氟唑菌酰羥胺與咪鮮胺復(fù)配對(duì)枸杞根腐病菌的毒力增效作用

張 恒，何 靜*，張小彥，張樹(shù)衡，李彥湘，張金花，程 永，李紅磊

(1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué) 林學(xué)院，甘肅 蘭州 730070；2.先正達(dá)(中國(guó))投資有限公司，上海 200120)

枸杞(Lyciumbarbarum)為茄科多年生灌木，是食品與中藥制劑的常用原料，有治療腫瘤、抗疲勞、抗氧化、抗炎、護(hù)肝等多種功效[1-5]。枸杞不僅具有較高經(jīng)濟(jì)效益，因其可在重鹽堿地和干旱地區(qū)生存，也是優(yōu)良的生態(tài)修復(fù)樹(shù)種[6-7]，目前，已在寧夏、甘肅、青海和新疆等多個(gè)省份大面積種植[8]。然而，隨著枸杞栽培面積的不斷增加，枸杞病蟲(chóng)害的發(fā)生率也逐年攀升，其中以枸杞根腐病的發(fā)生與危害程度最為突出。

枸杞根腐病作為一種土傳病害，已在我國(guó)各大枸杞產(chǎn)區(qū)發(fā)生[9]，主要危害栽培枸杞的根部或根莖部，常造成枸杞產(chǎn)量和品質(zhì)下降，甚至導(dǎo)致樹(shù)木死亡，嚴(yán)重影響了枸杞的經(jīng)濟(jì)效益與生態(tài)效益。因環(huán)境差異，各地區(qū)枸杞根腐病的主要病原菌不盡一致[10-11]，經(jīng)鑒定甘肅省枸杞根腐病的主要病原菌為腐皮鐮刀菌(Fusariumsolani)[12]。目前，防治枸杞根腐病的主要途徑有生物防治和化學(xué)防治等?；瘜W(xué)防治具有見(jiàn)效快和施用便捷等特點(diǎn)，在枸杞根腐病的防治過(guò)程中發(fā)揮了重要作用，有效地預(yù)防了枸杞根腐病的蔓延和加重。目前生產(chǎn)上用于枸杞根腐病防治的化學(xué)藥劑主要以多菌靈和甲基托布津等苯并咪唑類殺菌劑為主[13]，但因其作用位點(diǎn)單一，可預(yù)期產(chǎn)生抗藥性的風(fēng)險(xiǎn)較高[14]。因此，研究篩選防治枸杞根腐病的高效低毒殺菌劑并通過(guò)復(fù)配實(shí)現(xiàn)增效作用，不但可以降低抗藥性的風(fēng)險(xiǎn)，還可擴(kuò)大防治譜，增強(qiáng)藥效，減少防治成本。

氟唑菌酰羥胺(pydiflumetofen)是由先正達(dá)公司研發(fā)的新型吡啶酰胺類殺菌劑，主要作用于琥珀酸脫氫酶(succinate dehydrogenase,SDH)，通過(guò)干擾呼吸電子傳遞鏈復(fù)合體Ⅱ上的三羧酸循環(huán)來(lái)抑制線粒體的功能，阻止其產(chǎn)生能量，抑制病原菌生長(zhǎng)，最終導(dǎo)致其死亡，已有報(bào)道稱氟唑菌酰羥胺對(duì)鐮刀菌有抑制作用[15]。咪鮮胺(prochloraz)為甾醇合成抑制劑類殺菌劑，主要影響甾醇的生物合成，使菌體細(xì)胞功能受到破壞，達(dá)到抑菌效果。已有研究發(fā)現(xiàn)咪鮮胺對(duì)腐皮鐮刀菌具有較好的抑菌效果[16-19]。由于咪鮮胺在土壤中的半衰期長(zhǎng)、持效性好，因此長(zhǎng)期處于含有一定質(zhì)量濃度咪鮮胺的土壤中的病原菌存在一定抗藥性風(fēng)險(xiǎn)[20]。本研究測(cè)試了氟唑菌酰羥胺、咪鮮胺復(fù)配劑對(duì)腐皮鐮刀菌的室內(nèi)毒力，旨在探明上述2種作用機(jī)制不同的藥劑對(duì)腐皮鐮刀菌的抑制效果，篩選最佳復(fù)配比例，為研究開(kāi)發(fā)新的枸杞根腐病防治制劑、降低抗藥性風(fēng)險(xiǎn)提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1 供試菌種 來(lái)自甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)森保實(shí)驗(yàn)室保存的腐皮鐮刀菌，分離自枸杞根腐病病株，試驗(yàn)前經(jīng)活化處理。

