孔雀組織滴蟲與沙門氏菌混合感染的診斷與分析

王自豪，陳政諭，黃春花，曹樹威，吳翠蘭，楊啟晟，向 雷，滕少花，吳柱月

（1.廣西畜牧研究所，南寧 530001；2.廣西獸醫(yī)研究所/廣西獸醫(yī)生物技術(shù)重點實驗室，南寧 530001）

孔雀屬于鳥綱雞形目雉科孔雀屬，具有觀賞價值和研究價值，人工飼養(yǎng)的孔雀還有食用價值［1］?；痣u組織滴蟲屬于鞭毛蟲綱單鞭毛科組織滴蟲屬的寄生原蟲，主要寄生在孔雀、野雞、火雞、雞、鵪鶉等禽類的肝臟和盲腸，引起禽類的組織滴蟲?。?，3］。該病一年四季均可發(fā)生，春季及夏季更易發(fā)病?；疾〉那蓊愔饕憩F(xiàn)為精神萎靡，厭食，羽毛蓬亂無光澤，下痢、糞便惡臭呈暗綠色或淡黃色，盲腸腫脹、出血、充血，肝臟表面有黃白色或黃褐色壞死灶［4］。沙門氏菌屬于腸桿菌科沙門菌屬成員，革蘭氏染色為陰性桿菌。沙門氏菌可引起多種動物和人的沙門氏菌病，該病一年四季均可發(fā)生，尤其在多雨潮濕、圈舍污穢、擁擠、通風(fēng)不良時多發(fā)，常呈散發(fā)或地方性流行［5］?；忌抽T氏菌病的禽類主要表現(xiàn)為下痢，肝臟腫大，有灰黃色壞死灶，腸壁腫脹、充血等?？兹傅挠^賞價值、研究價值和食用價值走進(jìn)人們的視野，孔雀的養(yǎng)殖數(shù)量也不斷增加，隨著而來的疾病也呈現(xiàn)上升趨勢，給養(yǎng)殖戶帶來重大的經(jīng)濟(jì)損失。對送檢的病死孔雀進(jìn)行臨床診斷和實驗室診斷，確診病例是由組織滴蟲和沙門氏菌混合感染引起的。該研究可以指導(dǎo)臨床用藥，為該病的防控提供參考。

1 材料與方法

1.1 病料樣品與試驗動物

1 例病死孔雀來源于廣西某養(yǎng)殖場；6 周齡健康昆明鼠10 只，購自廣西醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心。

1.2 主要試劑和儀器

麥康凱瓊脂培養(yǎng)基、TSA 瓊脂培養(yǎng)基，購自北京路橋生物科技有限公司；PCR 儀，購自天根生化科技（北京）有限公司；通用型柱式基因組DNA 提取試劑盒、2×TaqMasterMix 等，均購自北京康為世紀(jì)生物技術(shù)有限公司等。

1.3 臨床觀察

通過問診了解孔雀的發(fā)病情況，剖檢病變觀察獲取更多信息。

1.4 鏡檢觀察

刮取盲腸黏膜制作懸滴片和盧氏碘液染色，觀察蟲體。

1.5 細(xì)菌分離鑒定

無菌采取病死孔雀的肝臟接種于麥康凱瓊脂平板和TSA 瓊脂平板上，37 ℃培養(yǎng)24 h，觀察菌落的生長。

1.6 PCR 擴(kuò)增

1.6.1 核糖體18S rDNA 序列的擴(kuò)增和分析 取肝臟等病變組織，按照通用型柱式基因組DNA 提取試劑盒說明書提取DNA，置-20 ℃保存，備用。按照馬驍驍?shù)龋?］方法合成18S rDNA 引物序列，引物序列上游引物F 為GAAAGCATCTATCAAGTGGAA，下游引物 R 為 GATCTTTTCAAATTAGCTTTAAA，擴(kuò)增長度為580 bp。以上述DNA 為模板，F(xiàn)/R 為引物進(jìn)行PCR 擴(kuò)增、電泳、克隆測序。對測序結(jié)果運用MegA-lign 的Clustal W 方法和Mega7 鄰接法進(jìn)行同源性分析和進(jìn)化樹分析。

1.6.2 細(xì)菌16S rRNA 基因擴(kuò)增 取純培養(yǎng)物1 mL，按照通用型柱式基因組DNA提取試劑盒說明書提取DNA，置-20 ℃保存。參考黃宇等［6］方法，引物27F為 AGAGTTTGATCMTGGCTCAG 和 1492R 為 GGTTACCTTGTTACGACTT，擴(kuò)增長度為1 500 bp。以上述 DNA 為模板，F(xiàn)/R 為引物進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增、電泳、克隆測序，對測序結(jié)果用NCBI進(jìn)行BLAST比對、分析。

