保健食品中花色苷分析方法研究

柏偉榮，張書嘉，郭小莉，高如意

（江蘇康緣藥業(yè)股份有限公司，江蘇 連云港 222001）

緩解視疲勞片為一款緩解視疲勞保健食品，配方為越橘提取物、葉黃素和菊花。菊花中含有多種黃酮類成分，能夠清除自由基達到保護組織的功效[1-3]。葉黃素通過細胞體外實驗、小鼠體內(nèi)試驗對氧自由基活性的抑制，來證實緩解視疲勞機理[4-6]。歐洲越橘提取物功效成分為花色苷，花色苷具有極強的抗氧化、清除自由基活性，能夠改善血管微循環(huán)、提高毛細血管強度以及改善視力[7-9]。目前花色苷的檢測方法參照 SW2—2013《國際商務(wù)標準 植物提取物 越橘提取物》，但此方法只適用于單一原料的含量檢測，不適用于復(fù)方保健食品中花色苷的檢測，本實驗建立保健食品中花色苷的定性鑒別和含量測定的方法，適用于復(fù)方保健食品中花色苷的分析方法，為產(chǎn)品質(zhì)量控制提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

緩解視疲勞片，以越橘提取物等為主要原料制成的緩解視疲勞保健食品：連云港康緣美域保健食品有限公司；花色苷單標對照品，矢車菊素-3-O-葡萄糖苷，批號為18040904，含量以98%計：成都普菲德生物技術(shù)有限公司；對照樣品，越橘提取物：USP RockVILLE，MD；硅膠GF254層析板，批號：20180905：安徽良臣硅源材料有限公司；乙腈、甲醇為色譜純；其它試劑均為國產(chǎn)分析純；超純水：自制。

1.2 儀器與設(shè)備

電子分析天平，BSA224S-CW：德國賽多利斯公司；KQ-500DE型超聲波清洗器：昆山市超聲儀器有限公司；高效液相色譜儀：戴安；Mili-Q超純水儀：美國密理博公司；H1650-W型離心機：湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 薄層鑒別供試品溶液的制備

取樣品20片，研細，稱取0.2 g粉末，于25 mL容量瓶中，用甲醇溶解，超聲處理15 min，定容，離心，即得。

1.3.2 薄層鑒別標準品溶液的配制

稱取矢車菊素-3-O-葡萄糖苷約2 mg，于10 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，搖勻，即得單標標準溶液。

稱取Powdered Bilberry Extract約5 mg，置于10 mL容量瓶中，加入甲醇溶解并定容至刻度，搖勻，即得混標標準溶液。

1.3.3 薄層鑒別陰性對照溶液的配制

取陰性對照（不含越橘提取物）0.2 g，按照供試品溶液的制備方法，同法制成陰性樣品溶液。

1.3.4 高效液相色譜檢測對照品溶液的制備

稱取對照品（矢車菊素-3-O-葡萄糖苷）約4 mg，精密稱定，置于25 mL的容量瓶中，加入2%鹽酸-甲醇溶液（V/V）并稀釋至刻度，搖勻，準確移取2 mL的上述溶液于10 mL的容量瓶中，用10%磷酸水溶液（V/V）定容，得到單標對照品溶液。

稱取對照樣品（Powdered Bilberry Extract）約125 mg，精密稱定，置于25 mL的容量瓶中，加入2%鹽酸-甲醇溶液（V/V）并稀釋至刻度，搖勻，準確移取2 mL的上述溶液于50 mL的容量瓶中，用10%磷酸水溶液（V/V）定容，得到混標對照樣品溶液。

1.3.5 高效液相色譜檢測供試品溶液的制備

取樣品20片，去包衣，研細，取0.4 g，置具塞錐形瓶中，精密稱定，置于25 mL的容量瓶中，加入2%鹽酸-甲醇溶液（V/V）并稀釋至刻度，搖勻，超聲處理（功率500 W，頻率40 kHz）30 min，放冷，搖勻，準確移取2 mL的上述溶液于10 mL的容量瓶中，用10%磷酸水溶液（V/V）定容。高速離心（12 000 r/min），取上清液，即為待測樣品。

1.3.6 高效液相色譜檢測陰性對照溶液的制備

按照配方工藝，制備缺少越橘提取物的陰性樣品，按照供試品溶液的制備方法制得陰性對照溶液。

1.3.7 高效液相色譜條件

參照國際商務(wù)標準，確定選用以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，色譜柱為 Luna C18（250×4.6 mm，5 μm），柱溫為 30 ℃，流速為 1 mL/min，檢測波長535 nm。流動相∶A相∶甲酸-水溶液（8.5∶91.5，V/V）；B 相∶乙腈-甲醇-甲酸-水溶液（22.5∶22.5∶8.5∶41.5，V/V/V/V），梯度條件見表1。

