側(cè)柏莖段培養(yǎng)快速繁殖技術(shù)研究和黃帝手植柏克隆

章 亮，謝祥琛，王奕然，李周岐

(西北農(nóng)林科技大學(xué) 林學(xué)院，陜西 楊陵 712100)

黃帝手植柏為生長在陜西省延安市黃陵縣黃帝陵軒轅廟的一株側(cè)柏(Platycladusorientalis)[1]，相傳由人文初祖黃帝軒轅親手所植，距今已有5 000 a歷史，是我國側(cè)柏中年齡最大、最為珍貴的一株，是大自然留給我們的珍貴的植物資源。同時黃帝手植柏見證了中華民族5 000 a來的興衰，具有特殊的歷史和文化意義，是我國寶貴的歷史文化遺產(chǎn)[2]，目前已被列為陜西省特級古樹名木[3]。通過黃帝手植柏能了解該區(qū)域幾千年來的自然變遷[4]，有極高的科研價值。近年來，黃帝手植柏由于年齡以及自然、人為等因素的影響，長勢逐漸衰弱[5]，樹干內(nèi)部也出現(xiàn)腐蝕空洞現(xiàn)象[6]，因此，對黃帝手植柏進(jìn)行克隆保存工作已迫在眉睫。

組織培養(yǎng)技術(shù)是植物克隆的重要手段，但植物組織培養(yǎng)過程中存在無性系變異的問題[7]，不同的增殖途徑，子代變異率不同。為了盡可能降低組培過程中的變異率，腋芽增殖途徑成為黃帝手植柏組織培養(yǎng)的首選方法[8]。

目前，齊力旺等[9]、趙育新[10]和徐龍光[11]分別對側(cè)柏、側(cè)柏古樹、黃帝手植柏進(jìn)行了組織培養(yǎng)方面的研究，成功建立了側(cè)柏和側(cè)柏古樹的離體培養(yǎng)技術(shù)，對黃帝手植柏的組織培養(yǎng)則成功誘導(dǎo)了不定芽，但未能生根[11]。側(cè)柏本身屬于難生根植物，而黃帝手植柏5 000 a的年齡使得生根更是難上加難，同時作為受保護(hù)的古樹名木，材料采摘有限。因此，本研究先以3個不同年齡的側(cè)柏莖段為外植體，通過腋芽增殖途徑，研究側(cè)柏莖段培養(yǎng)快繁技術(shù)，分析年齡對側(cè)柏莖段培養(yǎng)的影響。在此基礎(chǔ)上，篩選適宜的培養(yǎng)基進(jìn)行黃帝手植柏莖段培養(yǎng)快速繁殖，優(yōu)化培養(yǎng)技術(shù)，初步建立黃帝手植柏莖段培養(yǎng)快繁體系，為以后進(jìn)行黃帝手植柏克隆奠定技術(shù)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗材料分別為陜西省咸陽市楊凌區(qū)西北農(nóng)林科技大學(xué)(108.06°E，34.25°N)南校區(qū)50 a左右(本研究中統(tǒng)一稱為50 a)的側(cè)柏以及陜西省延安市黃陵縣黃帝陵(109°16′E，35°35′N)中800、3 000 a左右(本研究中統(tǒng)一稱為800、3 000 a)的側(cè)柏和黃帝手植柏。選取生長健壯、枝莖飽滿、無病蟲害的1年生枝條頂部嫩梢作為外植體，除黃帝手植柏外，其他3個年齡段的側(cè)柏各選3～5株采樣母樹進(jìn)行采集。其中50 a側(cè)柏于2018年3月采集，800、3 000 a側(cè)柏于同年6月采集，黃帝手植柏于次年3月采集。

1.2 培養(yǎng)條件

培養(yǎng)溫度25±2 ℃，光照時間16 h·d-1，光照強(qiáng)度2 000 lx。培養(yǎng)基均加入30 g·L-1蔗糖和7 g·L-1瓊脂，pH均為5.8～6.2。

