短時(shí)高壓電場處理對(duì)萌發(fā)甜蕎γ-氨基丁酸積累的影響

楊尚儒，辛鎮(zhèn)忠，王 越，王 愈

（山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，山西 太谷 030801）

蕎麥（Buckwheat），屬于蓼科（Polygonaceae）蕎麥屬（Fagopyrum）。主要有甜蕎（F. esculentum Moench）與苦蕎（F. tataricum）兩個(gè)栽培品種，在我國乃至世界范圍都有廣泛種植。甜蕎是一種常見的營養(yǎng)豐富的雜糧，其中的GABA對(duì)人體有著重要調(diào)控功能。在脊椎動(dòng)物體內(nèi)，GABA作為抑制性神經(jīng)遞質(zhì)，可以降低神經(jīng)元活性，并與腦部抗焦慮受體結(jié)合，在其他物質(zhì)的協(xié)調(diào)作用下達(dá)到鎮(zhèn)靜神經(jīng)改善腦功能的作用[1]。國內(nèi)外多項(xiàng)研究表明：糙米、黑米等谷物、大豆、綠豆等豆類及苦蕎和大麥等麥類經(jīng)萌發(fā)后GABA含量會(huì)得到提升[2]。高立城等的研究表明，甜蕎經(jīng)萌發(fā)后氨基酸種類不發(fā)生變化，但部分氨基酸含量會(huì)上升；黃酮含量表現(xiàn)出先下降后上升的趨勢；蛋白質(zhì)含量呈現(xiàn)先上升后下降后又上升的趨勢；脂肪和淀粉表現(xiàn)出整體下降的趨勢[3]。種子萌發(fā)后生理活性增加，多種代謝途徑激活，與未經(jīng)萌發(fā)處理的種子相比，營養(yǎng)成分發(fā)生改變，包括GABA在內(nèi)的多種功能性成分含量提升，而部分抗?fàn)I養(yǎng)因子含量降低[4]。GAD是影響甜蕎萌發(fā)過程中GABA積累的主要酶，甜蕎經(jīng)萌發(fā)后生物活性提高、多種酶被激活，GAD催化甜蕎籽粒中的L-谷氨酸轉(zhuǎn)化為GABA；GABA經(jīng)過GABA-T的催化形成琥珀酸半醛（SSA）；SSA進(jìn)一步被SSADH催化形成琥珀酸并進(jìn)入三羧酸循環(huán)，這個(gè)流程被稱為GABA支路[5]。合適的萌發(fā)處理?xiàng)l件可以提高相關(guān)酶活性，從而影響到GABA支路，從而提高了甜蕎萌發(fā)過程中產(chǎn)生GABA的能力。

地球自身存在一定的電場，以大氣層為零電勢，地面平均電場強(qiáng)度為-130 V/m。地球的電場本身對(duì)生物的生長代謝有著一定影響。國內(nèi)外幾乎沒有關(guān)于使用高壓電場處理甜蕎促進(jìn)其萌發(fā)后GABA積累的研究，但是多項(xiàng)研究表明，外加高壓電場處理會(huì)影響到植物種子的萌發(fā)、生長等[6]。徐佳楠等發(fā)現(xiàn)通過高壓電場處理可以促進(jìn)菠菜新、陳種子萌發(fā)，并得到低場強(qiáng)處理效果不明顯、過高場強(qiáng)處理抑制菠菜種子萌發(fā)的結(jié)論[7]。高壓電場可以通過改變酶的高級(jí)結(jié)構(gòu)，影響酶活性的高低，進(jìn)一步影響到植物的生理代謝[8]，王莘等使用高壓電場對(duì)月見草進(jìn)行處理，結(jié)果表明電場處理使過氧化物酶同工酶活性增強(qiáng)，對(duì)生物膜保護(hù)作用增強(qiáng)，并且可以促進(jìn)新蛋白合成和胚發(fā)育[9]。胡建芳等通過高壓電場處理高粱種子，結(jié)果表明適宜的電場處理可以提高高粱種子內(nèi)α-淀粉酶、SOD、POD的活性[10]。

在國內(nèi)，甜蕎主要是制粉后作為原料制作面條、小吃等，而且有了方便蕎麥面條、碗團(tuán)等可工廠化生產(chǎn)的產(chǎn)品，但是這類產(chǎn)品特點(diǎn)在于方便，在營養(yǎng)及功能性方面有著極大的提升空間。甜蕎經(jīng)短期萌發(fā)后便于制粉且營養(yǎng)性得到提高，通過試驗(yàn)中方法處理甜蕎使得其 GABA含量得到提升，以處理后的甜蕎為原料制得的產(chǎn)品在不影響原產(chǎn)品口感、外形等品質(zhì)的前提下具有更高的營養(yǎng)價(jià)值，可產(chǎn)生更多的經(jīng)濟(jì)效益，而且符合現(xiàn)代人的飲食理念。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

