Bcl-xl基因與顱內(nèi)感染伴癲癇發(fā)作的關(guān)系研究

陳鎮(zhèn)，黃興剛，楊帝瓊

顱內(nèi)感染是常見的中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病之一，也是癥狀性癲癇重要的原因之一，因病原體不同，可分為病毒性感染、結(jié)核性細菌感染及化膿性細菌感染等。顱內(nèi)感染伴癲癇發(fā)作患者可表現(xiàn)為急性癥狀性癲癇發(fā)作、腦炎后癲癇及后期無誘因癲癇發(fā)作等[1-3]。其中急性癥狀性癲癇發(fā)作通常出現(xiàn)在急性期 (0～7 d內(nèi))[4]。其可能的發(fā)病機制為致病微生物(特別是嗜神經(jīng)病毒)可通過血腦屏障或軸突運輸侵入中樞神經(jīng)系統(tǒng)，并在感染過程中誘導(dǎo)神經(jīng)元細胞水腫、壞死甚至凋亡損傷，同時產(chǎn)生促炎因子，以此激活先天免疫系統(tǒng)，也可激活適應(yīng)性免疫系統(tǒng)[5]。有研究顯示，炎癥細胞因子的釋放可導(dǎo)致血腦屏障破壞，使有害物質(zhì)進入顱內(nèi)導(dǎo)致腦水腫，從而使皮層異常放電，最終引發(fā)癲癇[6-7]。也有研究認為，發(fā)熱、細菌毒素的釋放及神經(jīng)化學(xué)物質(zhì)的變化也可能是導(dǎo)致顱內(nèi)感染患者出現(xiàn)急性癥狀性癲癇的原因。

中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染相關(guān)的炎癥反應(yīng)與細胞凋亡有密切的關(guān)系。有研究證實新生隱球菌感染可以誘導(dǎo)小膠質(zhì)細胞凋亡及通過線粒體途徑誘導(dǎo)宿主細胞凋亡[8]，但這只是細胞和動物基礎(chǔ)實驗研究，針對顱內(nèi)感染伴癲癇發(fā)作患者發(fā)病過程中是否存在凋亡機制的發(fā)生，目前尚無相關(guān)的臨床基礎(chǔ)研究。本研究選取2019年10月至2020年10月在遵義醫(yī)科大學(xué)第三附屬醫(yī)院住院治療的顱內(nèi)感染伴癲癇發(fā)作患者為觀察組，不伴癲癇發(fā)作患者為對照組，以腦脊液為樣本，通過檢測Bcl-xlmRNA在兩組的表達差異，探討B(tài)cl-xl基因與顱內(nèi)感染伴癲癇發(fā)作的關(guān)系?，F(xiàn)將結(jié)果報道如下。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器

主要試劑:甲醇(中國天津市富宇精細化工有限公司 )、無水乙醇( 中國重慶市川東化工有限公司)、丙酮 (中國成都金山化學(xué)試劑有限公司)、TRIzol Reagent及2×SYBR Green PCR Mastermix。主要儀器為實時熒光定量PCR儀(伯樂型號為 CFX96)、核酸定量儀(Thermo型號為Nanodrop Lite)、勻漿機及逆轉(zhuǎn)錄PCR儀等。

1.2 入選標(biāo)準(zhǔn)及排除標(biāo)準(zhǔn)

選取2019年10月至2020年10月在遵義醫(yī)科大學(xué)第三附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科住院治療并診斷為顱內(nèi)感染疾病的患者36例。入選標(biāo)準(zhǔn)：(1)符合顱內(nèi)感染診斷標(biāo)準(zhǔn)；(2)存在癲癇發(fā)作的患者符合《臨床診療指南·癲癇病分冊》中的診斷標(biāo)準(zhǔn)。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)存在精神類和神經(jīng)退行性病變疾病的患者；(2)存在腫瘤特別是神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤的患者；(3)合并高血壓病、糖尿病及冠心病的慢性病患者。入組患者根據(jù)是否有癲癇發(fā)作分為有癲癇發(fā)作的患者15例為觀察組，無癲癇發(fā)作的患者21例為對照組。

