基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)與分子對(duì)接技術(shù)探究逍遙丸治療乳腺增生的作用機(jī)制

管慶霞，楊芳芳，楊志平，聶澤卉，周小影，林澤榆，陳忠新，鄒淑君

（黑龍江中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150040）

逍遙丸的前身為逍遙散，其在《太平惠民和劑局方》首次被記載，由柴胡、當(dāng)歸、白術(shù)、芍藥、茯苓、甘草、薄荷、生姜八味藥組成。治血虛勞倦，五心煩熱，肢體疼痛，頭目昏重，心忪頰赤，口燥咽干，發(fā)熱盜汗，減食嗜臥，及血熱相搏，月水不調(diào)，臍腹脹痛，寒熱如瘧。又療室女血弱陰虛，榮衛(wèi)不和，痰嗽潮熱，肌體羸瘦，漸成骨蒸，此方常用來(lái)疏肝解郁、婦科調(diào)經(jīng)。方中柴胡為君藥，行其疏肝解郁之功。當(dāng)歸為臣藥，養(yǎng)血和血皆可理氣；白芍亦為臣藥，養(yǎng)血柔肝皆可斂陰；當(dāng)歸、白芍與柴胡共用，補(bǔ)肝和肝，血和可以達(dá)到肝和之效，血液充營(yíng)則起到柔肝之功，共同作為臣藥起作用。白術(shù)、茯苓、甘草共為佐藥，既健脾又益氣，既能實(shí)土以御木侮，且使?fàn)I血生化有源。薄荷少許，疏肝散熱兼行氣；生姜溫中散寒，辛散解郁，兩者為佐藥。柴胡為肝經(jīng)引經(jīng)藥，又是方中的使藥。逍遙丸在臨床上可用于治療婦科疾病、免疫疾病、肝臟疾病、應(yīng)激性損傷、內(nèi)分泌疾病、神經(jīng)疾病等，療效確定[1]?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，逍遙丸可以通過(guò)使乳腺增生大鼠 ER、PR、ERK含量明顯升高[2]、血清雌二醇（E2）和孕酮（P）水平顯著降低[3]來(lái)達(dá)到治療乳腺增生疾病的效果。乳腺疾病占所有乳腺疾病的 70%以上，與內(nèi)分泌紊亂、激素敏感性提高有關(guān)，西醫(yī)尚沒(méi)有療效顯著的方法[4-5]。近年來(lái)，隨著中藥對(duì)乳腺增生臨床療效的研究不斷深入[6-8]，中醫(yī)藥對(duì)乳腺疾病的療效越發(fā)顯著確切，中醫(yī)在乳腺增生疾病治療機(jī)制方面具有很大的探究空間。

在探索中藥作用于人體的機(jī)制過(guò)程中，人們引入了網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)更加便捷直觀地了解到藥物作用過(guò)程，可以為優(yōu)化用藥過(guò)程提供基礎(chǔ)。劉琳[9]等運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析了逍遙丸治療抑郁癥的作用機(jī)制，楊萍[10]等運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析了逍遙丸治療認(rèn)知障礙的作用機(jī)制，陳銘泰[11]等運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析了逍遙散治療動(dòng)脈粥樣硬化和抑郁癥“異病同治”的作用機(jī)制。逍遙丸對(duì)于乳腺增生的研究日漸深入，但是對(duì)于其機(jī)制的闡述尚不完全。本課題組利用逍遙丸有效活性成分和乳腺增生潛在靶點(diǎn)，擴(kuò)充逍遙丸對(duì)乳腺疾病治療機(jī)制探究，有利于新劑型的研發(fā)和藥物新用途的開(kāi)發(fā)。

1 材料與方法

1.1 篩選逍遙丸活性成分并獲取作用靶點(diǎn)

