小麥種子健康度檢測研究及應(yīng)用

孫秀枝，張 麗，賈代成，孟 琳，羅漢民，陳鳳龍，公丕峰*

（1.淄博市張店區(qū)農(nóng)業(yè)技術(shù)服務(wù)中心，山東 淄博 255000；2.淄博市農(nóng)業(yè)農(nóng)村數(shù)字發(fā)展中心，山東 淄博 255000；3.淄博魯中農(nóng)作物研究所，山東 淄博 255000）

高質(zhì)量種子是農(nóng)業(yè)高產(chǎn)的基礎(chǔ)，高質(zhì)量種子應(yīng)兼有優(yōu)良的品種屬性和良好的播種品質(zhì)，其中播種品質(zhì)是指種子的凈度、水分、飽滿度、發(fā)芽率、活力及健康度等[1]。目前市場上的農(nóng)作物種子只對種子的凈度、水分、發(fā)芽率和純度4 項質(zhì)量指標(biāo)進(jìn)行了規(guī)定，并以此來判斷種子質(zhì)量的高低。隨著現(xiàn)代種業(yè)的發(fā)展，種子貿(mào)易日益頻繁，種子質(zhì)量評價的標(biāo)準(zhǔn)和內(nèi)容不再滿足于這4 項指標(biāo)，種子健康度指標(biāo)越來越受到重視，對種子健康度進(jìn)行檢驗與控制勢在必行[2]。

1 研究背景

1.1 國外研究概況

植物病害委員會（ISTA）是一個為國際種子健康檢驗制定通用標(biāo)準(zhǔn)方法的組織，其宗旨是確保健康的種子可以在全球范圍內(nèi)無障礙流通。目前，ISTA 共出版了64 本種傳病害檢驗工作手冊，其中14 種方法被納入ISTA 規(guī)則中。

1917 年，Hiltner 觀察到禾谷類種子，特別是燕麥種子的田間出苗率與實驗室中測得的發(fā)芽率相差甚遠(yuǎn)，把這種現(xiàn)象歸因于感染了Fusarium ni-vale 的種子生長力太弱，只能在適宜的實驗室條件下發(fā)芽，而不能在田間出苗。

1928年，ISTA制定了第一部世界種子檢驗規(guī)程。種子檢疫部分詳細(xì)介紹了禾谷類作物中的Clavicep-spurpurea、Fusarium、Tilletia 和Ustilagohordei，豌豆中Ascochyta，菜豆中Colletotrichumlindemuthianum，亞麻中Botrytis、Colletotrichum linlcola 和Aureobasidumlini的檢驗。

1931 年，在ISTA 第六次代表大會上，ISTA 首任負(fù)責(zé)人L.C.Doyer 博士提出了“在國際種子檢驗規(guī)程中增加種子健康檢驗”的建議。隨后，1938 年，L.C.Doyer博士主編了《種傳病害檢驗手冊》，第一次提出了檢驗和確認(rèn)種傳真菌、細(xì)菌、線蟲和昆蟲重復(fù)性較高的方法。

1993 年，ISTA 第一屆座談會在加拿大渥太華召開，主題是“種子健康檢驗中的質(zhì)量保證”。第二屆座談會于1996 年在英國劍橋召開，主題是“種子健康檢驗——面向21 世紀(jì)的工程”，第三屆于1999 年在美國依阿華召開，主題是“病害脅迫與其在種子健康檢驗中的作用”。

種子健康檢驗的組織與技術(shù)體系歷經(jīng)一個多世紀(jì)的發(fā)展，已成為世界種子貿(mào)易中質(zhì)量控制的重要組成部分。

1.2 國內(nèi)研究概況

我國對農(nóng)作物種子健康度研究也經(jīng)歷了一個漫長的過程。1981 年，原農(nóng)業(yè)部舉辦種子病理檢疫講習(xí)班，邀請Paul Neergard 來華講學(xué)。1990 年，中國農(nóng)業(yè)大學(xué)等高校設(shè)立本科生和研究生《種子病理學(xué)》課程。1993 年，中國農(nóng)業(yè)大學(xué)設(shè)立種子科學(xué)系。1998 年12 月，在北京召開全國第一屆種子病理學(xué)術(shù)研討會，并成立中國植物病理學(xué)會（CSPP）種子病理學(xué)專業(yè)委員會（SPC），培訓(xùn)內(nèi)容為“種子苗木病害的控制與種子預(yù)防保健”。1999 年7 月，印度V.G.Agarwal 來中國進(jìn)行學(xué)術(shù)交流，對“小麥散黑粉病的整胚檢驗法”進(jìn)行探討。2001 年8 月，在昆明召開全國第二屆種子病理學(xué)術(shù)研討會，主題為“健康的種子 健康的生活”。2006 年8 月，在長沙召開全國第三屆種子病理學(xué)術(shù)研討會。1995 年國家技術(shù)監(jiān)督局發(fā)布的《農(nóng)作物種子檢驗規(guī)程》（GB/T 3543.1—1995）中“其他項目檢驗”對種子健康度檢驗進(jìn)行了簡單概述，但可操作性不強(qiáng)。