1.3 方法

1.3.1 提取腦脊液

入組患者在入院第1天行腰椎穿刺后，留取2 mL腦脊液儲存于凍存管中置于-80 ℃冰箱儲存以備檢測。

1.3.2 熒光定量 PCR法檢測Bcl-xl的mRNA 基因的表達

引物的設(shè)計與合成:根據(jù)Gene Bank human BCL-xl及內(nèi)參GADPH 基因的全序列，用Primer 5.0軟件進行設(shè)計，序列詳見表1。引物均由上海英濰捷基生物技術(shù)有限公司進行引物合成。引物合成好后用DEPC水稀釋100倍保存于-20 ℃冰箱備用。

表1 設(shè)計的引物序列

總RNA 的提取和 CDNA 的合成:將儲存于-80°冰箱的腦脊液置于室溫，按RNA提取試劑RNA iso Plus說明書提取總RNA;取2 μL RNA在Thermo Nanodrop Lite核酸定量儀測定RNA的濃度和純度，其中對照組的純度為(1.83±0.75)，觀察組的純度為(1.89±0.11)。CDNA 的合成參照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進行操作，反應(yīng)體系為20μL，反應(yīng)完成后于-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

RT- PCR 反應(yīng):在伯樂CFX96實時熒光定量 PCR儀進行以下RT-PCR 反應(yīng)(步驟為預(yù)變性 95 ℃ 3 min，擴增 95 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共40個循環(huán)； 熔解曲線為95 ℃ 5 s， 60 ℃ 1 min; 冷卻為40 ℃ 30 s)。具體反應(yīng)體系按照說明書操作。經(jīng)過系統(tǒng)自動提取2-ΔΔCt值。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 臨床基線資料

觀察組15例中男性7例、女性8例，年齡14～53歲、平均(26.67±12.09)歲，診斷為病毒性腦炎或腦膜腦炎15例。首發(fā)癥狀：9例為全面強直陣攣發(fā)作(60%)，1例為發(fā)作性行為異常(7%)，5例為頭昏頭痛(33%)。伴隨癥狀：以頭昏頭痛為首發(fā)癥狀的5例患者中4例伴發(fā)作性意識障礙，伴發(fā)作性右側(cè)面部及右側(cè)肢體抽搐，1例以發(fā)作性行為異常為首發(fā)癥狀伴行走不穩(wěn)，其余無明顯伴隨癥狀。誘發(fā)因素：7例伴上呼吸道感染，8例無明顯誘發(fā)因素。對照組21例中男性5例、女性16例，年齡14～67歲、平均(31.67±16.34)歲，其中診斷為病毒性腦炎或腦膜腦炎19例，結(jié)核性腦膜炎2例。首發(fā)癥狀：19例為頭昏頭痛(90%)，1例為精神行為異常(5%)，1例為眩暈(5%)。伴隨癥狀：8例伴發(fā)熱，1例伴耳后皮膚皰疹，其余無明顯伴隨癥狀。誘發(fā)因素：21例中有11例存在呼吸道感染，1例為右耳后皮膚皰疹。結(jié)果詳見表2。

表2 觀察組與對照組患者的基線資料比較

2.2 腦電圖

觀察組15例患者中腦電圖異常6例，其中5例為輕度異常，1例為中度異常，異常腦電圖均發(fā)現(xiàn)有癇樣放電，余9例患者腦電圖均正常。對照組21例患者中腦電圖異常8例，其中3例為輕度異常，4例為中度異常，1例為中至重度異常，余13例患者腦電圖均正常。結(jié)果詳見表3。

表3 觀察組與對照組患者的腦電圖結(jié)果比較

2.3 腦脊液、血常規(guī)及影像學(xué)

2.3.1 腦脊液

觀察組15例患者中4例腰穿腦壓>180 mmH2O，范圍為(180～240)mmH2O，余11例患者腰穿腦壓均在正常范圍；3例患者的腰穿腦脊液常規(guī)提示總細胞數(shù)異常，以白細胞數(shù)增高為主，范圍為(10～70)×10-6/L，余均正常；生化結(jié)果均正常。所有患者均未做細菌學(xué)檢查。