以口服生物利用度（Oral bioavailability，OB）和藥物相似度（Drug likeness，DL）作為篩選條件，在中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)和分析平臺(tái)[12]（Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP，http://tcmspw.com/tcmsp.php）中，以白芍、炒白術(shù)、薄荷、柴胡、當(dāng)歸、茯苓、甘草和生姜為關(guān)鍵詞，成分篩選條件為 OB≥30%，DL≥0.18，篩選 8味中藥所含化學(xué)活性成分，將納入的化合物成分通過(guò) TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行成分的靶點(diǎn)預(yù)測(cè)。利用Uniprot蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)（Universal Protein，https://www.uniprot.org/）將預(yù)測(cè)出的蛋白質(zhì)靶點(diǎn)和基因信息進(jìn)行規(guī)范。

1.2 獲取乳腺增生相關(guān)靶點(diǎn)基因

以“hyperplasia of mammary glands”為關(guān)鍵詞，在 GeneCards[13]數(shù)據(jù)庫(kù)（https://www.genecards.org/），NCBI基因數(shù)據(jù)庫(kù)[14]（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）以及 OMIM 數(shù)據(jù)庫(kù)[15]（http://ctdbase.org/）中，其中，GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)根據(jù)數(shù)據(jù)庫(kù)中score進(jìn)行中位值的篩選以獲得更相關(guān)的靶點(diǎn)，將乳腺增生疾病相關(guān)靶點(diǎn)進(jìn)行匯總，并利用Uniprot蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)將得到的靶點(diǎn)轉(zhuǎn)化為標(biāo)準(zhǔn)基因名。

1.3 篩選逍遙丸有效成分和乳腺增生疾病的共同靶點(diǎn)

將篩選出的逍遙丸有效成分靶點(diǎn)與乳腺增生疾病靶點(diǎn)輸入韋恩圖制作軟件Venny 2.1（https://www.genecards.org/）中，通過(guò)映射構(gòu)建韋恩圖得到交集基因，可以由所得到的交集基因推斷得到逍遙丸發(fā)揮作用的節(jié)點(diǎn)，作為藥物作用于疾病的預(yù)測(cè)靶點(diǎn)進(jìn)行下面的通路富集分析。

1.4 PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

將藥物疾病共有靶點(diǎn)輸入 String數(shù)據(jù)庫(kù)[16]（https://string-db.org/）進(jìn)行PPI網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建，將生物種類設(shè)定為“Homo sapiens”，可信度＞0.9，獲得PPI網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)，并將所得信息導(dǎo)入cytoscape軟件進(jìn)行相互作用網(wǎng)絡(luò)的繪制和進(jìn)一步分析。

1.4.1 拓?fù)浞治?/p>

拓?fù)浞治?，通過(guò)degree排序，選取分值大于平均分的基因作為關(guān)鍵靶將PPI網(wǎng)絡(luò)導(dǎo)入Cystoscape 3.8.0[17]中，通過(guò)NetworkAnalyzer工具進(jìn)行分析。

1.4.2 MCODE聚類分析

本研究通過(guò)MCODE分析進(jìn)行關(guān)鍵基因的篩選。將已經(jīng)構(gòu)建好的PPI網(wǎng)絡(luò)導(dǎo)入Cytoscape3.6.0中，打開(kāi)MCODE模塊進(jìn)行基因簇的分析以及核心靶點(diǎn)的篩選。

1.5 成分-疾病-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

以納入的成分、治療疾病以及作用靶點(diǎn)為基礎(chǔ)，導(dǎo)入 cytoscape 3.8.0中，構(gòu)建了成分-疾病-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖，從而更好的理解成分，疾病以及相應(yīng)靶點(diǎn)之間的復(fù)雜相互作用關(guān)系。

1.6 關(guān)鍵成分篩選

將成分-疾病-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖，導(dǎo)入cytoscape 3.8.0中進(jìn)行拓?fù)浞治?。將成分進(jìn)行degree的排序，大于平均度值的被篩選為關(guān)鍵成分。