1.3 研究方法

1.3.1 側(cè)柏莖段培養(yǎng)快繁

1.3.1.1 外植體消毒 將側(cè)柏1年生枝條的頂部嫩梢剪成2～3 cm帶有頂芽和5～8個側(cè)枝的莖段，使用洗潔精溶液浸泡30 min，然后在自來水下沖洗4 h；將沖洗好的莖段在超凈工作臺上，先用75%酒精浸泡30 s，無菌水沖洗3次，再用0.1%升汞分別處理4、6、8、10、12、14 min，用無菌水沖洗3次后使用無菌濾紙吸掉外植體表面水分，切除外植體底部傷口與升汞接觸部分，接種至1/2 MS培養(yǎng)基上。每個處理均接種30～40瓶，每瓶接種1個外植體。30 d后統(tǒng)計污染率和存活率。

污染率=污染數(shù)/接種數(shù)×100%

(1)

死亡率=死亡數(shù)/接種數(shù)×100%

(2)

存活率=100%-死亡率-污染率

(3)

1.3.1.2 啟動培養(yǎng) 選擇外植體消毒試驗中效果最好的消毒方法處理外植體后，將其接種至啟動培養(yǎng)基上。

啟動培養(yǎng)基處理為：1)1/2MS；2)MS；3)MS+0.1 mg·L-1NAA+0.1 mg·L-16-BA；4)MS+0.2 mg·L-1NAA+0.1 mg·L-16-BA；5)MS+0.1 mg·L-1NAA+0.3 mg·L-16-BA。

50、800、3 000 a側(cè)柏均使用1)～5)作為啟動培養(yǎng)基。每個處理均接種30～40瓶，每瓶接種1個外植體。30 d后統(tǒng)計啟動率和外植體生長狀況。

啟動率=恢復(fù)生長外植體個數(shù)/無菌外植體個數(shù)×100%

(4)

1.3.1.3 增殖培養(yǎng) 分別以不同基本培養(yǎng)基(MS、DKW、WPM)、不同的激素配比(篩選出最佳基本培養(yǎng)基后加入不同濃度激素，分別為NAA：0.01、0.1、0.2，6-BA：0.1、0.3、0.5)、不同濃度的大量元素(1/4MS、1/2MS、3/4MS、MS)設(shè)置增殖培養(yǎng)基處理，將經(jīng)過啟動培養(yǎng)恢復(fù)生長并且生長良好的50 a側(cè)柏?zé)o菌苗接種至增殖培養(yǎng)基上進(jìn)行增殖培養(yǎng)。每個處理均接種10瓶，每瓶接種1株無菌苗，進(jìn)行3次重復(fù)。30 d后統(tǒng)計增殖系數(shù)和無菌外植體生長狀況。

以相同方法(僅將激素配比試驗中的NAA梯度調(diào)整為0.1、0.2、0.3，6-BA調(diào)整為0.1、0.2、0.3，其余試驗全部不變)進(jìn)行800、3 000 a側(cè)柏增殖培養(yǎng)試驗。

增殖系數(shù)=分割前接種個數(shù)/分割后植株個數(shù)

(5)

1.3.1.4 生根培養(yǎng) 分別以不同基本培養(yǎng)基(MS、DKW、B5、White)、不同的激素配比(篩選出最佳基本培養(yǎng)基加入不同濃度激素，分別為IBA：0.1、0.2、0.3；6-BA：0.1、0.2、0.3)、不同濃度的大量元素(1/4MS、1/2MS、3/4MS、MS)設(shè)置生根培養(yǎng)基處理，選擇高3 cm、生長健壯的側(cè)柏?zé)o菌苗進(jìn)行生根培養(yǎng)，將其接種至生根培養(yǎng)基上，連續(xù)培養(yǎng)60 d。每個處理均接種9瓶，每瓶接種1株無菌苗，進(jìn)行3次重復(fù)，60 d后統(tǒng)計生根率及根系生長狀況。

生根率=生根株數(shù)/接種數(shù)×100%

(6)

1.3.1.5 煉苗移栽 當(dāng)根生長至2 cm時，進(jìn)行煉苗移栽驗試驗。在人工氣候箱中閉瓶強(qiáng)光煉苗7 d后，逐漸打開瓶蓋，然后移栽至腐殖土∶蛭石∶珍珠巖=2∶1∶1的基質(zhì)中，日常澆水管理，30 d后記錄成活率。

