毛竹AUX1/LAX候選基因家族鑒定與表達分析

楊 樂，張 康，李 龍

(西北農(nóng)林科技大學 林學院，陜西 楊陵 712100)

生長素是植物中發(fā)現(xiàn)最早且最為重要的一類激素。生長素合成于幼嫩的組織中，通過AUX1/LUX、PIN等蛋白家族轉(zhuǎn)移至各個不同的部位，在植物的形態(tài)建成、細胞生長、根系發(fā)育調(diào)控以及抗逆脅迫中均發(fā)揮著重要的作用[1-2]。其中，生長素輸入載體在生長素濃度梯度的調(diào)控及維持中具有重要作用[2]。在擬南芥(Arabidopsisthaliana)中發(fā)現(xiàn)共有4個生長素輸入載體，包括AUX1(AUXINRESISTANTI)、LAX1(LIKEAUXINRESISTANT 1)、LAX2和LAX3[3]。其中，AUX1是最早被發(fā)現(xiàn)的生長素輸入載體，氨基酸序列分析表明，AUX1與通透酶具有較高的同源性，該蛋白可以高效、特異的介導生長素從質(zhì)膜外進入細胞內(nèi)[4-5]。在擬南芥中，AUX1在根的表皮細胞、中柱細胞及初生韌皮部細胞的頂部中表達。aux1的突變會導致個體重力性喪失，外源施加NAA能恢復突變表型，而外施2,4-D并不能恢復突變體表型[6]。LAX1/2/3是高度保守的跨膜蛋白，廣泛參與植物根的向地性、葉序發(fā)育、側(cè)根形成等生物學過程。aux1和lax1/2/3的四突變體與野生型相比，葉序排列發(fā)生改變，并且胚根的發(fā)育極度混亂[7]。

毛竹(Phyllostachysedulis)是植物界生長最快的植物，在分類學上屬于禾本科、竹亞科、剛竹屬，是東亞地區(qū)重要的林業(yè)資源之一。竹材可用于造紙、家具制作、建筑等領(lǐng)域，竹筍可用于食用，每年可產(chǎn)生1 840億美元的林業(yè)產(chǎn)值[8]。此外，毛竹根系發(fā)達，具有很強的固水能力，且具有很強的根鞭繁殖能力，因此毛竹在解決生態(tài)環(huán)境惡化、資源匱乏等方面具有不可替代的作用[8]。在氣候適宜的春季，毛竹單日最高生長高度可達1.5 m，在短短45～60 d便可完成高達15～20 m的稈型生長[9-11]，因此毛竹奇特的筍-竹生長模式一直是研究熱點。

目前，在擬南芥、水稻(Orazasativa)等模式植物中雖已有AUX1/LAX的相關(guān)報道，但在毛竹中關(guān)于AUX1/LAX的研究仍是一個空白，毛竹中共有多少個AUX1/LAX候選基因，他們是否參與毛竹筍的生長發(fā)育尚不明確。本研究利用毛竹基因組信息，結(jié)合AUX1/LAX候選基因特征，在全基因組水平對毛竹AUX1/LAX候選基因進行了鑒定，并對AUX1/LAX候選基因的數(shù)量、進化關(guān)系、基因結(jié)構(gòu)和不同組織，特別是不同生長發(fā)育時期竹筍中的表達模式進行了分析，為將來進一步開展PheAUX1/LAX的功能和調(diào)控機制研究奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 毛竹AUX1/LAX候選基因鑒定

擬南芥以及水稻的AUX1/LAX蛋白序列分別下載于The Arabidopsis Information Resource (TAIR)數(shù)據(jù)庫和Rice Genome Annotation Project數(shù)據(jù)庫。毛竹的基因組數(shù)據(jù)下載于Gigadb Database[12]。以擬南芥和水稻AUX1/LAX蛋白序列為種子序列，閾值設(shè)置為e-7，在構(gòu)建的毛竹本地數(shù)據(jù)庫中進行BLASTP同源比對，所得序列為毛竹潛在AUX1/LAX基因家族成員，之后再通過Pfam數(shù)據(jù)庫驗證這些序列所包含的結(jié)構(gòu)域，只有包含AUX1/LAX蛋白典型結(jié)構(gòu)域的序列才被認為是毛竹AUX1/LAX候選基因家族成員[13-14]。