表1 洗脫梯度Table 1 Elution gradient

1.4 數(shù)據(jù)分析

以矢車菊素-3-O-葡萄糖苷對照品為參照，以其相應(yīng)的峰為S峰，計算各花色苷組分的相對保留時間，并參照 SW2—2013《國際商務(wù)標準 植物提取物 越橘提取物》中花色苷各組分出峰順序，采用外標一點法對各花色苷組分的質(zhì)量分數(shù)進行定量，并計算相對標準偏差（RSD）。

2 結(jié)果與討論

2.1 花色苷薄層鑒別方法

2.1.1 展開劑的選擇

在硅膠 GF254層析板上，按照單標2 μL、混標4 μL、供試品溶液2 μL、陰性對照溶液4 μL分別進行點樣。分別用V(甲酸)∶V(水)∶V(正丁醇)=9.1∶8.4∶32.5（展開劑 1）、V(乙酸)∶V(水)∶V(正丁醇)=9∶6∶32.5（展開劑 2）、V(甲酸)∶V(水)∶V(乙酸乙酯)=9∶8∶32（展開劑 3）進行展開。然后晾干，在日光燈下檢視結(jié)果見圖1。

圖1 花色苷薄層鑒別展開劑考察Fig.1 Study on TLC identification unfolding agent of Anthocyanin

由圖1可知，與展開劑 2、展開劑3相比，展開劑1的斑點分離度、清晰度均較好，故花色苷的薄層鑒別選擇展開劑1作為展開系統(tǒng)。

2.1.2 點樣量的確定

在硅膠 GF254層析板上，按照單標2 μL，混標 4 μL，供試品溶液1、2、4、6 μL，陰性對照溶液 4 μL 分別進行點樣，V(甲酸)∶V(水)∶V(正丁醇)=9.1∶8.4∶32.5作為展開劑，展開后晾干，在日光燈下檢視，結(jié)果見圖2。

圖2 花色苷薄層鑒別點樣量考察Fig.2 Study on the sample size of Anthocyanin TLC identification

由圖2可知，通過考察不同點樣量時樣品的分離度和拖尾情況，結(jié)果表明點樣量在1～6 μL之間，樣品均能得到檢視，供試品溶液點樣量為2 μL時，已顯示出較為清晰的主斑點，故供試品溶液點樣量選擇2 μL。

2.1.3 溫度和濕度考察

設(shè)置點樣量：單標2 μL，混標4 μL，供試品溶液 2 μL，陰性對照溶液 4 μL；展開劑∶V(甲酸)∶V(水)∶V(正丁醇)=9.1∶8.4∶32.5。在不同的溫度（室溫20 ℃和低溫4 ℃）和不同的相對濕度（47%、65%、88%）條件下進行薄層層析，晾干后在日光燈下檢視結(jié)果見圖3。

圖3 花色苷薄層鑒別溫度和濕度考察Fig.3 Identification of Anthocyanins by TLC with temperature and humidity

由圖3可知，在不同溫度、不同的相對濕度條件下，分離效果均較好，表明溫度和相對濕度對花色苷薄層鑒別基本無影響，說明溫度耐用性考察結(jié)果和濕度耐用性考察結(jié)果均良好。

2.2 花色苷含量測定方法

2.2.1 高效液相色譜法測定花色苷的專屬性

分別精密吸取對照品、供試品、陰性對照溶液各 10 μL，注入高效液相色譜儀，測定。結(jié)果見圖4～7。

圖4 矢車菊素-3-O-葡萄糖苷對照品（單標）HPLC色譜圖Fig.4 HPLC chromatogram of cyanidin-3-O-glucoside reference substance (single label)

圖5 Powdered Bilberry Extract對照品（混標）HPLC色譜圖Fig.5 Powder Bilberry Extract reference (mixed)HPLC chromatogram

圖6 緩解視疲勞片供試品溶液HPLC色譜圖Fig.6 HPLC chromatogram of sample solution for relieving Shilai tablets

圖7 緩解視疲勞片陰性對照HPLC色譜圖Fig.7 HPLC chromatogram of negative control for relieving asthenopia tablets

結(jié)果表明：供試品色譜圖中呈現(xiàn)與對照品色譜保留時間一致（29 min）的色譜峰，為矢車菊素-3-O-葡萄糖苷目標峰，且陰性對照色譜圖中在待測成分保留時間處無雜質(zhì)峰干擾，表明本方法有良好的專屬性。