1.3.2 黃帝手植柏克隆 在1.3.1的基礎(chǔ)上，分析年齡對側(cè)柏莖段培養(yǎng)各階段的影響，選擇可能適宜黃帝手植柏莖段培養(yǎng)的培養(yǎng)基，以相同方法進(jìn)行莖段培養(yǎng)快速繁殖，確定黃帝手植柏升汞最佳消毒時間和各階段最適培養(yǎng)基。

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 22.0對數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析和Duncan多重比較(對百分?jǐn)?shù)據(jù)先經(jīng)平方根反正弦轉(zhuǎn)換)。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同消毒方法的消毒效果

在試驗范圍內(nèi)(表1)，消毒時間對污染率的影響在不同年齡間表現(xiàn)較為一致，污染率均隨消毒時間延長而降低。采樣母樹年齡為50 a時，可以近似認(rèn)為側(cè)柏死亡率不受消毒時間影響，存活率隨污染率降低而提升。而采樣母樹年齡為800、3 000 a時，較長的消毒時間會使側(cè)柏出現(xiàn)死亡現(xiàn)象，導(dǎo)致存活率略有下降。因此，黃帝手植柏消毒時間不宜太長，選擇6、8、10 min進(jìn)行黃帝手植柏消毒試驗。

由表1可見，黃帝手植柏莖段的污染率和存活率隨消毒時間的總體變化趨勢與普通側(cè)柏莖段消毒試驗結(jié)果一致，可以直接根據(jù)存活率進(jìn)行選擇，黃帝手植柏外植體升汞消毒8 min時存活率最高，為72.98%。

表1 不同消毒時間的消毒效果Table 1 Disinfection effect of different disinfection time

2.2 不同培養(yǎng)基對側(cè)柏莖段啟動培養(yǎng)的影響

將側(cè)柏莖段接種到啟動培養(yǎng)基上培養(yǎng)14 d，其頂芽和各個側(cè)枝出現(xiàn)嫩綠新梢(圖1a)，表明頂芽開始萌發(fā)，側(cè)柏莖段恢復(fù)生長，一段時間后，側(cè)芽開始萌發(fā)(圖1b)。通過3個年齡段側(cè)柏的啟動培養(yǎng)試驗(表2)，發(fā)現(xiàn)3個年齡段的側(cè)柏在不同培養(yǎng)基上均能恢復(fù)生長，且啟動率均大于90%，說明側(cè)柏在組培過程中極易啟動。

黃帝手植柏啟動試驗結(jié)果與普通側(cè)柏的試驗結(jié)果相同(表2)，黃帝手植柏莖段在不同培養(yǎng)基上均能啟動，且啟動率均大于90%，結(jié)合黃帝手植柏生長狀況，可以選擇MS+0.1 mg·L-1NAA+0.1 mg·L-16-BA作為黃帝手植柏適宜啟動培養(yǎng)基。

表2 不同培養(yǎng)基對啟動培養(yǎng)的影響Table 2 Effect of different media on starting culture

2.3 不同培養(yǎng)基對側(cè)柏莖段增殖培養(yǎng)的影響

通過腋芽增殖途徑進(jìn)行側(cè)柏增殖培養(yǎng)(圖1c)，將恢復(fù)生長后生長良好的莖段轉(zhuǎn)入增殖培養(yǎng)基，培養(yǎng)一段時間后，莖段上部枝條生長明顯，下部枝條生長較慢(圖1d)。由表3可知，3個年齡段的側(cè)柏增殖培養(yǎng)中，最佳基本培養(yǎng)基均為MS基本培養(yǎng)基，且在一定濃度范圍內(nèi)，6-BA和NAA均能促進(jìn)側(cè)柏生長，提高增殖系數(shù)。但6-BA濃度過高會誘導(dǎo)許多不定芽產(chǎn)生(圖1e)，導(dǎo)致子代變異率升高，因此在增殖培養(yǎng)中6-BA濃度不宜太高。同時，3個年齡段的側(cè)柏在增殖培養(yǎng)過程中，對激素濃度的要求不完全相同，更高的激素濃度能進(jìn)一步促進(jìn)50 a側(cè)柏生長，50 a側(cè)柏最佳增殖培養(yǎng)基為MS+0.2 mg·L-1NAA+0.3 mg·L-16-BA。800 a和3 000 a側(cè)柏則更適宜在中等水平的激素濃度下進(jìn)行增殖培養(yǎng)，最佳增殖培養(yǎng)基分別為MS+0.1 mg·L-1NAA+0.3 mg·L-16-BA和3/4MS+0.1 mg·L-1NAA+0.3 mg·L-16-BA。