2 研究意義及目標(biāo)

種子健康度檢測不僅為種子生產(chǎn)、調(diào)運提供切實可行的參考依據(jù)，還可指導(dǎo)農(nóng)民科學(xué)用種，運用科學(xué)生態(tài)的病害防治方法全面提高種子質(zhì)量，防止和控制種傳病害[3]。

2.1 意義

2.1.1 種子貿(mào)易發(fā)展的必然要求

隨著種子貿(mào)易國際化進(jìn)程加快，種業(yè)市場競爭日益激烈，質(zhì)量問題成為種子貿(mào)易的關(guān)鍵，常規(guī)的水分、凈度、純度和發(fā)芽率檢驗已不能滿足種子貿(mào)易的需求，對種子健康度檢測是非常有必要的。

2.1.2 為解決種子質(zhì)量糾紛提供科學(xué)依據(jù)

近年來，因種子帶菌引起的種子質(zhì)量糾紛時有發(fā)生，特別是播種后苗期缺苗斷壟現(xiàn)象，以及后期病害流行成災(zāi)，造成這些現(xiàn)象的主要原因是發(fā)芽率和種子病原問題，嚴(yán)重影響了農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和社會穩(wěn)定。健康度檢測能為解決種子糾紛提供科學(xué)依據(jù)，保護(hù)消費者的合法權(quán)益。

2.1.3 防止種傳病害的需要

種傳病害對農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的危害表現(xiàn)在以下方面。一是種子攜帶的病原體可以在植株從發(fā)芽到收獲的任意階段引起田間病害，降低作物的商品價值。二是種傳病害可引起幼苗價值降低，引起發(fā)芽或田間出苗不良，產(chǎn)生不正常幼苗。三是病原可隨種子批流轉(zhuǎn)，種子帶菌是遠(yuǎn)距離傳播病害的重要途徑。通過檢測種子所攜帶病蟲害種類及數(shù)量可以發(fā)現(xiàn)檢疫性傳染病害，確定種子批的使用價值，評定種子批是否需要經(jīng)過種子處理，以及處理前后對發(fā)芽率的影響，提高種子質(zhì)量[4]。

2.2 目標(biāo)

2.2.1 跟蹤評價全市小麥種子健康狀況

通過研究，對淄博市不同區(qū)、縣的小麥種子生產(chǎn)基地種子帶菌情況進(jìn)行跟蹤評價，指導(dǎo)種子企業(yè)合理布局種子生產(chǎn)基地，科學(xué)處理帶菌種子，有效阻止帶病、帶菌種子的傳播。

2.2.2 研究制定小麥種子健康度檢測技術(shù)操作規(guī)范

開展種子健康度檢測，規(guī)范種子健康度檢測方法，制定淄博市《小麥種子健康度檢測技術(shù)操作規(guī)范》，雖然《農(nóng)作物種子檢驗規(guī)程》（GB/T 3543.1—1995）的“其他項目檢驗”對種子健康度檢驗進(jìn)行了簡單概述，但在實際操作中多數(shù)檢測僅限于有害動物檢測，對病原菌體檢測較少。此項檢測方法將是對《農(nóng)作物種子檢驗規(guī)程》中“其他項目檢驗”的有力補(bǔ)充。

2.2.3 研究制訂小麥病害高效防治措施

淄博市是重要的工業(yè)城市，環(huán)境污染問題突出。近年來，農(nóng)藥引起的環(huán)境污染問題也日益顯現(xiàn)，通過配制應(yīng)用高效種衣劑，實現(xiàn)從源頭上防治種源病害，減少農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中農(nóng)藥的使用量，降低環(huán)境污染。

3 試驗過程及分析

3.1 抽取試驗材料

2013 年10 月從淄博市5 家種子企業(yè)10 個生產(chǎn)基地收集未經(jīng)篩選的小麥種子樣品17 個，2014 年9月從淄博市5 家種子企業(yè)10 個生產(chǎn)基地收集經(jīng)過篩選的小麥種子樣品18 個。試驗培養(yǎng)對象為作物種子表面附帶的真菌及內(nèi)部寄藏的真菌。小麥種子外觀完整，沒有種皮破損的不完整粒。樣品符合取樣要求，并具有代表性。