1.7 GO富集分析和KEGG通路富集分析

將藥物疾病共有靶點(diǎn)進(jìn)行京都基因（GO）富集分析和基因組百科全書（KEGG）通路富集分析，將物種類設(shè)定為“Homo sapiens”，引用String數(shù)據(jù)庫(kù)，將校正P值≤0.05的項(xiàng)目進(jìn)行篩選，獲取數(shù)據(jù)并繪制氣泡圖和條形圖。GO富集分析使用 R 3.6.3軟件，安裝并引用 clusterProfiler，enrichplot，ggplot2包，進(jìn)行柱狀圖和氣泡圖繪制。KEGG通路富集分析使用 R 3.6.3，安裝并引用clusterProfiler包后，進(jìn)行柱狀圖和氣泡圖繪制。

1.8 成分-疾病-通路-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

將成分-疾病-通路-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)文件導(dǎo)入Cytoscape 3.8.0進(jìn)行通路網(wǎng)絡(luò)圖的繪制。更直觀地展示中藥活性成分在治療乳腺增生過(guò)程中的多成分-多靶點(diǎn)的作用特點(diǎn)。

1.9 分子對(duì)接驗(yàn)證

利用ChemOffice軟件構(gòu)建關(guān)鍵活性成分的3D結(jié)構(gòu)，將格式保存為pdb。在PDB數(shù)據(jù)庫(kù)（http://www.rcsb.org）下載 AKT1（PDB ID：6HHG）、MAPK1（PDB ID：3QYZ）、JUN（PDB ID：2P33）、MAPK3（PDB ID：6GES）、STAT3（PDB ID：5AX3）的晶體結(jié)構(gòu)。運(yùn)用AutoDock Tools 1.5.6軟件對(duì)其進(jìn)行去水，加氫，分離配體等處理后保存為pdqt格式，藥物關(guān)鍵活性成分處理后同亦保存為pdqt格式。使用 AutoDock vina軟件進(jìn)行分子對(duì)接，并用Pymol軟件進(jìn)行可視化分析對(duì)接構(gòu)象。

2 結(jié)果與分析

2.1 逍遙丸活性成分靶點(diǎn)信息查詢

通過(guò) TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)（https://tcmspw.com/tcmsp.php）檢索白芍、炒白術(shù)、薄荷、柴胡、當(dāng)歸、茯苓、甘草和生姜的化合物成分。成分篩選條件為OB≥30%，DL≥0.18。將納入的化合物成分通過(guò) TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行成分的靶點(diǎn)預(yù)測(cè)。經(jīng)匯總刪重后，白芍獲得 13個(gè)化合物成分，78個(gè)靶點(diǎn)；白術(shù)獲得7個(gè)化合物成分，16個(gè)靶點(diǎn)；薄荷獲得 10個(gè)化合物成分，97個(gè)靶點(diǎn)；柴胡獲得17個(gè)化合物成分，176個(gè)靶點(diǎn)；當(dāng)歸獲得2個(gè)化合物成分，51個(gè)靶點(diǎn)；茯苓獲得 15個(gè)化合物成分，23個(gè)靶點(diǎn)；甘草獲得93個(gè)化合物成分，215個(gè)靶點(diǎn)；生姜獲得5個(gè)化合物成分，54個(gè)靶點(diǎn)。

2.2 疾病靶點(diǎn)查找

在GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)（https://www.genecards.org/），NCBI基因數(shù)據(jù)庫(kù)[3]（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）以及OMIM數(shù)據(jù)庫(kù)[4]（http://ctdbase.org/）中以“hyperplasia of mammary glands”為關(guān)鍵詞進(jìn)行檢索，經(jīng)檢索，在GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)檢索到2261條相關(guān)基因，NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)獲得6個(gè)基因，OMIM數(shù)據(jù)庫(kù)獲得455個(gè)靶點(diǎn)。將這3個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)的基因合并刪重之后，得到2 678個(gè)乳腺增生相關(guān)基因。