選擇增殖系數(shù)在3個年齡段中均比較高，尤其在古樹增殖培養(yǎng)中效果較好的5種培養(yǎng)基進(jìn)行黃帝手植柏增殖培養(yǎng)(表3)。結(jié)果表明，黃帝手植柏莖段培養(yǎng)增殖系數(shù)較低，均小于3。其中A5和A7培養(yǎng)基上增殖效果較好，培養(yǎng)基為A7時增殖系數(shù)最高，為2.52，因此黃帝手植柏的適宜增殖培養(yǎng)基為MS+0.1 mg·L-1NAA+0.2 mg·L-16-BA。

表3 不同培養(yǎng)基對增殖培養(yǎng)的影響Table 3 Effect of different medium on proliferation culture

2.4 不同培養(yǎng)基對側(cè)柏莖段生根培養(yǎng)的影響

在側(cè)柏莖段生根培養(yǎng)30 d后，逐漸出現(xiàn)生根現(xiàn)象。絕大多數(shù)莖段生根都是先在莖段底部形成一小塊愈傷組織，再由愈傷組織分化出不定根(圖1f)。僅有極少數(shù)莖段可以不經(jīng)過愈傷組織階段，直接由莖段底部生根(圖1g)。側(cè)柏生根較為困難(表4)，其中50 a側(cè)柏雖然在大多數(shù)培養(yǎng)基中均能生根，但生根率普遍較低，僅B3和B7培養(yǎng)基的生根率較高，且只有極少數(shù)莖段可以直接分化出根，50 a側(cè)柏生根培養(yǎng)最佳培養(yǎng)基為MS+0.2 mg·L-1IBA+0.1 mg·L-16-BA+0.1 mg·L-1NAA，生根率為38.46%；800 a和3 000 a側(cè)柏僅在少數(shù)培養(yǎng)基上可以生根，且生根率都極低，幾乎所有的根都是由愈傷組織分化而來。兩者最佳生根培養(yǎng)基均為MS+0.1 mg·L-1IBA+0.1 mg·L-16-BA+0.1 mg·L-1NAA，生根率分別為23.08%和11.53%。

表4 不同培養(yǎng)基對50、800、3 000 a側(cè)柏生根培養(yǎng)的影響Table 4 Effect of different media on rooting culture for the 50-,800-,and 3 000-year-old P.orientalis trees

以800、3 000 a側(cè)柏生根培養(yǎng)結(jié)果為依據(jù)，選擇B1、B3、B5、B7、B10作為黃帝手植柏生根培養(yǎng)基進(jìn)行生根培養(yǎng)，結(jié)果表明(表5)：篩選出的5種生根培養(yǎng)基中，有3種可以使黃帝手植柏生根。3種培養(yǎng)基激素配比均為0.1 mg·L-1IBA+0.1 mg·L-16-BA+0.1 mg·L-1NAA，區(qū)別在于基本培養(yǎng)基，按生根率由高到低排列為：MS、DKW、1/2MS，其中基本培養(yǎng)基為MS時生根率最高，為10%，顯著高于其余2種基本培養(yǎng)基。因此可以選擇MS+0.1 mg·L-1IBA+0.1 mg·L-16-BA+0.1 mg·L-1NAA作為黃帝手植柏適宜生根培養(yǎng)基。

表5 不同培養(yǎng)基對黃帝手植柏生根培養(yǎng)的影響Table 5 Effect of different medium on rooting culture for the P.orientalis tree planted by Huangdi

