濃縮生長因子在美學(xué)區(qū)種植的應(yīng)用及機制研究進展

孫吉宇，張曦丹，朱卓立，陳晨峰，楊 陽，甘雪琦

前牙美學(xué)區(qū)通常面臨著較高的缺牙風(fēng)險，且由于上頜唇側(cè)骨板存在生理性凹陷、表面軟組織菲薄，種植后發(fā)生軟組織退縮的風(fēng)險較高，如何在前牙區(qū)獲得穩(wěn)定的美學(xué)效果成為當(dāng)前口腔種植領(lǐng)域關(guān)注的焦點[1]。缺牙區(qū)軟硬組織量不足是種植修復(fù)美學(xué)效果欠佳的主要原因，聯(lián)合使用多種軟硬組織增量技術(shù)可顯著改善美學(xué)預(yù)后。其中，血小板濃縮物作為新型生物材料，已有大量研究證明其具有促進組織再生、減輕術(shù)后反應(yīng)、抑制術(shù)區(qū)炎癥的作用。濃縮生長因子(concentrated growth factor，CGF)是第三代血小板濃縮物，表現(xiàn)出強大的促進軟硬組織修復(fù)和再生的能力，其在美學(xué)區(qū)種植中的應(yīng)用價值越來越引起人們的關(guān)注。本文就濃縮生長因子在口腔軟硬組織再生中作用機制的研究進展，及其在前牙美學(xué)區(qū)種植修復(fù)中的應(yīng)用現(xiàn)狀綜述如下。

1 CGF的制取與使用

血小板濃縮物因其富含多種生長因子，在組織再生領(lǐng)域一直廣受關(guān)注。1998年首次有學(xué)者提出將第一代自體富血小板血漿(platelet-rich plasma，PRP)用于口腔骨缺損的修復(fù)，并發(fā)現(xiàn)聯(lián)合使用PRP和骨移植材料可以顯著提升成骨質(zhì)量[2]。但PRP制備過程復(fù)雜、需添加牛凝血酶和氯化鈣等生化制劑，其臨床應(yīng)用受到限制，因此開發(fā)了第二代富血小板纖維蛋白(platelet-rich fibrin，PRF)，避免了抗凝劑的使用，并進一步提高了血小板含量。

2006年Sacco首次通過特殊離心機處理靜脈血獲得CGF，即最新一代的血小板濃縮物[3]。使用硅涂層的無菌離心管收集適量自體靜脈血(約10 mL)后，按照特定程序?qū)㈦x心管放置于Medifugetm離心機中進行分層處理，離心后血液從上至下依次為無細(xì)胞血漿層、纖維蛋白層和紅細(xì)胞層。其中CGF主要富集于纖維蛋白層及中下層的交界面上，因此臨床使用時一般需保留纖維蛋白層及其與下層的交界區(qū)域[4]。目前CGF在種植領(lǐng)域主要有四種使用形式：①CGF纖維蛋白膜，使用壓膜器將其壓制成纖維蛋白膜后作為生物屏障膜；②CGF纖維蛋白塊，整塊應(yīng)用于較大的植骨區(qū)域；③CGF顆粒，切割成1～2 mm的凝膠微粒后與骨替代材料混合使用；④CGF滲出液,擠壓纖維蛋白塊的滲出液可用于處理種植體表面。

2 CGF的生物學(xué)特性

Rodella和Stanca等使用掃描電鏡觀察發(fā)現(xiàn)CGF由致密多孔的纖維蛋白三維網(wǎng)絡(luò)構(gòu)成，表面蛋白纖維直徑為100～500 nm，與細(xì)胞外基質(zhì)的納米結(jié)構(gòu)類似。外表面纖維交錯融合并附著少量的血小板顆粒，而內(nèi)表面附著大量活化的血小板顆粒和細(xì)胞[5-6]。相比PRP、PRF，CGF的纖維結(jié)構(gòu)更清晰、孔隙結(jié)構(gòu)明顯、交聯(lián)密度高，CGF膜拉伸強度更大且更穩(wěn)定[7-8]。