2.3 逍遙丸有效成分和乳腺增生疾病的靶點(diǎn)取交集

將篩選出的藥物靶點(diǎn)與疾病靶點(diǎn)輸入韋恩圖制作軟件Venny 2.1，得到169個(gè)共有靶點(diǎn)，見(jiàn)圖1。作為藥物作用于疾病的預(yù)測(cè)靶點(diǎn)進(jìn)行下面的通路富集分析。

圖1 藥物靶點(diǎn)-疾病靶點(diǎn)韋恩圖Fig. 1 Venn diagram of targets of herbs and disease

2.4 PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

將藥物疾病共有靶點(diǎn)輸入 String數(shù)據(jù)庫(kù)（https://string-db.org/cgi/input.pl）進(jìn)行 PPI網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建，將生物種類設(shè)定為“Homo sapiens”，可信度＞0.9，得到 PPI網(wǎng)絡(luò)。該網(wǎng)絡(luò)中有 169個(gè)節(jié)點(diǎn)，698條邊，平均度值為 8.26。圖2為 string網(wǎng)站導(dǎo)出的 PPI網(wǎng)絡(luò)圖（圖2中的節(jié)點(diǎn)越大，顏色越紅，表示度值越大，線越粗表示 edge betweenness越大）。圖3為cytoscape軟件繪制出的PPI網(wǎng)絡(luò)圖。

圖2 STRING平臺(tái)所做的乳腺增生和逍遙丸共有靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)Fig. 2 PPI network of hyperplasia of mammary glands target and XiaoYaoWan target from STRING

圖3 Cytoscape軟件所做的乳腺增生和逍遙丸共有靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)Fig. 3 PPI network of hyperplasia of mammary glands target and XiaoYaoWan target from Cytoscape

2.4.1 拓?fù)浞治?/p>

拓?fù)浞治?，通過(guò)degree排序，選取分值大于平均分的基因作為關(guān)鍵靶將PPI網(wǎng)絡(luò)導(dǎo)入Cystoscape 3.8.0中，通過(guò)NetworkAnalyzer工具進(jìn)行點(diǎn)，總共篩選出個(gè)56關(guān)鍵靶點(diǎn)，將前20個(gè)靶點(diǎn)使用R 3.6.3進(jìn)行圖片繪制，其中橫坐標(biāo)為每個(gè)靶點(diǎn)的度值，見(jiàn)圖4。這30個(gè)核心蛋白是整個(gè)網(wǎng)絡(luò)的靶心，是逍遙丸治療乳腺增生的潛在靶點(diǎn)。

圖4 度值排名前20的靶點(diǎn)Fig. 4 Top 20 targets with degree values

2.4.2 MCODE聚類分析

本研究通過(guò)MCODE分析[18]進(jìn)行關(guān)鍵基因的篩選。將已經(jīng)構(gòu)建好的 PPI網(wǎng)絡(luò)導(dǎo)入 Cytoscape 3.6.0中，打開(kāi)MCODE模塊進(jìn)行基因簇的分析以及核心靶點(diǎn)的篩選。總共得到7個(gè)基因簇和5個(gè)核心基因，核心基因?yàn)?HTR2A，IL2，TOP2A，PCNA，MMP1。具體信息見(jiàn)表1。

表1 MCODE聚類分析詳細(xì)信息表Table 1 MCODE cluster analysis details table

續(xù)表1

2.5 成分-疾病靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

為了更好的理解成分，疾病以及相應(yīng)靶點(diǎn)之間的復(fù)雜相互作用關(guān)系，作者以納入的成分、治療疾病以及作用靶點(diǎn)為基礎(chǔ)，構(gòu)建了成分-疾病-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖，導(dǎo)入cytoscape 3.8.0中進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)圖的繪制。所構(gòu)建網(wǎng)絡(luò)見(jiàn)圖5。

圖5 逍遙丸“成分-疾病-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)Fig. 5 “Ingredient-disease-target” network of XiaoYaoWan