2.2.2 高效液相色譜法測定花色苷的檢測限與定量限

將對照品（矢車菊素-3-O-葡萄糖苷）溶液34.888 μg/mL用10%磷酸水溶液稀釋，精密吸取對照品溶液各 10 μL，注入液相色譜儀，測定，以信噪比10∶1時的測定濃度作為定量限，以信噪比3∶1時的測定濃度作為檢測限，得定量限為11.23 ng，檢測限為4.16 ng。

2.2.3 高效液相色譜法測定花色苷線性關(guān)系

分別精密量取不同體積的矢車菊素-3-O-葡萄糖苷單標對照品儲備液，置于10 mL的容量瓶中，用10%磷酸水溶液（V/V）定容，配制成系列濃度的標準溶液：4.361、8.722、17.444、26.166、34.888、52.322 μg/mL。精密吸取上述對照品溶液各 10 μL，注入液相色譜儀，按上述色譜條件測定峰面積，結(jié)果見表2。以進樣濃度（μg/mL）為橫坐標（x），峰面積為縱坐標（y），繪制標準曲線，計算回歸方程。結(jié)果表明：矢車菊素-3-O-葡萄糖苷溶液在4.361～52.332 μg/mL范圍內(nèi)有良好的線性關(guān)系，回歸方程為y=0.236 4x+0.098 7，R2=0.999 5

表2 標準曲線的測定Table 2 Determination of standard curve

2.2.4 高效液相色譜法測定花色苷的精密度

精密吸取低中高三個濃度的對照品溶液，連續(xù)重復(fù)進樣6次，測得矢車菊素-3-O-葡萄糖苷峰面積積分值，計算，結(jié)果見表3。RSD值均小于2%，結(jié)果表明儀器精密度良好。

表3 精密度測定結(jié)果（對照品）Table 3 Precision measurement results (Reference substance)

2.2.5 高效液相色譜法測定花色苷的的重復(fù)性

按照上述處理方法，平行制備6份供試品溶液，結(jié)果見表4。

表4 重復(fù)性測定結(jié)果Table 4 Repeatability test

結(jié)果表明總花色苷的平均含量為7.15 g/100g，RSD%=1.03（n=6）。說明此法重復(fù)性良好。

2.2.6 高效液相色譜法測定花色苷的穩(wěn)定性

取線性項下的對照品溶液（濃度為17.444 μg/mL），分別于 0、2、4、6、10、16、20、24、28、32、36 h進樣，檢測樣品在36 h內(nèi)的穩(wěn)定性，計算峰面積的RSD值，結(jié)果檢表5和標6。結(jié)果表明，對照品和供試品的RSD值分別為0.31%、0.61%，說明在36小時內(nèi)穩(wěn)定性良好。

表5 穩(wěn)定性測定結(jié)果（對照品）Table 5 Stability results (Reference substance)

表6 穩(wěn)定性測定結(jié)果（供試品）Table 6 Stability test result (test specimen)

2.2.7 高效液相色譜法測定花色苷的加樣回收率

取本品20片，去包衣，研細，取0.2 g，精密稱定，置于25 mL容量瓶中，精密加入對照品溶液（1.186 mg/mL）1 mL，用2%鹽酸-甲醇溶液（V/V）定容至刻度，超聲處理（功率500 W，頻率40 kHz）30 min，放冷，搖勻，準確移取2 mL的上述溶液于10 mL的容量瓶中，用10%磷酸水溶液（V/V）定容。高速離心（12 000 r/min），取上清液，即為待測樣品。平行制備6份供試品溶液，測定，結(jié)果見表7。平均回收率在95%～105%之間，RSD小于2%，說明該方法的準確度良好。

表7 加樣回收率實驗Table 7 Sample recovery test

3 結(jié)論

薄層色譜法能夠鑒別緩解視疲勞片中的花色苷成分，確定最佳鑒別條件為：展開劑為 V(甲酸)∶V(水)∶V(正丁醇)=9.1∶8.4∶32.5，點樣量為2 μL，且不受溫度和濕度的影響，對類似的保健食品中花色苷的薄層鑒別有一定借鑒意義。

參考 SW2—2013《國際商務(wù)標準 植物提取物 越橘提取物》中花色苷的含量測定方法，通過專屬性、檢測線、定量限、線性關(guān)系、精密度、重復(fù)性、穩(wěn)定性和加樣回收試驗，優(yōu)化并建立一種適用于保健食品中花色苷含量測定的方法，可作為緩解視疲勞片的質(zhì)量控制方法。