由于致密網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的存在，CGF可作為多種細(xì)胞因子“儲藏庫”，包括血小板衍生生長因子(platelet-derived growth factor, PDGF)、轉(zhuǎn)化生長因子β(transforming growth factor-β, TGF-β)、血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)、成纖維細(xì)胞生長因子(fibroblast growth factor, FGF)、表皮生長因子(epidermal growth factor, EGF)、胰島素樣生長因子(insulin-like growth factor, IGF)、骨形態(tài)發(fā)生蛋白(bone morphogenetic protein, BMP)、白介素(interleukin，IL)-1β 和IL-6等[4]。Wang等發(fā)現(xiàn)CGF可連續(xù)8～10 d向周圍組織緩慢釋放生長因子，使局部微環(huán)境內(nèi)的生長因子始終維持在一定濃度，其中VEGF的含量高達(dá)PRP的1.5倍，持續(xù)促進周圍組織的修復(fù)和再生[9-10]。一項體外研究表示，CGF膜約在第14天發(fā)生完全降解，初始面積質(zhì)量比越小，降解速度越慢，提示根據(jù)手術(shù)需要可通過調(diào)整CGF使用形式來控制降解時間[11]。部分研究表明由于CGF存在作用時間短、吸收快的缺點，因此不提倡其單獨使用[12-13]。但體外實驗無法完全模擬體內(nèi)的復(fù)雜環(huán)境，仍需要進一步驗證及臨床觀察。同時三維網(wǎng)絡(luò)可作為天然的細(xì)胞支架供成骨細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞向內(nèi)遷移長入，引導(dǎo)組織再生和重建。

Rodella發(fā)現(xiàn)CGF中存在著一定量的CD34+細(xì)胞，已有大量研究提出CD34+細(xì)胞在血管的維護與再生、組織的新生與修復(fù)及免疫調(diào)節(jié)等方面都起到了不可或缺的作用[5]。此外，與PRP相比，CGF制備過程簡單且無需添加抗凝制劑，避免了交叉感染和免疫排斥的風(fēng)險。

3 CGF促進組織修復(fù)和再生的基礎(chǔ)研究

3.1 促進骨再生

美學(xué)并發(fā)癥是種植體植入后發(fā)生硬組織和(或)軟組織缺陷的表現(xiàn)。缺牙后拔牙窩周圍牙槽骨常表現(xiàn)為漸進性吸收，當(dāng)唇側(cè)骨壁厚度<1 mm時，缺牙8周后唇側(cè)骨壁垂直向的丟失量高達(dá)62%[14]。而一項研究發(fā)現(xiàn)90%的受試者上頜前牙區(qū)的唇側(cè)骨壁厚度<1 mm，50%厚度不足0.5 mm[15-16]。高度、寬度充足的牙槽嵴能夠支撐起表面覆蓋的軟組織，更有利于恢復(fù)植體周圍良好的牙齦外形[17]。因此種植治療中必須要考慮如何促進受損骨組織修復(fù)和再生。種植體周的骨組織修復(fù)是一個復(fù)雜的級聯(lián)反應(yīng)，包括骨傳導(dǎo)、骨形成和骨重塑三個階段，而血小板通過啟動凝血和局部釋放生長因子在上述過程中發(fā)揮著舉足輕重的作用[18]。已有大量研究發(fā)現(xiàn)使用CGF浸提液培養(yǎng)基對牙周膜干細(xì)胞、牙齦間充質(zhì)干細(xì)胞(gingival mesenchymal stem cells, GMSCs)、小鼠成骨細(xì)胞系(MC3T3-E1)、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞進行體外培養(yǎng)，細(xì)胞均表現(xiàn)出更強的成骨分化傾向和更高的礦化程度，且成骨相關(guān)基因(如Runx2、Alp、Opn)表達(dá)水平明顯增加[19-22]。

CGF中所含的生長因子，如PDGF、TGF-β、BMP-2和IGF，可能是誘導(dǎo)成骨細(xì)胞增殖、分化的關(guān)鍵因素。TGF-β1可以刺激成骨細(xì)胞趨化和有絲分裂，并指導(dǎo)合成Ⅰ型膠原纖維和纖維蛋白；IGF-1是調(diào)節(jié)骨細(xì)胞功能和代謝的生長因子。目前關(guān)于CGF促進成骨分化的機制研究較少，但Dong等[23]發(fā)現(xiàn)抑制PI3K可顯著減弱CGF對MC3T3-E1細(xì)胞成骨分化的促進作用；CGF通過激活PI3K/AKT 信號通路的關(guān)鍵分子，刺激軟骨細(xì)胞合成細(xì)胞外基質(zhì)[24]。已有研究證明Smad4/TAZ軸的下調(diào)會導(dǎo)致間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化延遲和脂肪生成增加，有學(xué)者提出CGF纖維蛋白膜促進人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞介導(dǎo)的牙周組織再生，可能與上調(diào)TAZ相關(guān)[25-26]。