2.6 關(guān)鍵成分篩選

在cytoscape 3.8.0中將成分-疾病-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖導(dǎo)入進(jìn)行拓?fù)浞治?，成分按照degree排序，大于平均度值的為關(guān)鍵成分，并且degree值越高成分越重要。詳細(xì)信息見(jiàn)表2。關(guān)鍵成分有槲皮素（quercetin）、山奈酚（kaempferol）、葉黃素（luteolin）、柚皮素（naringenin）、甘草酮 a（licochalcone a）、7-甲氧基-2-甲基異黃酮（7-Methoxy-2-methyl isoflavone）、芒柄花素（formononetin）、醋栗素（acacetin）等，可能是逍遙丸治療乳腺增生發(fā)揮作用的主要活性成分。

表2 關(guān)鍵成分信息表Table 2 Table of key ingredient information

續(xù)表2

2.7 GO富集分析

將藥物疾病共有靶點(diǎn)進(jìn)行 GO的生物過(guò)程（biological process，BP）、分子功能（molecular function，MF）、細(xì)胞組分（cell component，CC）富集，引用String數(shù)據(jù)庫(kù)，將校正P值≤0.05的項(xiàng)目進(jìn)行篩選，總共富集到2 328條生物過(guò)程，160項(xiàng)分子功能相關(guān)，47項(xiàng)細(xì)胞組成相關(guān)，結(jié)果見(jiàn)圖6～7。分析發(fā)現(xiàn)逍遙丸治療乳腺增生的生物過(guò)程中位于前列的有氧化應(yīng)激反應(yīng)、細(xì)胞對(duì)化學(xué)應(yīng)激的反應(yīng)、對(duì)類固醇激素的響應(yīng)、對(duì)脂多糖的響應(yīng)、對(duì)細(xì)菌起源分子的響應(yīng)、活性氧代謝過(guò)程、細(xì)胞對(duì)氧化應(yīng)激的反應(yīng)等過(guò)程；細(xì)胞組成位于前列的是膜筏、膜微域、囊泡、平滑肌細(xì)胞的小凹等；其分子功能中位于前列的是結(jié)合跟 DNA相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子、結(jié)合跟RNA聚合酶2-特定的DNA相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子、結(jié)合細(xì)胞因子受體、細(xì)胞因子活性、核受體活性等。

圖6 富集分析柱狀圖Fig. 6 Enrichment analysis histogram

圖7 GO富集分析氣泡圖Fig. 7 GO Enrichment analysis bubble diagram

2.8 KEGG通路富集

將藥物疾病共有靶點(diǎn)進(jìn)行KEGG通路富集分析，引用String數(shù)據(jù)庫(kù)，將校正P值≤0.05的項(xiàng)目進(jìn)行篩選，總共富集到166條信號(hào)通路，分析結(jié)果見(jiàn)圖8、圖9。主要包括糖尿病并發(fā)癥的AGE-RAGE信號(hào)通路、TNF信號(hào)通路、IL-17信號(hào)通路、TH17細(xì)胞分化、流體剪切應(yīng)力與動(dòng)脈粥樣硬化等信號(hào)通路，揭示了逍遙丸通過(guò)不同靶點(diǎn)作用于不同的通路來(lái)治療乳腺增生。乙肝、丙肝、卡波西肉瘤相關(guān)皰疹病毒感染、前列腺癌、麻疹、人巨細(xì)胞病毒感染提示逍遙丸可能對(duì)其他疾病的治療也有效，這也體現(xiàn)了異病同治的原則。

圖8 KEGG通路富集分析柱狀圖Fig. 8 KEGG pathway Enrichment analysis histogram

圖9 KEGG通路富集分析氣泡圖Fig. 9 KEGG pathway Enrichment analysis bubble diagram

2.9 成分-疾病-通路-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

將成分-疾病-通路-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)文件導(dǎo)入Cytoscape 3.8.0得到如圖10所示網(wǎng)絡(luò)圖，表明逍遙丸可能通過(guò)多成分、多靶點(diǎn)、多通路抑制乳腺增生的發(fā)生、發(fā)展。