甜蕎：內(nèi)蒙古赤峰；GABA標(biāo)準(zhǔn)品：北京索萊寶科技有限公司；四硼酸鈉（分析純）：天津市北辰方正試劑廠；次氯酸鈉溶液（分析純）：天津市天力化學(xué)試劑有限公司；重蒸苯酚（分析純）：上海藍(lán)季科技有限公司；無水乙醇（分析純）：北京華騰化工有限公司；植物谷氨酸脫羧酶（GAD）ELISA試劑盒：江蘇晶美生物科技有限公司；植物GABA轉(zhuǎn)氨酶（GABA-T）ELISA試劑盒、植物琥珀酸半醛脫氫酶（SSADH）ELISA試劑盒：江蘇酶免實(shí)業(yè)有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

高壓直流電源（0 V～-30 KV）：天津市東文高壓電源廠；LDZ5-2型低速自動(dòng)平衡離心機(jī)：北京雷勃爾離心機(jī)有限公司；P4型分光光度計(jì)：上海美譜達(dá)儀器有限公司；LRHS-250-Ⅱ型恒溫恒濕培養(yǎng)箱：上海躍進(jìn)醫(yī)療器械有限公司；多功能粉碎機(jī)：北京科偉永興儀器有限公司；KQ-250DE型超聲波清洗器：昆山市超聲儀器有限公司；424R型冷凍離心機(jī)：德國 eppendorf公司；SpectraMax iD5-多功能酶標(biāo)儀：美谷分子儀器（上海）有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 甜蕎處理方式及指標(biāo)測定

挑選顆粒完整、大小均勻的甜蕎籽粒，之后清水淘洗，并加入約甜蕎籽粒二倍體積的自來水，并在預(yù)先設(shè)置的符合試驗(yàn)條件的溫度下浸泡數(shù)小時(shí)。甜蕎籽粒經(jīng)浸泡后吸水膨脹，更利于萌發(fā)。將浸泡過后的甜蕎籽粒用清水沖洗，洗去表面粘液與浮沫。沖洗過的甜蕎籽粒平鋪于塑料托盤并覆蓋上濕紗布以保證萌發(fā)過程中的水分。將盛有試驗(yàn)樣品的托盤放置于設(shè)好溫度與濕度的恒溫恒濕培養(yǎng)箱中，設(shè)置溫度為 25 ℃，濕度為 80%。培養(yǎng)0、8、16、24、32、40 h后取出甜蕎樣品放置于-80 ℃冰箱待測。需干燥的樣品利用真空冷凍干燥機(jī)凍干，之后使用多功能粉碎機(jī)粉碎，粉碎時(shí)間為1 min，待粉碎機(jī)冷卻徹底后進(jìn)行下一批樣品粉碎，樣品粉末過80目篩。得到的樣品粉末用塑封袋密封、避光保存，以待測定。

GABA易溶于水，微溶于乙醇等有機(jī)溶劑，可利用蒸餾水對(duì)樣品粉末中的GABA進(jìn)行提取。稱取3 g樣品粉末，加水混勻后定容至30 mL。將制得的樣品混合溶液用蒸餾水在 35 ℃的條件下超聲波震蕩提取 30 min，之后利用離心機(jī)在5 000 r/min的條件下離心20 min，取甜蕎樣品提取液上清液備測。GABA與常規(guī)氨基酸在Berthelot反應(yīng)中的響應(yīng)差別巨大，利用Berthelot反應(yīng)進(jìn)行測定[11]。取300 μL甜蕎樣品提取液，加入0.1 mol/L四硼酸氫鈉緩沖液200 μL，6%重蒸苯酚400 μL，7.5%次氯酸鈉 600 μL。沸水浴 10 min，后冰浴5 min，期間不斷搖晃，最后加入60%乙醇2 mL。在波長645 nm處測量吸光度。

酶活性利用酶聯(lián)免疫試劑盒中相應(yīng)方法測定。

1.3.2 高壓電場搭建及處理方式

試驗(yàn)中采用的高壓電場由實(shí)驗(yàn)室自行搭建。高壓電場的電極板使用表明平整光潔的不銹鋼板并涂抹不銹鋼漆制成，極板長1.5 m、寬0.8 m，將極板平行放置于木質(zhì)的多層結(jié)構(gòu)。將其中一片極板與高壓直流電源相接，其臨近的極板與地線相接，當(dāng)電源接通后兩極板間形成一個(gè)高壓電場。高壓電場運(yùn)行工作時(shí)產(chǎn)生的高壓會(huì)對(duì)空氣有電離作用，并會(huì)產(chǎn)生臭氧，故高壓電場的工作環(huán)境要干燥且通風(fēng)良好。