3.2 促進軟組織愈合和再生

Garber等[27]早在1996年就提出牙齒、嘴唇和牙齦美學(xué)是構(gòu)成迷人微笑的三要素，其中牙齦美學(xué)包括恢復(fù)牙齦的健康狀態(tài)和協(xié)調(diào)外形。當(dāng)唇側(cè)牙齦厚度<2 mm、角化齦寬度不足2 mm時，發(fā)生種植體周圍炎、基臺暴露的風(fēng)險大大增加[28]。且當(dāng)唇側(cè)軟組織的塌陷量>1 mm時，就會出現(xiàn)明顯的美學(xué)缺陷，可能與骨上組織高度降低、缺乏角化黏膜、黏膜厚度不足有關(guān)[29-31]。因此，想要在前牙美學(xué)區(qū)實現(xiàn)最佳的修復(fù)效果，種植治療過程中就必須加強對軟組織處理的關(guān)注。多項研究結(jié)果顯示添加CGF浸提液(10%)的培養(yǎng)基可以顯著提高人成纖維細(xì)胞、GMSCs的增殖和遷移能力，細(xì)胞內(nèi)促血管生成相關(guān)蛋白表達(dá)明顯增加，為血小板制品應(yīng)用于軟組織修復(fù)和再生提供了證據(jù)支持[6,32-33]。體內(nèi)研究結(jié)果也顯示接受牙齦注射CGF組的大鼠牙齦的基底層厚度明顯增加，上皮釘突延長，基底層增殖標(biāo)志物Ki67、內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志物CD31的表達(dá)水平顯著上調(diào)。但部分研究指出高濃度生長因子可能抑制細(xì)胞的增殖、分化[34-35]。

目前認(rèn)為CGF主要通過持續(xù)釋放生長因子、細(xì)胞因子參與促進軟組織修復(fù)的過程。有學(xué)者提出猜想CGF中干細(xì)胞和單核細(xì)胞通過移動到傷口底部、增殖并進一步分化為巨噬細(xì)胞，參與了傷口愈合[36]。此外，Qi的研究顯示CGF處理后GMSCs中YAP通路相關(guān)蛋白表達(dá)明顯升高，提示細(xì)胞核內(nèi)YAP表達(dá)增加可能是CGF促進牙齦再生的關(guān)鍵因素。Zhang等[37]提出CGF可以通過阻斷P38MAPK/AP-1信號通路降低人成纖維細(xì)胞內(nèi)基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase, MMP)-1表達(dá)水平，從而抑制細(xì)胞內(nèi)活性氧的產(chǎn)生和減少氧化損傷以加速軟組織修復(fù)。

3.3 促進血管生成

美學(xué)區(qū)種植通常需要聯(lián)合軟硬組織移植手術(shù)以提供足量的軟硬組織，從而實現(xiàn)種植牙功能和美學(xué)效果的長期穩(wěn)定。而充足的血供和組織血管化是軟硬組織移植成功的關(guān)鍵[38]。血管再生涉及的調(diào)控機制十分復(fù)雜，需要多種生長因子協(xié)同發(fā)揮募集內(nèi)皮細(xì)胞、誘導(dǎo)血管出芽等功能。由于CGF多孔網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的存在，孔隙中吸附了高濃度的多種生長因子(VEGF、PDGF、FGF-2、EGF等)和CD34+細(xì)胞，在血管生成中起關(guān)鍵作用?；驴〉萚39]發(fā)現(xiàn)含CGF浸提液的培養(yǎng)基可明顯增強內(nèi)皮細(xì)胞遷移和增殖活動，細(xì)胞內(nèi)成血管相關(guān)基因(CXCR4、PDGF、VEGF)的表達(dá)顯著升高，且在一定濃度范圍內(nèi)有濃度依賴性，提示了CGF強大的促進血管生成的能力。此外，Calabriso等[40]發(fā)現(xiàn)CGF中除生長因子外還含有大量MMP-2和MMP-9，MMP-9可選擇性地降解細(xì)胞外基質(zhì)、招募內(nèi)皮細(xì)胞、輔助血管內(nèi)皮細(xì)胞遷移至發(fā)芽部位，從而促進血管再生。一項研究結(jié)果顯示使用CGF浸提液培養(yǎng)基可以促使內(nèi)皮細(xì)胞中CXCL-12/CXCR-4表達(dá)明顯增加，CXCL-12是一種趨化分子，對CD34+細(xì)胞有強大的趨化作用從而促進血管再生。