1.1.2 供試藥劑 99.7%氟唑菌酰羥胺TC，瑞士先正達(dá)作物保護(hù)有限公司；95.0%咪鮮胺TC，江蘇龍燈化學(xué)有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 供試藥劑對(duì)腐皮鐮刀菌菌絲的抑制效果 采用生長(zhǎng)速率法[21]。將氟唑菌酰羥胺和咪鮮胺分別用丙酮配制成母液，按3∶2、9∶1、10∶1、5∶1、1∶3、2∶1、2∶3、3∶7、3∶1、1∶10、1∶5、8∶2、1∶1、1∶9、1∶2、7∶3、2∶8的有效質(zhì)量濃度比例進(jìn)行復(fù)配，用無(wú)菌水將各供試藥劑稀釋到所需質(zhì)量濃度，分別加入滅菌后的PDA培養(yǎng)基中制成最終有效質(zhì)量濃度為0.8、0.4、0.2、0.1、0.05 mg·L-1的含藥PDA培養(yǎng)基，以含有等量丙酮的PDA培養(yǎng)基為對(duì)照，每處理重復(fù)3次。各處理與對(duì)照的培養(yǎng)基中丙酮含量均為0.16%。將直徑為7 mm的菌餅倒置在制作好的PDA平板中央，置于28 ℃、濕度為40%的黑暗條件下培養(yǎng)，待對(duì)照菌落生長(zhǎng)至平板的80%時(shí)，采用十字交叉法測(cè)量菌落直徑，并按下式計(jì)算菌絲生長(zhǎng)抑制率。

菌絲生長(zhǎng)抑制率=

(1)

以藥劑質(zhì)量濃度的對(duì)數(shù)值及對(duì)應(yīng)的抑制百分率的幾率值作回歸分析，得出各處理的抑制率幾率值(y)與質(zhì)量濃度對(duì)數(shù)(x)之間的毒力回歸方程、EC50值和相關(guān)系數(shù)。

1.2.2 最佳增效配比對(duì)腐皮鐮刀菌孢子萌發(fā)的抑制效果 采用孢子萌發(fā)法[22]。將氟唑菌酰羥胺和咪鮮胺分別用丙酮配制成母液，按3∶2的有效質(zhì)量濃度比例進(jìn)行復(fù)配，用無(wú)菌水將各供試藥劑稀釋到所需質(zhì)量濃度。腐皮鐮刀菌于28 ℃、濕度為40%的黑暗條件下培養(yǎng)7 d后，在無(wú)菌環(huán)境中，從加入適量無(wú)菌水的PDA培養(yǎng)基上刮下菌絲與孢子，過(guò)濾后6 000 r·min-1離心，棄去上清液，用PD培養(yǎng)基調(diào)制懸浮液，將配置好的藥劑與懸浮液各吸取30 μL滴加于試管中搖勻，使其在低倍鏡下每視野約20～40個(gè)孢子。吸取1滴藥劑與懸浮液的混合液倒懸于載玻片上，制成最終有效質(zhì)量濃度為0.8、0.4、0.2、0.1、0.05 mg·L-1的含藥PD培養(yǎng)基載玻片。以含有等量丙酮的PD培養(yǎng)基載玻片為對(duì)照，每處理3個(gè)重復(fù)。各處理與對(duì)照的培養(yǎng)基中丙酮含量均為0.16%。置培養(yǎng)皿內(nèi)保濕，(26±1) ℃恒溫培養(yǎng)6 h后，在低倍鏡下隨機(jī)抽取5個(gè)視野，約100個(gè)分生孢子，統(tǒng)計(jì)孢子萌發(fā)情況(以孢子芽管長(zhǎng)度大于孢子短半徑者視為萌發(fā))，按下式計(jì)算孢子萌發(fā)相對(duì)抑制率。