經(jīng)浸泡處理后的甜蕎籽粒需及時(shí)進(jìn)行高壓電場處理，將浸泡吸漲后的甜蕎籽粒平鋪于托盤并覆蓋濕潤的紗布保證其濕度，托盤放置于電場的電極板之間，且盡量放于極板中間位置，減少邊界效應(yīng)的影響。之后接通電源，調(diào)整合適的輸出電壓，處理一段時(shí)間后關(guān)閉電源，將處理后的甜蕎轉(zhuǎn)入合適的培養(yǎng)環(huán)境。

1.4 數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)重復(fù) 3次，數(shù)據(jù)處理使用 IBM SPSS Statistics 23.0軟件。

2 結(jié)果與分析

2.1 高壓電場處理對(duì)甜蕎萌發(fā)后 GABA含量的影響

2.1.1 電場強(qiáng)度和方向?qū)ABA含量的影響

甜蕎籽粒在35 ℃條件下浸泡3 h，甜蕎籽粒為菱形，模擬實(shí)際生產(chǎn)，浸泡后的甜蕎自由散落后側(cè)躺于平面，電場方向垂直于地面。使用電場強(qiáng)度為 0，0.5，1.0，1.5 KV/cm 及-0.5，-1.0，-1.5 KV/cm的高壓電場分別處理30 min，經(jīng)電場處理后的甜蕎在溫度25 ℃，濕度80%的條件下培養(yǎng)24 h，以電場強(qiáng)度0 KV/cm處理組為空白對(duì)照組。試驗(yàn)結(jié)果如圖1所示。在相同電場強(qiáng)度下不同場強(qiáng)方向處理后的甜蕎中GABA含量差異不顯著（P＜0.05）。對(duì)照組GABA含量（171.68±0.45） mg/100 g，場強(qiáng)0.5 KV/cm處理組GABA含量（181.82±1.37） mg/100 g，場強(qiáng)1.0 KV/cm處理組GABA含量（190.18±1.37） mg/100 g，1.5 KV/cm 處理組 GABA 含量（192.12±0.52）mg/100 g。電場處理組與空白對(duì)照組相比GABA含量差異顯著（P＜0.05）；場強(qiáng)0.5 KV/cm處理組與場強(qiáng)1.0 KV/cm處理組差異顯著（P＜0.05）；場強(qiáng)1.0 KV/cm處理組與場強(qiáng)1.5 KV/cm處理組差異不顯著（P＜0.05）。試驗(yàn)結(jié)果表明：外加高壓電場可以顯著提高甜蕎萌發(fā)過程中產(chǎn)生 GABA的能力。在一定電場強(qiáng)度范圍內(nèi)，隨著場強(qiáng)的增加，甜蕎萌發(fā)后GABA含量越高，但是當(dāng)外加電場強(qiáng)度到達(dá)一定程度時(shí)（1.0 KV/cm～1.5 KV/cm）GABA的含量無顯著提升；試驗(yàn)還表明電場方向?qū)ψ杂缮⒙浜髠?cè)臥的甜蕎萌發(fā)過程中產(chǎn)生GABA的含量無顯著影響。

圖1 電場強(qiáng)度對(duì)萌發(fā)后甜蕎中GABA含量的影響Fig. 1 Effect of electric field intensity on GABA content in buckwheat after germination

2.1.2 電場處理時(shí)間對(duì)GABA含量的影響

甜蕎浸泡后在1.0 KV/cm的電場中處理不同時(shí)間，試驗(yàn)結(jié)果如圖2所示。在30～60 min處理組間甜蕎中 GABA含量差異不顯著（P<0.05）；15 min處理組與 60 min處理組差異顯著（P<0.05）。高壓電場處理時(shí)間30 min以上時(shí)，外加高壓電場處理的時(shí)間對(duì)甜蕎中GABA的含量無顯著影響。試驗(yàn)結(jié)果表明：甜蕎經(jīng) 1.0 KV/cm的電場處理30 min以上，其GABA含量得到顯著提升。

圖2 電場處理時(shí)間對(duì)萌發(fā)后甜蕎中GABA含量的影響Fig. 2 Effect of electric field treatment time on GABA contentin buckwheat after germination