圖10 逍遙丸“成分-疾病-通路-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)Fig. 10 “Ingredient-disease-pathway-target” network of XiaoYaoWan

2.10 分子對(duì)接

關(guān)鍵活性成分與核心靶點(diǎn)進(jìn)行分子對(duì)接驗(yàn)證結(jié)果現(xiàn)實(shí)分子對(duì)接結(jié)合能均為負(fù)值，說(shuō)明受體與配體可自發(fā)結(jié)合。親和能越高，結(jié)合越差；反之，親合能越低，結(jié)合越好。根據(jù)小分子與靶點(diǎn)對(duì)接的親和能結(jié)果，可發(fā)現(xiàn)核心活性成分與關(guān)鍵靶點(diǎn)均有較好的結(jié)合能，說(shuō)明中藥在發(fā)揮臨床療效中多成分多靶點(diǎn)的特質(zhì)。

表3 關(guān)鍵靶點(diǎn)對(duì)接結(jié)果Table 3 Molecular docking result of the key targets

圖11 逍遙丸中核心成分的分子對(duì)接模式圖Fig. 11 Molecular docking mode diagram of core components in Xiaoyao Pills

3 討論

乳腺增生在中醫(yī)學(xué)中屬于“乳癖”范疇，具體表現(xiàn)有乳房疼痛、有腫塊、液體溢出，情志和月經(jīng)周期也會(huì)有波動(dòng)，在臨床乳房疾病中發(fā)生率最高，并且乳腺增生嚴(yán)重很有可能發(fā)展為乳腺癌[19]。目前西醫(yī)治療乳腺增生主要有三苯氧胺、他莫昔芬、托瑞米芬[20]，中醫(yī)治療乳腺增生主要有逍遙散、柴胡疏肝散、乳癖散等。蘇炯強(qiáng)[21]等以負(fù)性情緒評(píng)分、乳房疼痛評(píng)分、乳房腫塊大小為指標(biāo)研究發(fā)現(xiàn)逍遙散組治療乳腺增生療效高于常規(guī)西藥組，揭示逍遙散治療乳腺增生療效確切，但是關(guān)于逍遙散治療乳腺增生機(jī)制尚不明確。本課題組以網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)為基礎(chǔ)，構(gòu)建了“成分-疾病-通路-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)，直觀科學(xué)地分析了逍遙丸對(duì)乳腺增生的作用機(jī)制。

選取所得到的關(guān)鍵靶點(diǎn)的前5個(gè)分別是STAT3、AKT1、MAPK1、JUN、MAPK3。在人類基因自我更新過(guò)程中，STAT3發(fā)揮著重要的作用，陳英杰等[22]研究發(fā)現(xiàn) STAT3在乳腺增生和三陰性乳腺癌組織中顯著表達(dá)，并且其表達(dá)具有顯著差異。AKT1可以促進(jìn)正常乳腺細(xì)胞的生長(zhǎng)，抑制其凋亡，進(jìn)而對(duì)乳腺增生產(chǎn)生治療作用[23]。MAPK信號(hào)通路通過(guò)調(diào)節(jié)下游產(chǎn)物活性，影響炎癥細(xì)胞黏附血管內(nèi)皮、在炎癥部位激活并釋放炎癥因子以及凋亡過(guò)程[24]，從而在乳腺增生治療過(guò)程中發(fā)揮作用。其中 MAPK1能參與到早期乳腺組織的增殖分化過(guò)程中，在卵巢和乳腺上皮細(xì)胞中的研究表明抑制 MAPK1進(jìn)入細(xì)胞核會(huì)導(dǎo)致上皮細(xì)胞生長(zhǎng)受到抑制，下調(diào)的 MAPK1也容易促進(jìn)細(xì)胞凋亡[25-26]。上述這些靶點(diǎn)的明確為治療乳腺增生藥物新劑型和體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)研究提供了依據(jù)。