(2)

孢子萌發(fā)相對(duì)抑制率=

(3)

以藥劑質(zhì)量濃度的對(duì)數(shù)值及對(duì)應(yīng)的抑制百分率的機(jī)率值作回歸分析，得出各處理的抑制率幾率值(y)與質(zhì)量濃度對(duì)數(shù)(x)之間的毒力回歸方程、EC50值和相關(guān)系數(shù)。

1.2.3 復(fù)配增效評(píng)價(jià)方法 按Wadley法評(píng)價(jià)氟唑菌酰羥胺與咪鮮胺復(fù)配抑制腐皮鐮刀菌菌絲生長(zhǎng)與孢子萌發(fā)的聯(lián)合毒力。

Wadley公式：

(4)

(5)

式中：A、B為單劑；a、b為相應(yīng)單劑在混劑中的比例；ob為實(shí)際觀察值；th為理論值。

SR>1.5為增效作用；0.5≥SR≤1.5為相加作用；SR<0.5為拮抗作用。

1.2.4 最佳增效配比對(duì)腐皮鐮刀菌孢子芽管伸長(zhǎng)的抑制效果 按照1.2.2方法制備孢子懸浮液，吸取1滴藥劑與懸浮液的混合液倒懸于載玻片上，制成最終有效質(zhì)量濃度為0.8、0.4、0.2、0.1、0.05 mg·L-1的含藥PD培養(yǎng)基載玻片，以含有等量丙酮的PD培養(yǎng)基為對(duì)照，置培養(yǎng)皿內(nèi)保濕，(26±1) ℃恒溫培養(yǎng)6 h后，隨機(jī)抽取20個(gè)分生孢子，測(cè)量孢子芽管長(zhǎng)度，每處理3次重復(fù)。按下式計(jì)算芽管伸長(zhǎng)抑制率。

芽管伸長(zhǎng)抑制率=

(6)

1.2.5 最佳增效配比對(duì)腐皮鐮刀菌產(chǎn)孢量的抑制效果 按照1.2.1方法制備最終有效質(zhì)量濃度為0.8、0.4、0.2、0.1、0.05 mg·L-1的含藥PDA培養(yǎng)基，以含有等量丙酮的PDA培養(yǎng)基載玻片為對(duì)照，將腐皮鐮刀菌菌餅接種于含藥培養(yǎng)基上，置于28 ℃、濕度為40%的黑暗條件下培養(yǎng)7 d，在無(wú)菌環(huán)境中，從加入無(wú)菌水的PDA培養(yǎng)基上刮下菌絲與孢子，用4層紗布過(guò)濾出菌絲后，混勻孢子懸浮液，在血球計(jì)數(shù)板上統(tǒng)計(jì)各處理孢子數(shù)量，每處理3次重復(fù)。按下式計(jì)算產(chǎn)孢量抑制率。

產(chǎn)孢量抑制率=

(7)

1.2.6 最佳增效配比對(duì)腐皮鐮刀菌菌絲干重的抑制效果 按照1.2.2方法制備孢子懸浮液，吸取30 μL接種于滅菌后的PD培養(yǎng)基中，搖床28 ℃、160 r·min-1培養(yǎng)12 h后，于無(wú)菌環(huán)境中分別加入各質(zhì)量濃度處理試劑，使其終有效質(zhì)量濃度為0.8、0.4、0.2、0.1、0.05 mg·L-1，對(duì)照PD培養(yǎng)基中加入等量的丙酮，繼續(xù)于搖床上培養(yǎng)12 h后，用2層濾紙抽濾出菌絲，50 ℃烘干至恒重后，在電子天平上稱量菌絲干重，每處理3次重復(fù)。按下式計(jì)算菌絲干重抑制率。

菌絲干重抑制率=

(8)