3.2 制備PDA 培養(yǎng)基

先將馬鈴薯洗凈去皮，稱取100 g 馬鈴薯切成1 cm3的小塊，加水約500 mL，煮沸30 min，稱取葡萄糖10 g 放置在500 mL 燒杯中，用4 層紗布將馬鈴薯液過濾至廣口瓶中，稱取瓊脂15～20 g 放至500 mL 三角瓶中，將溶有葡萄糖的馬鈴薯液倒入三角瓶中，搖勻，再補(bǔ)足水分至500 mL，加塞、封口。高壓、121 ℃滅菌30 min 后取出，放置于超凈工作臺冷卻。將滅菌冷卻后的培養(yǎng)基倒入無菌的培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)基層厚度以3～5 mm 為宜，待冷卻凝固后備用。

3.3 菌種分離培養(yǎng)及形態(tài)學(xué)觀察

3.3.1 菌種分離純化

在超凈工作臺上對未經(jīng)篩選的17 份小麥種子樣品和經(jīng)過篩選的18 份小麥種子樣品，分別用0.1%升汞進(jìn)行表面消毒10 min，再用無菌水進(jìn)行洗滌（設(shè)6 個小燒杯，倒入無菌水，將消毒處理的小麥種子進(jìn)行稀釋洗滌，小麥種子在燒杯中滯留時間約10 s），用無菌濾紙吸干種子沾附的水分。將表面消毒處理后的小麥種子種胚處切去種皮，接種到培養(yǎng)基。每份樣品設(shè)置8 個重復(fù)，每個重復(fù)100 粒。將接種好的培養(yǎng)基放置在20℃、黑暗條件下的培養(yǎng)箱內(nèi)，培養(yǎng)7 d。

3.3.2 菌種形態(tài)學(xué)觀察

采用組織分離法，對17 份未經(jīng)篩選的小麥種子樣品進(jìn)行菌種的分離、純化，獲得3 種純化的菌種；對經(jīng)過篩選的18 份小麥種子樣品進(jìn)行菌種的分離、純化，獲得兩種純化的菌種。在28 ℃PDA 培養(yǎng)基條件下，用生物顯微鏡進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察。利用形態(tài)特征分析法，對菌落特征特性進(jìn)行觀察，與典型菌落特征進(jìn)行比較，確定菌種類型為黃曲霉、黑粉菌和鐮刀菌。

3.4 小麥種子帶菌率測定

對收集的未經(jīng)篩選的17 份小麥種子樣品和經(jīng)過篩選的18 份小麥種子樣品，在無菌濾紙上進(jìn)行培養(yǎng)，每個樣品設(shè)置4 個重復(fù)，每個重復(fù)100 粒，觀察篩選加工對小麥種子帶菌率的影響。

觀察發(fā)現(xiàn)，未經(jīng)過篩選的小麥種子帶菌率遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于經(jīng)過篩選的小麥種子帶菌率。

3.5 菌種致病性測定

3.5.1 室內(nèi)發(fā)芽試驗

將直徑0.6 cm 的菌餅置于28 ℃避光條件下，在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)2 d。用2 塊直徑0.6 cm 不同菌種的菌餅分別與5 mL、10 mL、15 mL 和20 mL 無菌水配制不同接種量的菌液，分別用10 mL 不同接種量的菌絲懸浮液處理山農(nóng)15 小麥種子5 min，然后將處理過的小麥種子放置于紙床上，在20 ℃的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)7 d。設(shè)置一個空白對照處理，每個處理3 個重復(fù)，每個重復(fù)100 粒，從第四天開始，每天定時測定不同處理小麥種子的發(fā)病率。

1）黃曲霉處理。通過對不同濃度黃曲霉菌液處理下山農(nóng)15 小麥種子發(fā)芽率的差異分析發(fā)現(xiàn)，用不同濃度黃曲霉菌液處理種子5 min 后，處理間的發(fā)芽率無顯著差異。

2）鐮刀菌處理。通過對不同濃度鐮刀菌菌液處理下山農(nóng)15 小麥種子發(fā)芽率的差異分析發(fā)現(xiàn)，用不同濃度鐮刀菌菌液處理種子5 min 后，2 菌餅/5 mL 處理和2 菌餅/10 mL 處理與空白對照間的發(fā)芽率存在顯著差異。

3）黑粉菌處理。通過對不同濃度黑粉菌菌液處理下山農(nóng)15 小麥種子發(fā)芽率的差異分析發(fā)現(xiàn)，用不同濃度黑粉菌菌液處理種子5 min 后，用2 菌餅/5 mL 濃度菌液處理過的種子，發(fā)病情況較其他處理無顯著差異，但幼苗長勢較弱，與對照相比存在差異。