1.2 系統(tǒng)進化樹構(gòu)建

利用ClustalW對AUX1/LAX氨基酸序列進行多序列比對分析，比對結(jié)果通過IQ-Tree構(gòu)建系統(tǒng)進化樹。執(zhí)行參數(shù)為最大似然法，Bootstrap 重復設(shè)置為1 000次，采用最適合建樹模式(best fit tree model)，經(jīng)篩選發(fā)現(xiàn)JTT+R3為最適合建樹模式[15-16]。

1.3 基因結(jié)構(gòu)和基序分析

利用在線軟件MEME對毛竹Aux1/LAX蛋白保守基序進行分析，檢索的最大motif 數(shù)設(shè)置為6，其他參數(shù)選擇默認參數(shù)[17]。在毛竹基因組數(shù)據(jù)庫下載GFF文件，將GFF文件輸入TBTools分析候選Aux1/LAX的基因結(jié)構(gòu)[18]。

1.4 毛竹Aux1/LAX候選基因染色體定位和共線性分析

根據(jù)毛竹基因組GFF注釋文件獲取AUX/LAX候選基因家族成員的染色體位置信息；利用MCScanX軟件計算并獲取共線性區(qū)塊及基因的串聯(lián)重復信息[19]；利用Circos軟件對毛竹AUX1/LAX候選基因的染色體位置信息、共線性關(guān)系進行可視化[20]。

1.5 Aux1/LAX候選基因轉(zhuǎn)錄組表達數(shù)據(jù)分析

在NCBI下載毛竹不同生長莖稈的RNA-seq數(shù)據(jù)(GSE90517，PRJNA604634)，包括1.5 cm和8 cm高的毛竹幼苗莖稈、冬筍(15 cm高)、春筍(1.5 m高)、竹鞭、跳鞭。從中提取PheAux1/LAX家族候選基因的FPKM 值(Fragments Per Kilobase of transcript per Million fragments mapped)[21]，利用Morpheus進行熱圖繪制。

1.6 實時定量PCR

根據(jù)毛竹不同的發(fā)育階段，選取7個不同高度的竹筍筍尖代表不同的竹筍生長發(fā)育時期，分別為冬筍，50、100、300、600、900、1 200 cm高的春筍，命名為S1，S2，S3，S4，S5，S6和S7。采集時間從2020年1月15日(冬筍)開始直至筍快速生長基本停止。取得的筍尖部分在剖去籜殼，液氮速凍后，置于-80 ℃冰箱中保存。利用TRizol法提取不同筍組織的mRNA，采用Prime Script TM RT Reagent Kit (TaKaRa，Japan)反轉(zhuǎn)錄試劑盒，將mRNA樣品反轉(zhuǎn)錄成cDNA。參照SYBR? Green Realtime PCR Master Mix (Roche，Mannheim，Germany)試劑盒的說明書對基因在不同筍組織中的表達展開分析[22]。具體反應(yīng)體系為：Water，PCR-grade，7.2 μL；Primer F，0.4 μL；Primer R，0.4 μL；SYBR Master Mix，10 μL；cDNA(20 ng·μL-1)，2 μL。PCR程序設(shè)置為：預(yù)熱溫度設(shè)置成95 ℃，5 min。擴增一共設(shè)置45個循環(huán)，具體步驟為95 ℃，10 s；55 ℃，10 s；72 ℃，20 s。qRT-PCR引物見表1。