2 結(jié)果與分析

2.1 氟唑菌酰羥胺與咪鮮胺復(fù)配對(duì)腐皮鐮刀菌菌絲生長(zhǎng)的聯(lián)合毒力

由表1可知，氟唑菌酰羥胺與咪鮮胺單劑的EC50值分別為0.120 8、0.365 8 mg·L-1，表現(xiàn)為咪鮮胺的抑菌效果較好。在復(fù)配試驗(yàn)中，不同供試比例的氟唑菌酰羥胺與咪鮮胺復(fù)配均有較強(qiáng)的抑菌效果。全部供試復(fù)配比例的EC50值均小于氟唑菌酰羥胺單劑和咪鮮胺單劑處理。

表1 氟唑菌酰羥胺與咪鮮胺及其復(fù)配劑對(duì)腐皮鐮刀菌菌絲生長(zhǎng)的抑制效果Table 1 Inhibitory effect of pydiflumetofen,prochloraz and their compound on mycelial growth of Fusarium solani

氟唑菌酰羥胺與咪鮮胺配比為3∶2、9∶1、10∶1、5∶1、1∶3、2∶1、2∶3、3∶7、3∶1、1∶10、1∶5、8∶2、1∶1、1∶9、1∶2、7∶3時(shí)的增效系數(shù)(SR)均大于1.5，表現(xiàn)為增效作用。在氟唑菌酰羥胺與咪鮮胺配比為2∶8時(shí)的SR值為0.5～1.5，表現(xiàn)為相加作用。氟唑菌酰羥胺與咪鮮胺各復(fù)配比例的增效強(qiáng)弱依次為：3∶2、9∶1、10∶1、5∶1、1∶3、2∶1、2∶3、3∶7、3∶1、1∶10、1∶5、8∶2、1∶1、1∶9、1∶2、7∶3、2∶8。其中，以氟唑菌酰羥胺與咪鮮胺復(fù)配比例在3∶2時(shí)的增效作用最大，其SR達(dá)到了4.560 0，可作為氟唑菌酰羥胺與咪鮮胺復(fù)配防治枸杞根腐病的最佳配比處理。

2.2 最佳配比對(duì)腐皮鐮刀菌孢子萌發(fā)的抑制效果

由表2可知，氟唑菌酰羥胺單劑和咪鮮胺單劑對(duì)腐皮鐮刀菌的孢子萌發(fā)均具有一定的抑制效果，其EC50值分別為0.116 7 mg·L-1和1 455.784 8 mg·L-1，其中以氟唑菌酰羥胺對(duì)腐皮鐮刀菌的孢子萌發(fā)抑制效果較好。氟唑菌酰羥胺與咪鮮胺配比為3∶2時(shí)的EC50值為0.060 2 mg·L-1，對(duì)腐皮鐮刀菌孢子萌發(fā)的抑制效果優(yōu)于2種單劑，增效系數(shù)(SR)為3.102 9，表現(xiàn)為增效作用。

表2 氟唑菌酰羥胺與咪鮮胺及其復(fù)配劑對(duì)腐皮鐮刀菌孢子萌發(fā)的抑制效果Table 2 Inhibitory effect of pydiflumetofen,prochloraz and their compound on spore germination of F.solani

2.3 最佳配比對(duì)腐皮鐮刀菌芽管伸長(zhǎng)的抑制效果

由圖1可知，氟唑菌酰羥胺單劑和咪鮮胺單劑的各質(zhì)量濃度處理對(duì)腐皮鐮刀菌孢子的芽管伸長(zhǎng)均具有一定的抑制效果，其中以氟唑菌酰羥胺對(duì)腐皮鐮刀菌孢子芽管伸長(zhǎng)的抑制效果較好。各處理對(duì)腐皮鐮刀菌孢子芽管伸長(zhǎng)的抑制率均隨處理質(zhì)量濃度增加而升高。復(fù)配處理在0.8 mg·L-1質(zhì)量濃度下對(duì)腐皮鐮刀菌孢子芽管伸長(zhǎng)的抑制率達(dá)83.30%，顯著高于2種單劑。