2.1.3 電場處理后甜蕎萌發(fā)40 h內(nèi)GABA含量的變化

由試驗(yàn)2.1.1、2.1.2可知使用1.0 KV/cm高壓電場處理30 min，在節(jié)能的同時(shí)也能夠?qū)μ鹗w中GABA的富集達(dá)到最優(yōu)效果。在該條件下對(duì)浸泡后的蕎麥處理，同時(shí)設(shè)置未經(jīng)高壓電場處理的甜蕎為對(duì)照組，每隔8 h取樣一次，測定其40 h內(nèi)GABA含量變化，結(jié)果如圖3所示。甜蕎在萌發(fā)40 h內(nèi)其 GABA含量呈現(xiàn)出先上升后下降的趨勢，且在24 h含量達(dá)到最高，此時(shí)未處理組甜蕎GABA含量為（184.38±0.46） mg/100 g，電場處理組中甜蕎 GABA 含量達(dá)到（195.49±0.81）mg/100 g。在甜蕎萌發(fā)16 h后，甜蕎中GABA含量顯著提高（P＜0.05），高壓電場處理組中GABA含量顯著高于對(duì)照組（P＜0.05）。甜蕎萌發(fā) 24 h后GABA含量開始降低。

圖3 電場處理后甜蕎萌發(fā)40 h內(nèi)GABA含量的變化Fig. 3 Changes of GABA content in buckwheat after electric field treatment within 40 h of germination

2.2 電場處理對(duì)甜蕎 GABA合成相關(guān)酶類活性的影響

2.2.1 電場處理對(duì)甜蕎萌發(fā)過程中 GAD活性的影響

GAD可以促進(jìn)甜蕎萌發(fā)過程中 GABA的合成。使用1.0 KV/cm高壓電場處理甜蕎30 min，并對(duì)其萌發(fā)40 h內(nèi)GAD活性進(jìn)行測定，結(jié)果如圖4所示。經(jīng)高壓電場處理后的甜蕎萌發(fā)40 h內(nèi)GAD 活性整體高于未處理組（P＜0.05）；甜蕎在浸泡后GAD有著較高活性，萌發(fā)初期GAD活性降低，之后不斷提高，在萌發(fā)24～32 h期間GAD活性較高，32 h后GAD活性降低。高壓電場處理對(duì)甜蕎中GAD活性影響主要表現(xiàn)在萌發(fā)初期，經(jīng)處理后甜蕎在萌發(fā)初期 GAD活性要明顯高于對(duì)照組；萌發(fā)40 h內(nèi)甜蕎中GAD活性也與甜蕎中GABA的含量表現(xiàn)出相關(guān)性。

圖4 電場處理對(duì)甜蕎萌發(fā)過程中GAD活性影響Fig. 4 Effect of electric field treatment on GAD activity during germination of buckwheat

2.2.2 電場處理對(duì)甜蕎萌發(fā)過程中GABA-T活性的影響

GABA-T促進(jìn)甜蕎中 GABA分解轉(zhuǎn)化為SSA。使用1.0 KV/cm高壓電場處理甜蕎30 min，并對(duì)其萌發(fā)40 h內(nèi)GABA-T活性進(jìn)行測定，結(jié)果如圖5所示。對(duì)于高壓電場處理組，萌發(fā)0～16 h期間，處理組甜蕎中的GABA-T活性要顯著高于對(duì)照組（P＜0.05），但是未對(duì)該階段甜蕎萌發(fā)過程中GABA的整體積累有降低作用，推測其活性變高是由于電場處理提高了萌發(fā)初期 GAD活性并促進(jìn)GABA的積累，大量GABA的產(chǎn)生刺激了相關(guān)代謝而促進(jìn)了GABA-T活性的提高；在萌發(fā)16 h后GABA-T活性急劇降低，并且在萌發(fā)24～40 h期間處理組中 GABA-T活性要顯著低于對(duì)照組（P＜0.05），這利于甜蕎萌發(fā)中后期 GABA 的積累。對(duì)照組中GABA-T活性呈現(xiàn)出較為規(guī)律的先上升后降低的趨勢。

圖5 電場處理對(duì)甜蕎萌發(fā)過程中GABA-T活性影響Fig. 5 Effect of electric field treatment on GABA-T activity during germination of buckwheat

