DICR基因多態(tài)性與變異性哮喘易感性的研究

林祥曉 丁宇 張雪梅

隨著分子生物學(xué)和基因?qū)W的發(fā)展，對(duì)于變異性哮喘易感性患者的研究逐漸深入，發(fā)現(xiàn)患者基因多態(tài)性表型以及等位基因頻率與變異性哮喘易感性的發(fā)生有密切聯(lián)系，基因通過信號(hào)傳導(dǎo)作用于機(jī)體免疫細(xì)胞，下調(diào)免疫細(xì)胞活性，從而導(dǎo)致免疫系統(tǒng)紊亂，導(dǎo)致氣道高反應(yīng)，進(jìn)而導(dǎo)致咳嗽遷延不愈，呼吸困難，嚴(yán)重影響患者正常生活[1-2]。樹突狀細(xì)胞免疫受體(Dendritic cell immune receptor，DICR)能夠平衡粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子信號(hào)通路，調(diào)節(jié)樹突狀細(xì)胞生長(zhǎng)周期，DICR受體缺失鼠模型中DC細(xì)胞過度增殖上調(diào)免疫應(yīng)答而加重哮喘癥狀，DICR受體也成為哮喘治療的新靶點(diǎn)[3-4]。本研究對(duì)本院52例變異性哮喘易感性患者展開隨機(jī)對(duì)照，探究DICR基因多態(tài)性與變異性哮喘發(fā)生的相關(guān)性。

資料與方法

一、一般資料

選取2018年7月―2019年2月期間本院收治的52例變異性哮喘易感性患者作為哮喘組，其中男24例，女28例，年齡19～48歲，平均年齡(27.34±2.26)歲。并選取同期的40例健康者作為健康者組，其中男15例，女25例，年齡19～48歲，平均年齡(28.16±2.43)歲。2組性別(χ2=0.693，P=0.405)、年齡(t=1.670，P=0.099)等均線資料較為接近，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。

納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)經(jīng)診斷符合變異性哮喘診斷標(biāo)準(zhǔn)，年齡>18歲；(2)無嚴(yán)重心、肝、腎功能障礙者；(3)無全身性免疫性疾病者；(4)患者及家屬同意并簽署知情通知書者。

排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)合并血液系統(tǒng)疾病者；(2)合并全身性慢性疾病者；(3)孕婦哺乳期婦女；(4)不配合基因多態(tài)性檢測(cè)研究者。研究獲我院倫理研究委員會(huì)批準(zhǔn)。

二、方法

DICR基因檢測(cè)：引物均由美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)公司合成，采用Gene Amp9300定量聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)儀(ABI)進(jìn)行SNP檢測(cè)及終點(diǎn)讀序。使用常規(guī)序列引物，確定DICR基因有TT、TC、CC基因型分布，引物稀釋冷藏處理后待PCR擴(kuò)增，PCR體系采用美國(guó)erkin．Elmer公司引物合成，采用SYBR Green實(shí)時(shí)定量PCR擴(kuò)增法及標(biāo)準(zhǔn)曲線法進(jìn)行相對(duì)定量分析(ABI實(shí)時(shí)定量PCR 7300)，確定DICR基因T、C兩種等位基因分布頻率。

三、觀察指標(biāo)

1 2組研究對(duì)象DICR基因rs2377422位點(diǎn)基因型和等位基因頻率分布 根據(jù)DICR 基因檢測(cè)結(jié)果分別統(tǒng)計(jì)DICR基因 TT、TC、CC型和T、C兩種等位基因頻率在2組研究對(duì)象中的分布情況。

2 2組研究對(duì)象DICR基因rs10840759位點(diǎn)基因型和等位基因頻率分布 根據(jù)PCR擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)果統(tǒng)計(jì)2組研究對(duì)象DICRT、C兩種等位基因頻率的分布情況。