3.5.2 田間試驗

將直徑0.6 cm 的菌餅置于28 ℃避光條件下，在PDA 培養(yǎng)基上培養(yǎng)2 d。用2 塊直徑0.6 cm 的不同菌種的菌餅分別與5 mL、10 mL、15 mL 和20 mL 無菌水配制不同接種量的菌液，分別用10 mL 不同接種量的菌絲懸浮液處理山農(nóng)15 小麥種子5 min，然后將處理過的小麥種子種植在魯中農(nóng)作物研究所試驗田，設(shè)置1 個空白對照處理，每個處理3 個重復(fù)，每個重復(fù)用種量30 g，觀察不同菌種處理后田間發(fā)病情況。田間種植觀察中可以發(fā)現(xiàn)，接種濃度2 菌餅/5 mL 的不同菌種菌液，鐮刀菌的致病效果明顯，黑粉菌次之，黃曲霉與對照相比無差異。

3.5.3 確定致病性

在小麥生長期間，觀察幼苗、秸稈及穗部發(fā)病情況。對上述室內(nèi)發(fā)芽試驗中出現(xiàn)的爛芽和田間的小麥病株進(jìn)行采集取樣，并對發(fā)病部位進(jìn)行菌種分離純化，根據(jù)柯赫氏法則確定獲得菌種是否具有致病性。

幼苗病癥特點：1）接種黃曲霉。室內(nèi)幼苗發(fā)芽率與對照相比，無明顯差異，幼苗正常。2）接種鐮刀菌。用2 菌餅/5 mL 濃度菌液處理過的種子，幼苗染病，輕者能發(fā)芽，但生長細(xì)弱，嚴(yán)重的不能發(fā)芽；幼苗染病后在芽鞘上產(chǎn)生黃褐色斑，邊緣清晰，中間稍褪色。3）接種黑粉菌。用2 菌餅/5 mL 濃度菌液處理過的種子，發(fā)病情況較其他處理無顯著差異，但幼苗長勢較弱，不正常幼苗與對照相比存在差異。

病株病癥特點：1）小麥根部出現(xiàn)深褐色病斑，根部組織呈絮狀纖維。2）麥穗中上部出現(xiàn)黑色病癥。3）秸稈中下部出現(xiàn)同心圓環(huán)狀褐色病斑。

對發(fā)病組織進(jìn)行分離純化后獲得兩種菌種，利用形態(tài)特征分析法確定兩種菌種類型分別為黑粉菌和鐮刀菌。根據(jù)柯赫氏法則確定鐮刀菌和黑粉菌為小麥種子攜帶的致病菌，并分別引起了小麥莖基腐病和黑粉病。

4 取得的主要成果

4.1 確定了淄博市小麥種子基地帶菌情況分布

通過對淄博市小麥種子生產(chǎn)基地生產(chǎn)的小麥種子健康度檢測，小麥種子帶菌率超過30%的樣品產(chǎn)地主要集中在高青縣，未經(jīng)篩選加工的小麥種子帶菌率遠(yuǎn)高于經(jīng)篩選加工的小麥種子。

4.2 鑒定致病菌兩種

采用組織分離法，對未經(jīng)篩選的小麥種子樣品進(jìn)行菌種分離、純化，獲得3 種純化的菌種，分別是黃曲霉、黑粉菌和鐮刀菌；對經(jīng)過篩選的小麥種子樣品進(jìn)行菌種分離、純化，獲得兩種純化的菌種，分別是黑粉菌和鐮刀菌。根據(jù)柯赫氏法則要求，進(jìn)行3 種病原菌的致病性測定，最終確定黑粉菌和鐮刀菌為小麥種子攜帶的致病菌，分別引起小麥黑粉病和莖基腐病。

4.3 制定小麥種子健康度檢測技術(shù)操作規(guī)范

通過對病原菌的分離、純化，病原菌鑒定，致病性檢測等技術(shù)研究及結(jié)果分析，制定了淄博市小麥種子健康度檢測技術(shù)操作規(guī)范，為今后淄博市小麥種子健康度檢測提供了技術(shù)支撐。

4.4 研究配制3 種高效小麥種衣劑

通過室內(nèi)生物活性測定和田間試驗，對8 種殺菌劑進(jìn)行防治效果比對，最終篩選出3 種對小麥莖基腐病和黑粉病具有較好防治效果的種衣劑，分別是5%苯甲·戊唑醇種子處理懸浮劑、2%戊唑醇懸浮種衣劑、30 g/L 苯醚甲環(huán)唑懸浮種衣劑。

4.5 開展小麥種衣劑推廣應(yīng)用

將3 種高效小麥種衣劑在桓臺縣、臨淄區(qū)和高青縣通過種子企業(yè)進(jìn)行推廣應(yīng)用，3 年累計推廣面積達(dá)18.6 萬hm2。