4 CGF在美學(xué)區(qū)種植治療中的臨床應(yīng)用

前牙區(qū)解剖結(jié)構(gòu)特殊并承擔(dān)著重要的美學(xué)功能，因此如何有效修復(fù)前牙缺失、縮短組織愈合時間、保證長期穩(wěn)定的美學(xué)效果是口腔種植醫(yī)生長期思考與探討的問題。上述大量基礎(chǔ)研究已證實CGF具有強大的促進軟硬組織愈合和再生的能力，也有其應(yīng)用于上頜竇提升、牙槽嵴保留、控制種植體周圍炎的相關(guān)報道，為CGF在美學(xué)區(qū)種植領(lǐng)域中的應(yīng)用提供了理論和臨床應(yīng)用基礎(chǔ)[41-44]。

4.1 即刻種植

即刻種植因理想的植入位置、節(jié)省治療時間和費用、患者舒適度好、缺牙期短等優(yōu)勢，成為醫(yī)生和患者優(yōu)先選擇的治療方案。然而前牙區(qū)即刻種植具有極大的美學(xué)風(fēng)險，需嚴(yán)格把握適應(yīng)證。不利條件下的即刻種植面臨著更高的軟組織退縮和植體暴露的風(fēng)險，同期聯(lián)合軟硬組織增強技術(shù)可能有利于維持牙槽嵴高度、增加軟組織穩(wěn)定性[45-47]。CGF因富含大量生長因子且抗張強度優(yōu)于其他血小板制品，作為生物屏障膜應(yīng)用于美學(xué)區(qū)即刻種植可封閉創(chuàng)口并引導(dǎo)軟硬組織再生。羅曉軍等[48]以92例美學(xué)區(qū)單牙即刻種植患者為研究對象，將使用CGF聯(lián)合骨替代材料與單純應(yīng)用骨替代材料對牙齦美學(xué)的影響進行對比研究，發(fā)現(xiàn)CGF明顯促進了術(shù)區(qū)牙齦組織的修復(fù)，牙齦腫脹表現(xiàn)輕、愈合速度快，術(shù)后3、6個月時紅色美學(xué)指數(shù)評分(pink esthetic score，PES)顯著增加、牙齦退縮減少，且患者主觀滿意度明顯高于對照組，認(rèn)為聯(lián)合使用CGF能提高即刻種植的美學(xué)效果。有學(xué)者對CGF應(yīng)用于炎癥期美學(xué)區(qū)即刻種植的臨床效果進行了研究，發(fā)現(xiàn)種植術(shù)中聯(lián)合使用CGF有利于減輕術(shù)后早期疼痛，觀察組未發(fā)生種植體周圍炎等并發(fā)癥，術(shù)后3個月種植體唇側(cè)水平骨吸收量明顯低于未使用CGF組[49-52]。王獻(xiàn)利等[53]還報道了鈦網(wǎng)聯(lián)合CGF應(yīng)用于前牙區(qū)即刻種植修復(fù)，提出CGF可促進軟組織生長，降低術(shù)后感染風(fēng)險，減少鈦網(wǎng)暴露感染等并發(fā)癥。

4.2 位點保存

當(dāng)患者不滿足即刻種植手術(shù)指征時，為了盡可能保存缺牙區(qū)牙槽骨，臨床醫(yī)生可通過位點保存技術(shù)為后續(xù)的種植修復(fù)創(chuàng)造條件。藺世晨等[54]對CGF聯(lián)合骨替代材料在上頜前牙區(qū)進行位點保存的臨床效果進行了研究，發(fā)現(xiàn)術(shù)后6個月時唇、腭側(cè)骨板高度與術(shù)前相比沒有明顯變化，牙槽嵴寬度稍有丟失((-0.23±0.29)mm)，但CGF組唇、腭側(cè)骨板高度和牙槽嵴寬度明顯優(yōu)于單純使用骨替代材料組。且在后續(xù)種植術(shù)中可觀察到CGF組的新生骨組織骨質(zhì)較硬并包繞部分骨粉顆粒，缺牙區(qū)牙槽嵴頂形成了充足的角化齦組織，為后續(xù)種植治療創(chuàng)造了良好的條件。朱梅等[55]的研究也證實美學(xué)區(qū)在拔牙同期采用CGF聯(lián)合骨代用品行位點保存，可減少軟硬組織增量二期手術(shù)的患者比例，并有效維持美學(xué)區(qū)牙槽嵴的寬度和高度，術(shù)后美學(xué)效果好，隨訪12個月發(fā)現(xiàn)種植修復(fù)體齦乳頭及齦緣高度維持良好。