3 變異型哮喘易感性與DICR基因相關(guān)性 采用Pearson對(duì)2組研究對(duì)象的DICR基因型和等位基因進(jìn)行相關(guān)性分析。

四、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 19.0分析，計(jì)數(shù)資料以n(%)來表示，采用χ2檢驗(yàn)；多組相關(guān)性分析采用雙側(cè)檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、2組DICR基因型比較

DICR基因rs2377422位點(diǎn)基因型中，2組研究對(duì)象TT型和CC型基因分布頻率差異顯著，哮喘患者組T型和C型基因型分布頻率顯著高于健康組(P<0.05)，而2組研究對(duì)象DICR基因rs2377422位點(diǎn)T型和C型等位基因分布頻率無明顯差異P>0.05(見表1)。

表1 2組DICR基因rs2377422位點(diǎn)基因型和等位基因頻率分布比較[n(%)]

二、2組DICR基因rs10840759位點(diǎn)分布頻率比較

DICR基因rs10840759位點(diǎn)基因型中，2組研究對(duì)象T型和C型基因型分布頻率無明顯差異顯著(P>0.05)，而2組研究對(duì)象T型等位基因分布頻率存在顯著差異，哮喘患者組T型基因分布頻率顯著高于健康組(P<0.05)，而T型等位基因分布頻率無明顯差異顯著(P>0.05)見表2。

表2 2組DICR基因rs10840759位點(diǎn)基因型和等位基因頻率分布比較[n(%)]

三、變異型哮喘易感性與DICR基因相關(guān)性比較

對(duì)與變異性哮喘相關(guān)基因型采用雙側(cè)檢驗(yàn)，結(jié)果顯示，DICR基因rs2377422位點(diǎn)下基因型與變異型哮喘易感性具有相關(guān)性(P=0.004，95%CI：1.135～1.647)，而rs10840759位點(diǎn)下等位基因與變異型哮喘易感性具有相關(guān)性(P=0.015，95%CI：1.158～1.322)(見表3)。

表3 變異型哮喘易感性與DICR基因相關(guān)性

討 論

變異型哮喘是一種復(fù)雜的多基因遺傳性疾病，因咳嗽和呼吸困難，易導(dǎo)致人體多臟器功能不全或功能衰竭，威脅患者生命安全[5-6]。易感性主要由基因決定，變異型哮喘易感性患者因遺傳基因?qū)γ庖哒{(diào)節(jié)作用下降，其患病風(fēng)險(xiǎn)增加，因此，對(duì)哮喘易感基因的研究成為遺傳學(xué)的一個(gè)重要方面。樹突狀細(xì)胞免疫受體(DICR)是一個(gè)主要表達(dá)于樹突狀細(xì)胞上的C型凝集素，是一種跨膜蛋白，其外部有一個(gè)碳化化合物結(jié)合域，內(nèi)部有一個(gè)傳達(dá)反饋信號(hào)區(qū)域，其結(jié)構(gòu)決定DICR在免疫反應(yīng)中具有調(diào)節(jié)樹突狀細(xì)胞調(diào)作用[7-8]。在基因敲除小鼠試驗(yàn)中證實(shí)，DICR在自身免疫性疾病中具有負(fù)反饋調(diào)節(jié)作用[9-10]。本次研究也同樣證實(shí)，DICR基因在變異型哮喘易感性發(fā)生中具有重要聯(lián)系，變異型哮喘患者DICR基因T型攜帶者比例更高。因此，對(duì)變異型哮喘患者進(jìn)行基因檢測(cè)，有助于指導(dǎo)基因調(diào)節(jié)治療。