2.4 最佳配比對(duì)腐皮鐮刀菌產(chǎn)孢量的抑制效果

由圖2可知，氟唑菌酰羥胺單劑和咪鮮胺單劑的各質(zhì)量濃度處理對(duì)腐皮鐮刀菌孢子產(chǎn)孢量均具有一定的抑制效果，以氟唑菌酰羥胺對(duì)腐皮鐮刀菌孢子產(chǎn)孢量的抑制效果較好。復(fù)配處理在0.1 mg·L-1質(zhì)量濃度處理下，對(duì)腐皮鐮刀菌產(chǎn)孢量的抑制率顯著高于2種單劑處理。在有效質(zhì)量濃度為0.4 mg·L-1時(shí)，復(fù)配處理對(duì)腐皮鐮刀菌產(chǎn)孢量的抑制率達(dá)100%。在有效質(zhì)量濃度為0.8 mg·L-1時(shí)，氟唑菌酰羥胺與復(fù)配處理對(duì)腐皮鐮刀菌產(chǎn)孢量的抑制率均達(dá)100%。

2.5 最佳配比對(duì)腐皮鐮刀菌菌絲干重的抑制效果

由圖3可知，氟唑菌酰羥胺單劑和咪鮮胺單劑的各質(zhì)量濃度處理對(duì)腐皮鐮刀菌菌絲干重均具有一定的抑制效果，其中以氟唑菌酰羥胺單劑處理對(duì)腐皮鐮刀菌菌絲干重的抑制效果較好。各處理對(duì)腐皮鐮刀菌孢子菌絲干重的抑制率均隨處理質(zhì)量濃度增加而升高。復(fù)配處理在0.8 mg·L-1質(zhì)量濃度處理下，對(duì)腐皮鐮刀菌菌絲干重的抑制率達(dá)到66.71%，顯著高于2種單劑處理。

3 結(jié)論與討論

3.1 結(jié)論

選用氟唑菌酰羥胺單劑與咪鮮胺單劑及其二者不同比例的復(fù)配處理對(duì)枸杞根腐病主要病原菌——腐皮鐮刀菌進(jìn)行了菌絲生長(zhǎng)、孢子萌發(fā)、芽管伸長(zhǎng)、產(chǎn)孢量、菌絲干重的抑制試驗(yàn)。結(jié)果表明：氟唑菌酰羥胺單劑與咪鮮胺單劑及其復(fù)配處理對(duì)供試腐皮鐮刀菌的各生長(zhǎng)發(fā)育階段均具有不同程度的抑制作用。在單劑處理中，以咪鮮胺對(duì)腐皮鐮刀菌的菌絲生長(zhǎng)抑制作用較好，以氟唑菌酰羥胺對(duì)腐皮鐮刀菌孢子萌發(fā)、芽管伸長(zhǎng)、產(chǎn)孢量、菌絲干重的抑制效果較好。在復(fù)配處理中，以氟唑菌酰羥與咪鮮胺配比為3∶2時(shí)，對(duì)腐皮鐮刀菌菌絲生長(zhǎng)抑制的增效作用最強(qiáng)，其增效系數(shù)SR值達(dá)到了4.560 0，可作為氟唑菌酰羥胺與咪鮮胺復(fù)配防治枸杞根腐病的最佳比例。3∶2復(fù)配處理對(duì)腐皮鐮刀菌孢子萌發(fā)的抑制有增效作用，其增效系數(shù)SR值達(dá)到了3.231 1。氟唑菌酰羥胺、咪鮮胺單劑及3∶2復(fù)配處理的各質(zhì)量濃度處理對(duì)腐皮鐮刀菌產(chǎn)孢量、芽管伸長(zhǎng)、菌絲干重均具有一定的抑制效果，在質(zhì)量濃度為0.8 mg·L-1時(shí)，3∶2復(fù)配處理對(duì)腐皮鐮刀菌產(chǎn)孢量的抑制率達(dá)100%，對(duì)芽管伸長(zhǎng)、菌絲干重的抑制率均顯著高于2種單劑處理，在低質(zhì)量濃度下增效作用不顯著。該研究結(jié)果將為預(yù)防腐皮鐮刀菌對(duì)氟唑菌酰羥胺單劑和咪鮮胺單劑產(chǎn)生耐藥性具有重要意義。