表1 qRT-PCR引物Table 1 The primers used for qRT-PCR analysis

2 結(jié)果與分析

2.1 毛竹AUX1/LAX候選基因的鑒定及理化特征

根據(jù)擬南芥和水稻AUX1/LAX的氨基酸序列在毛竹基因組數(shù)據(jù)庫中進行BLAST搜索、篩選和驗證，共鑒定到8個毛竹AUX1/LAX候選基因(表2)。在PheAUX1/LAX候選基因編碼的蛋白質(zhì)中，氨基酸的數(shù)目476～534個。分子量為53 155.22～59 132.68 u，理論等電點變化范圍為8.27～9.08。亞細胞定位預(yù)測除PH02Gene05025.t1定位在細胞膜、液泡；PH02Gene07716.t1定位在細胞膜、細胞核、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)以外，其余6個PheAUX1/LAX候選成員均定位在細胞膜、液泡和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上。

表2 PheAUX1/LAX候選基因的理化性質(zhì)Table 2 Physicochemical properties of putative PheAUX1/LAX gene family

2.2 PheAUX1/LAX候選基因的系統(tǒng)進化及基因序列分析

使用IQ-Tree軟件對擬南芥、水稻和毛竹AUX1/LAX氨基酸序列構(gòu)建系統(tǒng)進化樹(圖1a)。根據(jù)系統(tǒng)發(fā)育樹，AUX1/LAX候選基因分為2個亞組：ClassⅠ和ClassⅡ。其中ClassⅠ包括2 個擬南芥、3個水稻、5個候選毛竹成員；ClassⅡ包括2個擬南芥、3個水稻、3個候選毛竹成員。

基序分析表明，候選AUX1/LAX的氨基酸序列在物種內(nèi)和物種間均非常保守，通過MEME軟件分析發(fā)現(xiàn)所有水稻、擬南芥、毛竹候選AUX1/LAX的成員均包含6個保守基序?；蚪Y(jié)構(gòu)分析表明，classⅠ的基因包含6～7個外顯子，而ClassⅡ的基因包含8～10個外顯子(圖2)。

2.3 毛竹AUX1/LAX候選基因的染色體定位和共線性分析

染色體定位發(fā)現(xiàn)，5、7、14、15、16、21號染色體上分別有1個AUX1/LAX基因，13號染色體上有2個AUX1/LAX候選基因。共線性分析發(fā)現(xiàn)，有3對AUX1/LAX候選基因位于共線性區(qū)段，對這3對基因所在的染色體進行共線性分析發(fā)現(xiàn)，3對染色體均存在大量的共線性區(qū)域，表明毛竹進化史上的染色體復制事件(7～12百萬年前)在候選PheAUX1/LAX基因家族成員擴增中發(fā)揮著重要的作用(圖3)。

2.4 PheAUX1/LAX候選基因在不同組織中的表達模式

為了探討PheAUX1/LAX候選基因在不同組織中的表達模式，基于先前發(fā)表的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)對8個基因在1.5 cm高幼莖、8 cm高幼莖、冬筍、春筍、跳鞭、竹鞭、鞭芽中的表達量進行了分析，發(fā)現(xiàn)毛竹PheAUX1/LAX候選基因在不同的組織或器官中的表達模式有明顯的差異(圖4)。其中，4個PheAUX1/LAX候選基因在冬筍中表達豐度最高，且這4個基因均屬于classⅠ。PH02Gene46624.t1在1.5 cm高幼莖中表達豐度最高，PH02Gene38722.t1在跳鞭中表達豐度較高，而PH02Gene37523.t1和PH02Gene07716.t1在7個樣品組織中均呈現(xiàn)出較低的表達豐度。

8個PheAUX1/LAX候選基因中有4個在冬筍中表達豐度最高，表明PheAUX1/LAX在筍生長發(fā)育過程中發(fā)揮著重要作用，因此，通過qRT-PCR技術(shù)對8個PheAUX1/LAX候選基因在不同生長發(fā)育時期筍中的表達量進行分析(圖5)，發(fā)現(xiàn)除了PH02Gene07716.t1和PH02Gene37523.t1以外的其余6個基因與成熟莖稈(CK)相比，在不同筍生長時期均呈現(xiàn)出不同程度的上調(diào)表達，而PH02Gene07716.t1和PH02Gene37523.t1均屬于ClassⅡ成員。PH02Gene05025.t1、PH02Gene14146.t1、PH02Gene11253.t1和PH02Gene17079.t1隨著筍高度增加呈現(xiàn)出逐漸降低的表達趨勢。