DICR基因位于人體12號(hào)染色體p13區(qū)域，是樹突狀細(xì)胞表面表達(dá)的一類C型凝集素受體，DICR分子結(jié)構(gòu)具有細(xì)胞膜外的糖鏈識(shí)別區(qū)(CRD)和細(xì)胞膜內(nèi)的酪氨酸依賴的抑制型基序(ITIM)兩部分，其ITIM的抑制性結(jié)構(gòu)，可特異性的與酪氨酸磷酸酶SHP-1和SHP-2結(jié)合，從而向細(xì)胞內(nèi)傳遞抑制性信號(hào)，達(dá)到下調(diào)細(xì)胞活性的作用[11-12]。因此，DCIR被認(rèn)為是細(xì)胞內(nèi)部傳達(dá)抑制信號(hào)的負(fù)調(diào)節(jié)受體。而研究通過2組研究對(duì)象DICR基因型比較發(fā)現(xiàn)，2組研究對(duì)象DICR基因中rs2377422位點(diǎn)T型和C型基因型分布頻率顯著高于對(duì)照組，說明變異型哮喘患者DICR基因中TT型、CC型攜帶比例更高，提示DICR基因中T型、C型對(duì)變異型哮喘的發(fā)生具有一定促進(jìn)作用[13-14]。而2組研究對(duì)象DICR基因等位基因分布頻率比較發(fā)現(xiàn)，DICR基因中rs10840759位點(diǎn)2組研究對(duì)象T型和C型等位基因分布頻率無明顯差異，而在rs10840759位點(diǎn)2組研究對(duì)象T型等位基因分布頻率存在顯著差異，哮喘患者組T型等位基因攜帶者所占比例(51.92%)顯著高于健康者(30.00%)，說明DICR基因中T型等位基因是變異型哮喘易感性發(fā)生的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，DCIR SNP rs2377422與變異型哮喘發(fā)病易感相關(guān)。DICR缺失會(huì)導(dǎo)致樹突狀細(xì)胞重要調(diào)節(jié)細(xì)胞因子粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落，從而刺激因子(GM-CSF)的信號(hào)表達(dá)增強(qiáng)，進(jìn)而導(dǎo)致樹突狀細(xì)胞過度累積，誘發(fā)免疫性疾病[15-17]。而樹突狀細(xì)胞是一種抗原呈遞細(xì)胞，樹突狀細(xì)胞的異常增殖或激活，會(huì)影響自身免疫反應(yīng)，因此，其表達(dá)免疫應(yīng)答中發(fā)揮重要作用[18-19]。另外，經(jīng)相關(guān)性分析顯示，DICR基因中基因型(P=0.004，95%CI：0.918～1.025)和等位基因(P=0.015，95%CI：0.923～1.322)與變異型哮喘易感性相關(guān)，也證實(shí)DICR在免疫疾病中的調(diào)節(jié)作用。哮喘患者因氣道炎癥反應(yīng)導(dǎo)致。機(jī)體炎性細(xì)胞因子被激活分泌，導(dǎo)致機(jī)體免疫反應(yīng)紊亂，患者免疫力低下，易敏性風(fēng)險(xiǎn)增加，而DICR基因免疫調(diào)節(jié)可促進(jìn)患者以免疫力提高，進(jìn)而一定程度上降低變異型哮喘易感性的發(fā)生[20-21]。臨床可通過激活DICR抑制樹突狀細(xì)胞過度增殖，為DICR配體治療藥物提供基礎(chǔ)。但是，研究中樣本對(duì)象較少，加上基因表達(dá)的個(gè)體差異，且DICR基因只是變異型哮喘遺傳和免疫研究的一小部分，且遺傳機(jī)制較為復(fù)雜，涉及多個(gè)基因，因此還需擴(kuò)大樣本進(jìn)行進(jìn)一步深入研究，進(jìn)一步探究基因多態(tài)性在變異性哮喘易感性發(fā)生機(jī)制的意義，為臨床指導(dǎo)治療提供可靠依據(jù)[22-23]。

綜上所述，DCIR基因檢測(cè)，通過深入了解其基因型和等位基因頻率的分布和表達(dá)情況，找到其基因多態(tài)性與變異性哮喘易感性的內(nèi)在因素，為早期發(fā)現(xiàn)和基因調(diào)控治療提供了可能性和參考意義。