HTR2A、IL2、TOP2A、PCNA、MMP1為該藥治療乳腺增生的核心基因。王齊敏[27]通過(guò)沉默MMP-1基因，發(fā)現(xiàn)其可以抑制乳腺癌細(xì)胞的侵襲、增殖，進(jìn)而對(duì)三陰性乳腺癌治療作用。PCNA表達(dá)僅限于細(xì)胞核內(nèi)，是一種細(xì)胞增殖蛋白，可以反應(yīng)細(xì)胞增殖的活性[28]。很大一部分乳腺癌患者群體會(huì)擴(kuò)增或過(guò)量表達(dá)出 TOP2A型基因[29]。IL2在免疫調(diào)節(jié)中起著重要作用，其是輔助性 T淋巴細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子。Chulpanova[30]等通過(guò)研究發(fā)現(xiàn)細(xì)胞松弛素B誘導(dǎo)過(guò)表達(dá)IL2的的人間充質(zhì)干細(xì)胞膜泡能夠刺激CD8 T細(xì)胞殺傷三陰性乳腺癌細(xì)胞，說(shuō)明其在乳腺中有一定的表達(dá)并且能夠發(fā)揮抗癌作用。Hejazi[31]等以HTR2A等為指標(biāo)得出5-羥色胺受體拮抗劑可能成為治療乳腺癌細(xì)胞的新途徑，說(shuō)明 HTR2A在乳腺組織中有表達(dá)。由文獻(xiàn)及網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)結(jié)果可知，乳腺增生和乳腺癌有很密切的聯(lián)系，這也為乳腺癌預(yù)防及檢查提供了一定依據(jù)。

槲皮素（quercetin）、山奈酚（kaempferol）、葉黃素（luteolin）、柚皮素（naringenin）、甘草酮a（licochalcone a）為治療乳腺增生的關(guān)鍵成分。槲皮素是一種天然的黃酮醇類化合物，具有顯著的抗氧化作用，其可提高超氧化物歧化酶（SOD）活性，增強(qiáng)模式生物和非模式生物的氧化應(yīng)激能力[32]。山奈酚也是黃酮醇類化合物，且與槲皮素結(jié)構(gòu)相似，亦有抗氧化作用，具有消除自由基功能[33]。葉黃素是一種類胡蘿卜素，蘭芳[34]等研究發(fā)現(xiàn)葉黃素組小鼠組織內(nèi)超氧化物歧化酶（SOD）活性升高，進(jìn)而發(fā)揮抗氧化作用；可通過(guò)減少對(duì)免疫細(xì)胞細(xì)胞膜等的損害，提高免疫力；可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[35]，根據(jù)相關(guān)報(bào)道，對(duì)細(xì)胞增殖和凋亡的調(diào)節(jié)是中藥參與乳腺增生治療過(guò)程中的主要環(huán)節(jié)[36]。柚皮苷是一種天然雙氫黃酮類化合物，Song等[37]通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)推斷出柚皮苷能通過(guò)調(diào)節(jié)VEGF/VEGFR-2通路來(lái)激發(fā)血管再生，而乳腺增生需要的營(yíng)養(yǎng)大多從血管獲得，這與治療乳腺增生機(jī)制相違背，但是其亦有抗氧化、抗炎的藥理作用[38]，其在這過(guò)程中如何發(fā)揮作用是未來(lái)需要深入探討的。甘草查爾酮A屬于酚類查爾酮化合物，其具有抗氧化、抗炎、免疫促進(jìn)等藥理作用[39]，但是其對(duì)于乳腺組織及細(xì)胞的研究甚少，提示甘草查爾酮A對(duì)于乳腺增生的潛在治療機(jī)制是未來(lái)需要分析的新方向。