3.2 討論

在單劑處理中，氟唑菌酰羥胺和咪鮮胺在對(duì)腐皮鐮刀菌菌絲生長(zhǎng)和孢子萌發(fā)的抑制作用強(qiáng)弱表現(xiàn)并不一致，這可能與二者的作用位點(diǎn)和抑菌機(jī)制不同有一定關(guān)系。咪鮮胺可抑制菌體麥角甾醇合成，故對(duì)消耗能量較小的菌絲生長(zhǎng)的抑制作用更為明顯[23]，而對(duì)孢子萌發(fā)沒(méi)有明顯的抑制效果。劉礎(chǔ)榮等[24]在篩選防治紅棗黑斑病的殺菌劑時(shí)發(fā)現(xiàn)：以三唑類為代表的麥角甾醇生物抑制劑對(duì)病原菌孢子萌發(fā)沒(méi)有明顯的抑制效果，這與本研究結(jié)果一致。氟唑菌酰羥胺作為吡啶酰胺類殺菌劑，主要抑制菌體的能量代謝，因此，這對(duì)需要較大能量的孢子萌發(fā)過(guò)程影響較大[25]。在質(zhì)量濃度為0.8 mg·L-1時(shí)，3∶2復(fù)配處理對(duì)腐皮鐮刀菌產(chǎn)孢量的抑制率達(dá)到了100%，芽管伸長(zhǎng)、菌絲干重的抑制效果均顯著高于2種單劑處理，在低質(zhì)量濃度下增效作用不顯著，因此復(fù)配劑在田間病情嚴(yán)重時(shí)適當(dāng)增加施用質(zhì)量濃度，增效效果可能更明顯。

氟唑菌酰羥胺與咪鮮胺對(duì)枸杞根腐病的防治鮮有報(bào)道。本研究中，咪鮮胺作為甾醇生物合成抑制劑(sterol biosynthesis inhibitors,SBIs)中應(yīng)用最廣泛的C-14α-脫甲基化酶抑制劑(C-14-α-demethylation inhibitors,DMIs)，對(duì)核桃黑斑病[26]、藍(lán)莓根腐病[27]、水稻惡苗病[28]等多種病害具有防治作用。但有研究表明，一些病原菌已對(duì)咪鮮胺產(chǎn)生了一定的抗藥性風(fēng)險(xiǎn)。在江蘇省部分稻區(qū)，田間惡苗病菌對(duì)咪鮮胺已有一定的抗藥性[29-31]。中國(guó)華北地區(qū)瓜類尖孢鐮刀菌(Fusariumoxysporum)在藥劑選擇壓力下也可形成抗咪鮮胺群體，具有抗藥性風(fēng)險(xiǎn)[32]。咪鮮胺為甘肅枸杞產(chǎn)區(qū)、青海枸杞產(chǎn)區(qū)的常用殺菌劑[33]，故降低腐皮鐮刀菌對(duì)其的抗性風(fēng)險(xiǎn)尤為重要。

在許多情況下，病原菌對(duì)SBIs殺菌劑的抗藥性機(jī)制是由于抗藥性突變體能夠主動(dòng)將藥物排出體外[34-36]，即藥物外排泵基因過(guò)表達(dá)。本研究選用吡啶酰胺類殺菌劑——氟唑菌酰羥胺作為咪鮮胺的復(fù)配制劑，可通過(guò)抑制病原菌ATP的產(chǎn)生，發(fā)揮其抑制菌體線粒體功能的作用，影響病原菌的能量代謝，限制藥劑外排泵對(duì)咪鮮胺的主動(dòng)運(yùn)輸。當(dāng)咪鮮胺與氟唑菌酰羥胺復(fù)配劑被應(yīng)用于枸杞根腐病的田間防治時(shí)，在造成腐皮鐮刀菌麥角甾醇被抑制的同時(shí)，可能影響線粒體呼吸作用，例如A.Ciriglianoetal[37]發(fā)現(xiàn)酵母細(xì)胞中麥角甾醇被抑制時(shí)，會(huì)引起線粒體DNA的丟失，從而影響線粒體呼吸作用。2種機(jī)制相互作用，表現(xiàn)出氟唑菌酰羥胺與咪鮮胺復(fù)配劑的抑菌增效作用，該研究結(jié)果將為研究開(kāi)發(fā)新的枸杞根腐病防治制劑、降低抗藥性風(fēng)險(xiǎn)提供理論參考。