油抑制細菌群體感應(yīng)的方式主要有3種:①利用信號分子類似物，與信號分子競爭受體結(jié)合蛋白位點，使下游基因無法被激活；②利用信號分子合成底物類似物或者抑制信號分子合成酶活性，使信號分子合成酶無法或者錯誤的合成信號分子，從而抑制了群體感應(yīng)毒力因子；③降解信號分子。信號分子數(shù)量在閾值以下，就不會和轉(zhuǎn)錄受體蛋白結(jié)合，從而無法激活下游毒力因子表達（Ping C C,等，2007；王立燕等，2015；施宇等，2021）。

根據(jù)吳紅等（2003）報道，當細菌數(shù)達到107數(shù)量級時候，所產(chǎn)生的信號分子濃度就會達到閾值，大約在10nmol/L，這時候細菌間就產(chǎn)生群體感應(yīng)。因此，通過各種手段來降低信號分子的濃度，就可以實現(xiàn)對細菌群體效應(yīng)的抑制作用。有研究發(fā)現(xiàn)，葡萄柚精油的主要成分萜烯類化合物d-檸檬烯減少了信號分子AHL的產(chǎn)量，并抑制銅綠假單胞菌生物被膜的形成，減弱了彈性蛋白酶的活性（Luciardi M C等，2020）。而王一鳴等（2019）研究也發(fā)現(xiàn)，丁香酚在亞抑菌濃度1μg/mL可以使豬源肺炎克雷伯菌的LuxS基因和mrkD基因表達下調(diào)，pfs、IsrR、IsrK基因表達下調(diào)，從而達到抑制信號分子AI-2的合成以及其在胞內(nèi)轉(zhuǎn)運，抑制了肺炎克雷伯菌的黏附作用，雖然不影響細菌生長速度，但減弱了生物膜的形成與毒力的發(fā)揮。

細菌生物膜是細菌為了適應(yīng)外界惡劣環(huán)境，維持自身生命，為自身生長繁殖提供屏障而形成的一種生物保護膜，胞外多糖是這種生物膜基質(zhì)的重要組成成分，可以延緩抗生素的滲透，從而使病原體對抗菌藥物產(chǎn)生耐藥性（Yildiz F H等，2009）。因此，群體感應(yīng)抑制劑可以通過減少或者抑制這種膜的產(chǎn)生，這種方法不同于抑菌或者殺菌，而是通過抑制目標菌生物膜的形成，因此不容易產(chǎn)生抗性菌株。而QSI就是在不影響細菌生長的情況下，通過抑制細菌的群體感應(yīng)機制而達到降低細菌的毒力作用（周麗曼，2013）。如綦國紅等（2017）研究發(fā)現(xiàn)肉桂醛在非抑菌濃度40μg/mL也可以抑制紫色桿菌CV026產(chǎn)生紫色素的能力，抑制率達到31.53%，同時也抑制了熒光假單胞菌生物膜的形成，使生物膜結(jié)構(gòu)松散，明顯減低了細胞密度與團塊，對生物膜的抑制率也達到了44.22%，有效地降低了細菌對外界惡劣環(huán)境的應(yīng)變能力。靳盼盼（2019）研究也發(fā)現(xiàn)，在不影響細菌生長的條件下，1/4MIC的香芹酚和百里香酚均能顯著減低腸道及原料肉腐敗菌陰溝腸桿菌和糞腸球菌生物膜胞外多糖含量，抑制細菌的泳動能力，降低了生物膜厚度，導(dǎo)致其結(jié)構(gòu)松散。如施宇等（2021）對迷迭香精油紫色桿菌群體感應(yīng)抑制試驗中，在10‰的迷迭香在不影響細菌生長的情況下，使紫色桿菌的紫色桿菌素含量減少了85%，對生物膜的抑制率達到44%,對已經(jīng)形成生物膜的清除率接近60%，明顯降低了信號分子（AHLs）的含量，推斷迷迭香精油可能通過抑制信號分子合成酶活性，雖然需要進一步驗證，但總體效果表明了迷迭香精油在亞抑菌濃度下對紫色桿菌的群體感應(yīng)系統(tǒng)所調(diào)控的致病因子產(chǎn)生了抑制作用。

6 展望

近年來對QS及QSI機制的研究越來越受到科研工作者的關(guān)注，希望能找到合適的細菌QSI，根據(jù)目前研究來看，已經(jīng)有相當一部分植物性物質(zhì)可作為QSI，植物精油作為植物的次級代謝產(chǎn)物，其成分天然、安全可靠，在畜牧業(yè)當前替抗的背景下，更加讓人們認識到植物精油對有害細菌的作用不僅僅停留在抑菌殺菌層面上，還是在不影響致病菌的生長繁殖下，通過對細菌生物膜與毒素的產(chǎn)生等致病因素的抑制作用，也能夠減低或者解除細菌的有害作用，使細菌群體感應(yīng)系統(tǒng)成為防治細菌病害的新標靶，這對植物精油抑制細菌對動物宿主的侵害理論的認識有了進一步更深層次的認識，作為植物精油抑菌理論的有力補充，對植物精油添加劑的替抗研究及應(yīng)用具有積極的促進作用。雖然植物精油具有成為理想群體感應(yīng)抑制劑的潛力，且多種精油都有不錯的群體感應(yīng)抑制活性，但抑制機制還不太清晰，因此探清植物精油的群體感應(yīng)作用機制，大批量篩選具有群體感應(yīng)抑制活性的植物活性化合物是亟待解決的問題。相信在不遠的將來，更多符合生產(chǎn)實際需求的天然、無毒、綠色的植物精油群體感應(yīng)抑制劑將會研究開發(fā)出來，在養(yǎng)殖生產(chǎn)中發(fā)揮重要的作用。