通過(guò)通路富集分析，逍遙丸可以通過(guò)干預(yù)糖尿病并發(fā)癥的 AGE-RAGE信號(hào)通路、TNF信號(hào)通路、IL-17信號(hào)通路、TH17細(xì)胞分化等信號(hào)通路發(fā)揮治療乳腺增生的作用。AGEs-RAGE軸調(diào)控的多條信號(hào)傳導(dǎo)通路[40]，包括氧化應(yīng)激、蛋白激酶C的活化、己糖胺途徑、多元醇途徑、脂質(zhì)代謝紊亂和炎癥反應(yīng)，其中氧化應(yīng)激、脂質(zhì)代謝、多元醇途徑涉及逍遙丸治療乳腺增生的生物過(guò)程。研究結(jié)果顯示，逍遙丸中的活性成分可能通過(guò) MAPK1、IL6、AKT1、MAPK3、STAT3等關(guān)鍵蛋白在AGE-RAGE信號(hào)通路發(fā)揮作用，從而治療乳腺增生。AGE-RAGE信號(hào)通路目前在治療糖尿病的過(guò)程中研究較多，對(duì)于乳腺增生過(guò)程中其作用機(jī)制研究甚少，有廣闊的探究空間。TNF為腫瘤壞死因子，對(duì)腫瘤細(xì)胞具有選擇性殺傷作用，參與全身的炎癥反應(yīng)，可通過(guò)調(diào)節(jié) IL-6水平、TNF-α水平達(dá)到調(diào)節(jié)免疫的效果，進(jìn)而參與乳腺增生的治療[41]。研究顯示逍遙丸活性成分可能通過(guò)作用于 MAPK1、JUN、MAPK3、MMP3、AKT1、IL-6等關(guān)鍵靶點(diǎn)及基因，靶向TNF信號(hào)通路調(diào)控相關(guān)炎癥因子的表達(dá)，發(fā)揮治療作用。IL-17A可以激活 NF-κB、MAPKs和 C/EBP級(jí)聯(lián)信號(hào)，使一系列炎癥因子的表達(dá)上調(diào)[42]，產(chǎn)生炎癥反應(yīng)。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)結(jié)果發(fā)現(xiàn)其活性成分可能作用于MMP1、MMP3、MAPK1、MAPK3、PTGS2 等關(guān)鍵靶點(diǎn)，進(jìn)而阻斷 IL-17信號(hào)通路，發(fā)揮抗炎作用。TH7細(xì)胞主要效應(yīng)因子是IL-17，研究結(jié)果顯示逍遙丸活性成分可能通過(guò)作用于 STAT1、STAT3、MAPK1等關(guān)鍵蛋白對(duì)TH17細(xì)胞分化信號(hào)通路產(chǎn)生影響，發(fā)揮治療作用，其發(fā)揮作用過(guò)程可能與 IL-17信號(hào)通路相同。通過(guò)上述分析可知，逍遙丸治療乳腺增生過(guò)程中主要作用機(jī)制是抗炎，還有一部分免疫調(diào)節(jié)和減輕氧化應(yīng)激反應(yīng)作用。但是對(duì)于性激素的調(diào)節(jié)并沒(méi)有表現(xiàn)出來(lái)，這提示我們雖然中藥有多成分、多靶點(diǎn)的特點(diǎn)，但是逍遙丸治療乳腺增生過(guò)程中可能抗炎作用占比較大。

綜上所述，逍遙丸中的槲皮素（quercetin）、山奈酚（kaempferol）、葉黃素（luteolin）可能通過(guò) STAT3、AKT1、MAPK1、HTR2A、IL2、MMP1等核心靶點(diǎn)和核心基因，對(duì)TNF信號(hào)通路、IL-17信號(hào)通路、TH17細(xì)胞分化等信號(hào)通路進(jìn)行調(diào)節(jié)，來(lái)增強(qiáng)氧化應(yīng)激能力、提高免疫力、抗炎、調(diào)控細(xì)胞凋亡等，發(fā)揮對(duì)乳腺增生的治療作用。本研究表明逍遙丸可能通過(guò)多成分、多靶點(diǎn)、多通路抑制乳腺增生的發(fā)生、發(fā)展，為本課題組研究逍遙丸治療婦科疾病提供依據(jù)和理論基礎(chǔ)。