對照組21例患者中4例腰穿腦壓>180 mmH2O，范圍為(185～255)mmH2O，1例腰穿腦壓為75 mmH2O，余16例患者腰穿腦壓均在正常范圍；11例存在白細胞數(shù)異常，范圍為(8～220)×10-6/L，余均正常；6例患者的生化結(jié)果提示蛋白有不同程度的增高，范圍為(0.46～2.75)g/L，余15例患者腦脊液蛋白均正常；2例患者的生化結(jié)果提示糖下降，范圍為(1.7～2.0)mmol/L，氯下降，范圍為(112.0～113.6)mmol/L，腺苷脫氨酶(ADA)升高，范圍為(3.7～9.0)U/L，均為結(jié)核性腦膜炎患者，余糖氯均正常；4例患者的腦脊液細菌學(xué)檢查為陰性，其余未做(表4)。觀察組與對照組患者的頭顱影像學(xué)結(jié)果(頭顱CT或頭顱MRI)均未見腦炎或腦膜炎征象。

2.3.2 血常規(guī)

觀察組15例患者中7例血常規(guī)提示炎性改變，白細胞數(shù)范圍為(11.2～14.8)×10-9/L，中性粒細胞比率范圍為(71.7～86.5)%，余8例均正常。對照組21例患者中6例提示炎性改變，白細胞數(shù)范圍為(10.9～13.6)×10-9/L，中性粒細胞比率范圍為(79.6～89.6)%，余15例均正常。結(jié)果詳見表4。

表4 觀察組與對照組患者的腦脊液及血常規(guī)檢測結(jié)果比較

2.4 腦脊液Bcl-xl mRNA的表達情況

熒光PCR結(jié)果顯示，對照組患者Bcl-xlmRNA的的表達量為(0.80±0.12)，觀察組患者Bcl-xlmRNA的表達量為(0.28±0.09)。觀察組mRNA表達量較對照組表達下調(diào)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。詳見圖1。

注：*為與對照組比較,P<0.05。

3 討論

癲癇是一種由于大腦細胞異常過度放電而引起的一過性、反復(fù)發(fā)作的臨床綜合征，具有發(fā)作性、短暫性、重復(fù)性及刻板性的特點。而癲癇發(fā)作是指大腦神經(jīng)元異常和過度的超同步化放電所造成的臨床現(xiàn)象。癲癇的發(fā)病機制非常復(fù)雜，至今尚未能完全了解其全部機制，但發(fā)病的一些重要環(huán)節(jié)已被探知，如癇樣放電的起始、傳播及終止等。有研究報道，癲癇的發(fā)病機制與神經(jīng)元、通道及基因甚至神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)功能失衡等多因素有關(guān)[9-10]。Choi等[11]研究認為腦部的炎癥反應(yīng)也是導(dǎo)致癲癇形成和發(fā)作的一個重要機制，因此免疫炎癥反應(yīng)機制與癲癇的關(guān)系也越來越受到關(guān)注。本文研究對象為顱內(nèi)感染患者，通過對伴有癲癇發(fā)作和非癲癇發(fā)作的患者之間進行基線資料和輔助檢查結(jié)果比較，以及腦脊液中Bcl-xl抗凋亡因子的對比，探討在顱內(nèi)感染伴癲癇發(fā)作的患者中是否存在凋亡機制的參與。

本研究基于病毒性腦膜炎、病毒性腦炎及結(jié)核性腦膜炎的診斷標(biāo)準(zhǔn)，以及2015年中國抗癲癇協(xié)會發(fā)布的《臨床診療指南.癲癇病分冊》，納入標(biāo)準(zhǔn)為顱內(nèi)感染，伴癲癇發(fā)作的患者為觀察組，不伴癲癇發(fā)作的患者為對照組，其中癲癇發(fā)作可為驚厥性發(fā)作或非驚厥性發(fā)作。本研究患者在入院后第1天抽取腦脊液，運用RT-PCR技術(shù)探究兩組樣本中Bcl-xlmRNA的表達情況，探討B(tài)cl-xl與顱內(nèi)感染伴癲癇發(fā)作的關(guān)系。