2.5 煉苗移栽

煉苗移栽30 d后，50 a側(cè)柏生長健壯(圖1h)，成活率為50%。800、3 000 a側(cè)柏和黃帝手植柏均未能成活。

3 結(jié)論與討論

本研究在外植體消毒試驗中發(fā)現(xiàn)升汞消毒時間對側(cè)柏莖段消毒效果的影響并不顯著，這一結(jié)果與其他植物組織培養(yǎng)，如楊志堅等[12]在金邊龍舌蘭組培和賓宇波等[13]在百花山葡萄組培的結(jié)果不一致。植物組織培養(yǎng)中，消毒效果會受到消毒劑組合、消毒時長、外植體類型、采摘時間等因素的影響[14-16]。結(jié)合側(cè)柏的生物學(xué)性狀，原因可能是側(cè)柏葉片為鱗狀，包被在枝上，消毒劑難以深入葉片與枝條的縫隙中，莖段表面與升汞接觸不充分，影響了消毒效果。同時側(cè)柏莖段表面有一層油狀分泌物，難以完全去除，也會影響消毒效果。

啟動培養(yǎng)試驗發(fā)現(xiàn)，側(cè)柏極易啟動，各處理啟動率均大于90%。不過啟動培養(yǎng)一段時間后，培養(yǎng)基會出現(xiàn)褐化現(xiàn)象，但褐化較輕，對莖段啟動生長影響也較小，同時大多數(shù)莖段在14 d左右便可恢復(fù)生長，因此可以在啟動后不久便進(jìn)行繼代增殖培養(yǎng)，繼代后褐化現(xiàn)象基本消失。許多研究均采用了縮短繼代周期的方法來減輕褐化，如朱立新等[17]在紫葉稠李組織培養(yǎng)研究中、饒寶蓉[18]在杉木苗組培研究中均采用這種方式成功降低了褐化的影響。

莖段增殖培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)，各年齡、各處理的莖段增殖系數(shù)普遍較低，增殖系數(shù)均小于3，這與側(cè)柏自身特性以及增殖途徑有關(guān)，側(cè)柏本身就具有生長緩慢的特點，而且年齡也對生長有一定影響，導(dǎo)致組培過程中莖段生長極為緩慢。本研究為了降低組培中存在的無性系變異，采用腋芽增殖途徑進(jìn)行莖段增殖，腋芽增殖的增殖系數(shù)要比不定芽增殖低上許多[19]，這也會導(dǎo)致增殖系數(shù)不高。本研究發(fā)現(xiàn)黃帝手植柏最佳增殖基本培養(yǎng)基為MS，這與徐龍光等[20]的結(jié)果有所區(qū)別，可能是因為增殖途徑不同。此外，組培過程中進(jìn)行無菌苗分割時，如果分割出無菌苗過小會導(dǎo)致其容易死亡，因此為了提高分割后莖段成活率，盡量使切割后的無菌苗高度大于2 cm并且具有一定數(shù)量側(cè)枝，這也會在一定程度上影響增殖系數(shù)。

生根困難是柏科植物組織培養(yǎng)中存在的技術(shù)難點[21-22]，黃帝手植柏5 000 a的樹齡更是導(dǎo)致生根難上加難。本研究中，50 a側(cè)柏大多數(shù)都是先由莖段基部脫分化形成愈傷組織，然后由愈傷組織再分化出根，少量莖段可以直接分化出根。側(cè)柏古樹由于長勢衰弱，分化能力下降，基本都是愈傷生根。愈傷組織生出的根系遠(yuǎn)差于莖段直接分化出的根系，因為根與莖之間沒有直接連通，需要愈傷組織再分化形成輸導(dǎo)組織，如果沒有輸導(dǎo)組織，根系吸收的營養(yǎng)不能傳輸給地上部分，移栽后植株就會死亡。同時，愈傷組織遠(yuǎn)比其他組織疏松，導(dǎo)致煉苗移栽過程根系極易脫落。因此，800、3 000 a側(cè)柏和黃帝手植柏培養(yǎng)出的根雖然都生長較為健壯，但移栽后植株依然難以成活。

本研究通過分析3個年齡段的側(cè)柏莖段培養(yǎng)結(jié)果，成功篩選出了黃帝手植柏各階段適宜培養(yǎng)基，初步建立了黃帝手植柏莖段培養(yǎng)繁殖體系。但在生根培養(yǎng)中依然存在問題，黃帝手植柏生根是由愈傷組織分化出根系，生根率低且根系質(zhì)量也較差，導(dǎo)致煉苗移栽難以成活，需進(jìn)一步研究。