1.7 分離株的生化鑒定

用接種針挑取純培養(yǎng)物接種于葡萄糖、乳糖、甲基紅、吲哚、VP 和尿素酶生化管中37 ℃培養(yǎng)24 h，觀察結(jié)果，并根據(jù)《臨床常見細(xì)菌、真菌鑒定手冊》進(jìn)行判定［7］。

1.8 分離株的藥敏試驗

將純培養(yǎng)均勻涂在麥康凱瓊脂平板上，采用KB 藥敏紙片法對環(huán)丙沙星、氧氟沙星、頭孢噻肟、頭孢曲松等27 種藥物進(jìn)行敏感性試驗，經(jīng)37 ℃培養(yǎng)24 h，觀察并測量抑菌圈直徑。

2 結(jié)果與分析

2.1 臨床觀察結(jié)果

該孔雀養(yǎng)殖場主要是20～30 日齡的孔雀，發(fā)病率在10%左右，主要癥狀為羽毛蓬亂無光澤，精神萎靡，肛門有糞便。剖解發(fā)現(xiàn)肝臟表面形成黃白色相間的壞死點；盲腸腫大，盲腸黏膜及黏膜下層充血、出血和潰瘍。養(yǎng)殖戶曾使用過阿莫西林進(jìn)行治療，但不見效。

2.2 組織觸片鏡檢觀察結(jié)果

盲腸黏膜制作懸滴標(biāo)本鏡檢發(fā)現(xiàn)有蟲體做搖擺快速運動；盧氏碘液染色鏡檢發(fā)現(xiàn)有蟲體（圖1）。

圖1 鏡檢結(jié)果（盧氏碘液染色，100×）

2.3 細(xì)菌分離鑒定結(jié)果

麥康凱平板和TSA 瓊脂平板上均生長有細(xì)小、光滑菌落，從麥康凱平板上挑取單個菌落接種于TSA 培養(yǎng)基上37 ℃培養(yǎng)24 h 后也可見細(xì)小、光滑菌落，經(jīng)革蘭氏染色鏡檢為革蘭氏陰性桿菌。

2.4 PCR 擴(kuò)增

2.4.1 核糖體18S rDNA 序列的擴(kuò)增 核糖體18S rDNA 序列的PCR 擴(kuò)增結(jié)果顯示，擴(kuò)增出了580 bp的目的片段，與預(yù)期大小相符合。將測序結(jié)果與6株火雞組織滴蟲參考株進(jìn)行同源性比較，顯示該試驗株（Histomonas meleagridisgx）與參考株的同源性為97.4%～100.0%（圖2）。進(jìn)化樹結(jié)果顯示該試驗株與參考株火雞組織滴蟲（登錄號AJ920323）等處在同一分支上（圖3）。表明試驗擴(kuò)增的病原為火雞組織滴蟲。

圖2 火雞組織滴蟲的核糖體18S rDNA 序列同源性分析

圖3 火雞組織滴蟲的核糖體18S rDNA 序列進(jìn)化樹

2.4.2 細(xì)菌16S rRNA 基因擴(kuò)增 細(xì)菌16S rRNA 基因擴(kuò)增結(jié)果顯示，擴(kuò)增出了1 500 bp 左右的目的條帶，與預(yù)期的相符合。經(jīng)過BLAST 比對分析（圖4），該分離株與沙門氏菌參考株的同源性達(dá)到97.29%（登錄號MT621367.1、CP050968.1、CP042438.1 等），說明該菌株為沙門氏菌。

圖4 細(xì)菌鑒定結(jié)果

2.5 分離株的生化鑒定

生化試驗結(jié)果顯示，該分離株能發(fā)酵葡萄糖，不發(fā)酵乳糖，甲基紅試驗陽性，吲哚、VP 試驗和尿素酶試驗均為陰性，該生化試驗結(jié)果表明菌株符合沙門氏菌的特性。

2.6 分離株的藥敏試驗

藥敏結(jié)果顯示該分離株對恩諾沙星高度敏感，對環(huán)丙沙星、氧氟沙星、頭孢噻肟、頭孢曲松、氟苯尼考、諾氟沙星、阿莫西林、頭孢西丁等8 種藥物中敏，對四環(huán)素、慶大霉素、新霉素、頭孢氨芐、鏈霉素、頭孢拉定、卡那霉素、頭孢他啶、氨芐西林、青霉素鈉、丁胺卡那、紅霉素、利福平、大觀霉素、阿奇霉素、林可霉素、多西環(huán)素、復(fù)方新諾明等18 種藥物不敏感。

3 小結(jié)與討論

動物患病的情況較為復(fù)雜，有些疾病在臨床癥狀上表現(xiàn)較相似，難以區(qū)分，需要借助分子生物學(xué)手段確診，避免因誤診而導(dǎo)致不必要的經(jīng)濟(jì)損失。通過臨床癥狀的觀察、剖檢病變、鏡檢觀察、細(xì)菌分離鑒定及PCR 擴(kuò)增等方法，確診該孔雀病例為火雞組織滴蟲和沙門氏菌的混合感染。