4.3 硬組織增量與骨整合

外傷、牙周病、根尖周病等是前牙缺失的常見原因，缺牙后多伴唇側(cè)骨壁吸收以及軟組織塌陷，此類患者需先行骨增量手術(shù)為后續(xù)種植手術(shù)提供足夠的牙槽嵴寬度和高度。王亞敏等[56]選取了40例上頜前牙區(qū)牙槽嵴寬度小于3 mm的單牙缺失，對CGF+骨粉+膠原膜行引導(dǎo)骨再生術(shù)的骨增量療效進行評價，發(fā)現(xiàn)術(shù)后6個月觀察組半年骨寬度增加量為(3.70±0.28)mm，明顯優(yōu)于對照組。另有多位學(xué)者通過CBCT在術(shù)后不同時間點對新生骨組織的厚度、密度值進行測量，發(fā)現(xiàn)CGF應(yīng)用于上頜前牙區(qū)骨增量手術(shù)可以有效引導(dǎo)早期骨再生，明顯改善新生骨密度和質(zhì)量[57-58]。林海燕等[59]報道了在軟組織瓣和鈦網(wǎng)之間放置CGF纖維蛋白膜還可以緩沖口唇對術(shù)區(qū)的壓力，減少因軟組織瓣與鈦網(wǎng)間的摩擦而導(dǎo)致的軟組織破裂或鈦網(wǎng)暴露等美學(xué)并發(fā)癥的發(fā)生。此外，種植體周的骨整合對于功能和美學(xué)的長期穩(wěn)定很重要。Pirpir等[60]發(fā)現(xiàn)一期手術(shù)中通過使用CGF液體處理種植體表面并在種植體上部覆蓋CGF纖維蛋白膜，可以增強上頜前牙區(qū)種植體的早期穩(wěn)定性，并加速骨整合。

4.4 軟組織愈合與再生

良好的愈合是牙周與種植美學(xué)手術(shù)成功的關(guān)鍵，軟組織愈合不良可能會引起創(chuàng)口開裂、組織缺損以及瘢痕增生，進而影響最終的美學(xué)效果。王亞敏等[56]的研究結(jié)果顯示將CGF應(yīng)用于上頜前牙區(qū)種植手術(shù)時，一期愈合率較未使用CGF的對照組更高。有學(xué)者對CGF應(yīng)用于上頜前牙區(qū)骨量不足的短期美學(xué)效果進行了研究，結(jié)果顯示術(shù)后6個月聯(lián)合使用CGF的觀察組PES各項得分均顯著高于對照組[61]。術(shù)后4周可觀察到角化齦寬度平均增長2 mm，術(shù)后12周角化齦厚度平均增加0.5 mm，證明CGF對于種植體周圍角化齦質(zhì)量有積極作用，但目前尚缺乏遠(yuǎn)期效果的證據(jù)[62]。此外，已有不少學(xué)者將CGF應(yīng)用于牙齦退縮的治療，認(rèn)為聯(lián)合使用CGF可以顯著增加牙齦厚度和角化齦寬度，可能有利于維持牙齦乳頭三維形態(tài)并減少術(shù)后牙齦退縮的復(fù)發(fā)[63-64]。

5 總 結(jié)

作為第三代血小板濃縮物，濃縮生長因子制備過程簡單且無需添加凝血酶，極大降低了交叉感染的風(fēng)險。致密的纖維蛋白網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)賦予了CGF一定的拉伸強度，臨床上可將CGF壓制成生物膜后替代人工屏障膜，或加工成顆粒與骨替代材料作為骨組織再生支架。通過蛋白網(wǎng)絡(luò)內(nèi)嵌合的高濃度生長因子、CD34+細(xì)胞和白細(xì)胞，CGF表現(xiàn)出強大的促進血管再生、軟硬組織修復(fù)和再生的潛力，為前牙美學(xué)區(qū)域的牙種植患者恢復(fù)牙齒功能和自然的牙齦外形提供了更有力的支持。但目前CGF對于骨再生、軟組織再生的確切作用機制尚不清楚，仍需進一步的深入探索。