2.2.3 電場處理對(duì)甜蕎萌發(fā)過程中 SSADH活性的影響

SSADH是參與 GABA代謝支路最后環(huán)節(jié)的酶。使用1.0 KV/cm高壓電場處理甜蕎30 min，并對(duì)其萌發(fā)40 h內(nèi)SSADH活性進(jìn)行測定，結(jié)果如圖6所示。高壓電場處理組甜蕎中SSADH活性整體低于對(duì)照組。在處理組中，8～16 h期間SSADH活性明顯提高，推測是由于在該階段GABA-T活性較高，大量生成的SSA使得SSADH活性提高來將 SSA轉(zhuǎn)化為琥珀酸，之后隨著GABA-T活性降低，SSA合成減少，SSADH活性降低；對(duì)照組中GABA-T在24～40 h期間保持較高活性，在此期間 SSADH活性要顯著高于處理組（P＜0.05）。

圖6 電場處理對(duì)甜蕎萌發(fā)過程中SSADH活性影響Fig. 6 Effect of electric field treatment on SSADH activity during buckwheat germination

2.3 分析討論

多項(xiàng)研究表明，外加高壓電場處理可以影響到植物細(xì)胞結(jié)構(gòu)，促進(jìn)植物細(xì)胞受損結(jié)構(gòu)修復(fù)、增加細(xì)胞活性。外加高壓電場可以改變酶的高級(jí)結(jié)構(gòu)，進(jìn)一步影響到其活性。水分子團(tuán)處于一種大分子團(tuán)解締為小分子團(tuán)，小分子團(tuán)締結(jié)為大分子團(tuán)的過程，高壓電場極有可能打破這一平衡，活化了水分子團(tuán)，水作為生物體內(nèi)各種反應(yīng)的介質(zhì)，其性質(zhì)的改變會(huì)影響到相關(guān)酶促反應(yīng)的速率。此外，高壓電場會(huì)使水中產(chǎn)生過量超氧陰離子自由基，超氧陰離子自由基可以增加植物細(xì)胞膜通透性，除了增加籽粒對(duì)外界水、無機(jī)鹽、氧、氮等的吸收，還可以激活部分相關(guān)酶系的調(diào)控基因，加速種子萌發(fā)代謝[9]。本試驗(yàn)中，外加高壓電場處理組與未處理組相比，甜蕎經(jīng)萌發(fā)后GABA的含量顯著提升，證明合適條件的高壓電場處理可以提高甜蕎萌發(fā)過程中產(chǎn)生GABA的能力。試驗(yàn)中高壓電場對(duì)GABA代謝支路中的多種酶類產(chǎn)生影響，促進(jìn)了甜蕎萌發(fā)過程GABA的積累。郝建雄等的研究表明甜蕎在萌發(fā)2 d以內(nèi)其GAD活性較高，之后 GAD活性下降明顯[12]。部分研究表明通過 Ca2+或 H2O2等化學(xué)試劑脅迫及真空處理也可以促進(jìn)谷物中GABA或是其他營養(yǎng)成分的積累[13-14]。

3 結(jié)論

甜蕎萌發(fā)后GABA含量隨著電場處理時(shí)電場強(qiáng)度增加得到提升，但在場強(qiáng)到達(dá)一定強(qiáng)度（1.0～1.5 KV/cm）后無法繼續(xù)提高，且電場方向?qū)ψ杂缮⒙浜髠?cè)躺狀態(tài)的甜蕎中GABA含量無顯著影響（P＜0.05）；電場處理處理30～60 min間甜蕎 GABA 含量無顯著差異（P＜0.05）。由試驗(yàn)可得處理甜蕎的最佳條件為使用1.0 KV/cm高壓處理30 min。甜蕎浸泡處理后外加場強(qiáng)1.0 KV/cm的高壓電場處理30 min，之后在溫度25 ℃，濕度80%條件下萌發(fā)24 h。經(jīng)該方式處理后甜蕎中GABA含量達(dá)到（195.49±0.81） mg/100 g，對(duì)照組中甜蕎GABA含量達(dá)到（184.38±0.46） mg/100 g，差異顯著（P＜0.05）。

高壓電場處理會(huì)影響到甜蕎GABA代謝支路中酶的活性。電場處理后甜蕎萌發(fā)過程中 GAD的活性得到提高；GABA-T活性萌發(fā)前期得到提升，中后期顯著降低；電場處理對(duì) SSADH活性整體表現(xiàn)出抑制作用。萌發(fā)過程中甜蕎GABA含量與GAD活性表現(xiàn)出一定的相關(guān)性，證實(shí)GAD是影響甜蕎萌發(fā)過程中GABA積累的主要酶類，同時(shí)也表明高壓電場通過影響GABA支路相關(guān)酶類活性來達(dá)到對(duì)甜蕎萌發(fā)過程中GABA的富集。