組織滴蟲病由Smith 于1895 年首次報道，中國于1965 年在江蘇南京有報道，其后湖北、遼寧、吉林、河南等地均有報道［8-12］。早前，人們對寄生蟲病的診斷只是采用臨床觀察法及蟲卵的漂浮鏡檢等傳統(tǒng)手段。隨著科技的發(fā)展，研究者經(jīng)常采用多種手段相結(jié)合進(jìn)行診斷。核糖體18S rDNA 在進(jìn)化過程中比較保守，在寄生蟲分類和鑒定中常用［13］。王詩瑤等［14］以18S rDNA 為靶基因?qū)ρ芯恐貞c地區(qū)網(wǎng)狀車輪蟲展開研究。郝桂英等［15］以18S rDNA 部分序列為靶基因?qū)χΣG闊盤吸蟲涼山州分離株分析。本研究采用基于18S rDNA 基因序列核苷酸同源性分析顯示，廣西株火雞組織滴蟲與6 株火雞組織滴蟲參考株的核苷酸同源性為97.4%～100%，顯示較高的同源性。為更進(jìn)一步地了解廣西株的分子特征，對18S rDNA 繪制核苷酸進(jìn)化樹，可見廣西株與火雞組織滴蟲參考株出在同一分支，且與火雞組織滴蟲參考株（登錄號AJ920323）的親緣關(guān)系較近。由此可知，該廣西株為火雞組織滴蟲。

孔雀病例中，由組織滴蟲和其他病原引起的混合感染有報道，比如與大腸桿菌、異刺線蟲、球蟲、新城疫等病原［16-19］。研究中除發(fā)現(xiàn)火雞組織滴蟲外，還檢測到了沙門氏菌。通過對沙門氏菌廣西分離株的27 種藥敏試驗發(fā)現(xiàn)該菌株對四環(huán)素、新霉素、慶大霉素等18 種藥敏不敏感，僅對1 種藥物恩諾沙星高度敏感，對其余環(huán)丙沙星、氧氟沙星、頭孢噻肟等8 種藥物為中敏。由此可見該菌株對多數(shù)藥物具有耐藥性，出現(xiàn)了多重耐藥，該結(jié)果與高延玲等［20］報道相一致。沙門氏菌的耐藥性不僅體現(xiàn)在人源上，家禽、家畜、皮毛動物等的耐藥性也越來越嚴(yán)重。張濛等［21］分析2015—2016 年河南人源沙門氏菌的耐藥趨勢，顯示沙門氏菌對頭孢西丁、頭孢噻肟等4 種抗生素敏感率下降，對頭孢他啶、氨芐西林、四環(huán)素的敏感率下降明顯。夏宇飛等［22］檢測湖南地區(qū)豬源和雞源沙門氏菌耐藥性，結(jié)果顯示，沙門氏菌均對四環(huán)素、氨芐西林的耐藥率在62%以上，對阿莫西林、氟苯尼考的耐藥率在40%左右。李淑紅等［23］檢測湖南湘西北犢牛源沙門氏菌的耐藥性，結(jié)果顯示，沙門氏菌對諾氟沙星、紅霉素、氧氟沙星等24 種藥物產(chǎn)生耐藥，耐藥率為85.71%，對丁胺卡那和頭孢他啶敏感，敏感率為7.14%。孫娜等［24］對狐源沙門氏菌的耐藥性檢測結(jié)果顯示，沙門氏菌對氨基糖類藥物、四環(huán)素、氨芐西林、諾氟沙星、環(huán)丙沙星、氯霉素耐藥。耐藥性出現(xiàn)，是由于在養(yǎng)殖的過程中大量使用抗生素，導(dǎo)致病原菌對藥物耐藥，甚至出現(xiàn)了多重耐藥。耐藥性可通過其他途徑轉(zhuǎn)移給其他病菌，危害著人類和動物的健康［20］。為了人類和動物的健康安全，應(yīng)合理用藥。

該病例發(fā)生于7 月，廣西悶熱、潮濕，為疾病的發(fā)生創(chuàng)造了條件，易引發(fā)混合感染、繼發(fā)感染等。對于這兩種病的防治，應(yīng)該采取以下措施。第一，組織滴蟲主要以異刺線蟲為媒介通過消化道感染而引起動物發(fā)病，蟲卵可攜帶火雞組織滴蟲，防治該病需要對全群飼喂左旋咪唑驅(qū)蟲藥，同時，選用高敏藥物恩諾沙星進(jìn)行全群用藥。第二，對場地、飼舍進(jìn)行徹底消毒，注意環(huán)境衛(wèi)生，飼舍通風(fēng)良好，飼養(yǎng)密度不要太高。第三，場地內(nèi)外杜絕養(yǎng)殖雞、鴨等禽類，減少疾病的交叉感染。總的來說，疾病的防治應(yīng)當(dāng)結(jié)合自身的情況充分開展工作，最大限度地降低發(fā)病率。