本研究觀察組中男性7例，平均年齡為(28.62±14.79)歲；女性8例，平均年齡為(23.50±9.07)歲。對照組中男性5例，平均年齡為(37.40±25.26)歲；女性16例，平均年齡為(29.88±13.09)歲，兩組年齡分布比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.32)。觀察組中首發(fā)癥狀為全面強直陣攣發(fā)作的患者比例為60%，頭昏頭痛患者的比例為33%，發(fā)作性行為異常患者的比例為7%，其中全面強直陣攣發(fā)作形式是臨床上較容易識別的癥狀，但針對頭昏頭痛的患者，本研究中伴隨有發(fā)作性癥狀，占比相對較少；對照組中首發(fā)癥狀為頭昏頭痛的患者比例為90%，這部分患者需結(jié)合詳細的病史、腦電圖及腰椎穿刺結(jié)果來確診。

有研究結(jié)果表明，使用細辛醚干預(yù)的KA癲癇大鼠，其海馬區(qū)促凋亡蛋白因子(Bax)基因的表達量明顯高于對照組，而抗凋亡蛋白因子(Bcl-2)基因的表達量明顯低于對照組大鼠[12]。曲珍珍等[13]的研究亦顯示子鼠懷孕期間癇性發(fā)作可使其海馬區(qū)Bax的表達量增加，而Bcl-2的表達量降低，凋亡執(zhí)行蛋白(caspase-3)的表達量增加，因此推斷子鼠懷孕期間癇性發(fā)作可促使海馬神經(jīng)元凋亡。有研究報道，癲癇患者神經(jīng)元內(nèi)的抗凋亡因子和促凋亡因子的表達是異常的[14-15]。

有研究表明，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，無論是病毒的直接作用或間接作用，均會刺激神經(jīng)膠質(zhì)細胞大量分泌細胞因子(如TNF-α、IL-6及IL-10等)，進而產(chǎn)生細胞因子的聚集和級聯(lián)反應(yīng),從而誘導(dǎo)神經(jīng)元凋亡，最終破壞血腦屏障[16-17]。在小鼠新型隱球菌感染模型中發(fā)現(xiàn),隱球菌可以誘導(dǎo)小膠質(zhì)細胞的凋亡及通過線粒體途徑誘導(dǎo)宿主細胞的凋亡[8]。

綜上所述，癲癇的發(fā)生有凋亡家族的參與已得到證實，同時顱內(nèi)感染的發(fā)生亦存在凋亡機制的參與，而顱內(nèi)感染伴癲癇發(fā)作的發(fā)病機制中是否存在凋亡機制的參與，李志民等[18]以氯化鋰修飾顱內(nèi)感染后癲癇發(fā)作為模型，對大鼠海馬組織進行免疫組化分析發(fā)現(xiàn)，顱內(nèi)感染的大鼠海馬組織中GSK-3β的蛋白表達量顯著升高，說明氯化鋰修飾顱內(nèi)感染后癲癇發(fā)作的分子機制中有GSK-3β的參與，GSK-3β可以影響細胞色素C的釋放及線粒體滲透性，從而參與細胞凋亡的調(diào)控。針對顱內(nèi)感染伴癲癇發(fā)作的發(fā)病機制中是否存在凋亡機制的參與，目前缺乏對腦脊液方面的研究，特別是對Bcl-xl促凋亡分子或Bcl-2家族的研究。本文的研究對象為病毒性腦炎(包括腦膜炎和腦膜腦炎)及結(jié)核性腦膜炎的患者，觀察組患者腦脊液中的Bcl-xlmRNA表達量低于對照組，這在一定程度上說明顱內(nèi)感染伴癲癇發(fā)作的發(fā)病機制可能與抗凋亡因子Bcl-xl相關(guān)。但其中具體的關(guān)系目前尚不清楚，是顱內(nèi)感染導(dǎo)致凋亡發(fā)生間接影響癲癇發(fā)作，還是顱內(nèi)感染本身影響癲癇發(fā)作，抑或其中是否存在其他因素的參與，需要更多的動物模型或細胞基礎(chǔ)實驗研究以進一步證實。

顱內(nèi)感染伴癲癇發(fā)作可能存在Bcl-xl促凋亡分子的參與，這對顱內(nèi)感染伴癲癇發(fā)作的可能發(fā)病機制和治療新靶點的研究有了新的方向。