3 結(jié)論與討論

3.1 結(jié)論

AUX1/LAX基因作為生長素輸入載體廣泛參與植物生長的生長發(fā)育，而目前尚未有關(guān)于AUX1/LAX在毛竹中的研究報道。分析表明毛竹PheAUX1/LAX候選基因分為Class Ⅰ和Class Ⅱ 2個亞組，其中class Ⅰ的候選基因包含6～7個外顯子，而ClassⅡ的候選基因包含8～10個外顯子。表達量分析表明多數(shù)Class Ⅰ成員在毛竹冬筍中高豐度表達，而Class Ⅱ中的PH02Gene38722.t在跳鞭中高豐度表達。通過qRT-PCR對AUX1/LAX候選基因在不同生長發(fā)育時期筍中的表達量分析表明，有6個基因與對照相比呈現(xiàn)出不同程度的上調(diào)表達，表明PheAUX1/LAX候選基因廣泛參與毛竹筍的生長發(fā)育。

3.2 討論

對不同物種AUX1/LAX的數(shù)量統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)，在擬南芥中共有4個AUX1/LAX成員[23]，在水稻中共有6個AUX1/LAX成員24]，而在毛竹中共鑒定出8個AUX1/LAX候選成員，多于水稻和擬南芥中的數(shù)量。共線性分析發(fā)現(xiàn)，有3對AUX1/LAX候選基因位于共線性區(qū)段，對這3對基因所在的染色體進行共線性分析，發(fā)現(xiàn)每對染色體之間都有大量的共線性區(qū)域存在，表明毛竹進化史上的染色體復制事件(7～12 mya)在PheAUX1/LAX候選基因家族成員擴增中發(fā)揮著重要的作用。

在毛竹筍生長發(fā)育過程中，有6個AUX/LAX候選基因在所有的7個生長發(fā)育時期呈現(xiàn)出不同程度的上調(diào)表達。有研究表明，AtAUX1主要在擬南芥根尖和側(cè)根根冠原生木質(zhì)部中表達并在生長素運輸中發(fā)揮著重要功能[23]；AtLAX3能增強細胞壁重塑酶活性，從而增強根原基細胞的分裂和分化能力[25]；楊樹PtAUX1基因的超表達會改變植株再生芽分生組織中IAA的流向并影響植株對光照的敏感性[26-27]；將櫻桃PaLAX1轉(zhuǎn)入擬南芥和水稻發(fā)現(xiàn)過表達株系中內(nèi)源IAA的含量增加[28]。而在本研究中，Class Ⅰ基因中的PH02Gene14146.t1、PH02Gene05025.t1、PH02Gene11253.t1、PH02Gene17079.t1在毛竹冬筍中的表達量是最高。qRT-PCR分析發(fā)現(xiàn)，8個AUX1/LAX候選基因中的6個在毛竹快速生長過程中呈現(xiàn)不同程度的上調(diào)

表達，并多數(shù)隨著筍的生長發(fā)育呈現(xiàn)出逐漸降低的表達趨勢。之前的研究表明，筍組織的細胞分裂和細胞伸長生長共同促進了筍的快速生長，其中在快速生長前期以細胞分裂為主，后期以細胞伸長生長為主[29]。而AUX1/LAX候選基因在冬筍期和快速生長前期的高豐度表達，表明這些基因在竹筍分生組織中通過增強細胞壁重塑酶活性，從而增強筍分生組織細胞的分化和分裂能力。本研究將為毛竹AUX1/LAX基因家族各基因的具體功能研究提供一定的理論依據(jù)和數(shù)據(jù)支撐。