鹽脅迫下擬南芥去乙酰化酶基因的轉(zhuǎn)錄組分析

歐藝鵬, 黃軒雅, 陳功春, 林 娟

(復(fù)旦大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院遺傳工程國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 上海 200438)

1 引 言

高等植物在整個(gè)生命過程中是固著生長的，它們在面對環(huán)境中的各種不利因素時(shí)，不會向動(dòng)物一樣自由地移動(dòng)和躲避[1]，需要進(jìn)化出一種機(jī)制適應(yīng)這些環(huán)境的變化.因此研究植物在逆境脅迫中的響應(yīng)機(jī)制具有十分重要的意義.植物的逆境響應(yīng)機(jī)制包括代謝途徑的改變和抗逆基因表達(dá)水平的改變，而表觀遺傳修飾在這兩個(gè)過程中均發(fā)揮了重要的作用.在真核生物中，組蛋白乙酰化是最早被發(fā)現(xiàn)的一種組蛋白修飾類型，它是轉(zhuǎn)錄激活的標(biāo)志，是各種氨基酸末端修飾中了解最為清楚的一種.作為一種重要的表觀遺傳現(xiàn)象，這種修飾在調(diào)節(jié)植物不同發(fā)育過程和維持基因組穩(wěn)定中起著重要的作用.組蛋白末端的乙酰化狀態(tài)在組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶(histone acetyltransferase, HAT)[2]和組蛋白去乙?；?(histone deacetylase, HDAC)[3]的作用下保持著動(dòng)態(tài)平衡，并與染色質(zhì)的轉(zhuǎn)錄活性狀態(tài)密切相關(guān)[4，5].

植物中的去乙?；富蜃钤缭谟衩字斜豢寺6]，之后在擬南芥、水稻和大麥中克隆到多個(gè)去乙?；富?在植物中研究的較多是擬南芥中的去乙?；?，已鑒定到的去乙酰化酶成員有18個(gè)，分屬于3個(gè)亞家族：RPD3 (reduced potassium dependency 3)，SIR2 (silent information regulator 2)和HDT (histone deacetylase-tuins)[7].植物受到外界脅迫時(shí)，體內(nèi)抗逆相關(guān)基因表達(dá)水平的改變伴隨著組蛋白的乙?；腿ヒ阴；揎椇腿旧|(zhì)狀態(tài)的改變，繼而影響下游相關(guān)基因的表達(dá)，產(chǎn)生相關(guān)蛋白來適應(yīng)環(huán)境的改變，因此組蛋白去乙?；烧{(diào)控生物逆境與非生物逆境相關(guān)基因的表達(dá)[8-10].以前的研究發(fā)現(xiàn)擬南芥的RPD3亞家族的多個(gè)成員參與了不同的逆境調(diào)控，特別是高鹽脅迫.如HDA19是最早被研究并被證明和植物抗逆相關(guān)的去乙?；富騕11]，HDA19基因突變體hda19-1對ABA和高鹽表現(xiàn)出較高的敏感性，同時(shí)hda19-1植株中ABA誘導(dǎo)基因的表達(dá)也被抑制[12].擬南芥的RPD3亞家族參與的鹽脅迫與特有的一類組蛋白去乙?；窰D2亞家族相關(guān)，如在轉(zhuǎn)基因擬南芥植物中，HD2C的過度表達(dá)賦予了ABA不敏感表型，并增強(qiáng)了對鹽和干旱脅迫的耐受性[13]；HD2C基因的T-DNA 插入突變體hd2c-1 和hd2c-3植株在發(fā)芽期對ABA和NaCl的敏感性增加，幼苗對鹽脅迫的耐受性降低[14].HDA6基因的缺失突變體hda6和RNA干擾植株表現(xiàn)出對ABA和高鹽的敏感性表型[12].HD2C和HDA6在植物體內(nèi)相互作用，共同參與ABA和鹽脅迫反應(yīng).擬南芥中的HD2共包括四個(gè)成員，HD2A,HD2B,HD2C和HD2D，在高鹽處理下四個(gè)基因的表達(dá)水平均受到了影響，除了HD2C基因外，HD2D基因過表達(dá)的擬南芥對干旱、鹽和冷脅迫表現(xiàn)出更強(qiáng)的耐受性[15].HDA6除了能與HD2C相互作用外，還能與HD2D相互作用，HD2D也能與同家族的HD2A和HD2C相互作用，HD2B和HD2C之間也能相互作用[16].這些結(jié)果均顯示擬南芥的組蛋白去乙酰化酶共同參與了植物對高鹽、干旱等環(huán)境壓力基因的調(diào)控.

為了探究高鹽脅迫下，組蛋白的去乙?；冈谥参锏钟瓦m應(yīng)高鹽脅迫中的作用，以及對下游基因的調(diào)控，本研究以擬南芥野生型Col-0和hd2q(四基因突變體)為材料，對生長在1/2 MS培養(yǎng)基和含有150 mmol/L NaCl的1/2 MS 10 d后的幼苗進(jìn)行高通量轉(zhuǎn)錄組測序，分析了擬南芥野生型Col-0和hd2q幼苗在NaCl處理前后差異表達(dá)的基因，并通過比較發(fā)現(xiàn)鹽脅迫下的響應(yīng)大多與組蛋白的去乙酰化相關(guān)，這一研究為搜尋HD2家族調(diào)控的下游基因提供理論依據(jù).

2 材料與方法

2.1 供試材料

擬南芥野生型植物WT(Columbia生態(tài)型)，hd2a(CS348580)，hd2b(SALK_049380C)，hd2c(SALK_129799C)，hd2d(SALK_104071C)購自 Arabidopsis Biological Resource Center at Ohio State University (ABRC, http://abrc.osu.edu).

2.2 方 法

2.2.1HDT單基因純合突變體的檢測 圖1顯示了四種單突變體T-DNA插入的位置，HD2A基因的突變體(hd2a) T-DNA插入位置在HD2A基因的第3外顯子上；HD2B基因的突變體(hd2b) T-DNA插入位置在HD2B基因的啟動(dòng)子上，HD2C基因的突變體(hd2c) T-DNA插入位置在HD2C基因的第5內(nèi)含子上，HD2D基因的突變體(hd2d) T-DNA插入位置在HD2D基因的啟動(dòng)子上(圖1).純合的突變體植株的鑒定根據(jù)網(wǎng)站SIGnAL(Salk Institute Genomic Analysis Laboratory, http://signal.salk.edu/ tdnaprimers. 2.html)提供的方法進(jìn)行檢測.

圖1 hd2q突變體的鑒定(a) HD2家族4個(gè)基因的結(jié)構(gòu)圖和T-DNA插入位置; (b) T-DNA大小帶鑒定(LP、BP、RP為T-DNA相應(yīng)的引物)；(c) hd2q純合植株中HD2家族基因RT-qPCR測定.Actin2用作內(nèi)參基因，實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)差Fig.1 Identification of hd2q mutants

2.2.2HD2D四基因純合突變體的獲得 采用擬南芥雜交的方法獲得四基因純合突變體[17].選擇剛冒白的花朵，剪去多余的部分，只留柱頭，將父本的花粉抖到柱頭上，用套子覆蓋，第二天重復(fù)授粉.將hd2b(♀)和hd2a(♂)雜交，或hd2d(♀)和hd2c(♂)雜交，分別獲得兩個(gè)雙突變體hd2ahd2b和hd2chd2d，再將這兩個(gè)雙突變體hd2chd2d(♀)與hd2ahd2b(♂)雜交，經(jīng)過5代的篩選，得到純合四突變體hd2q(hd2ahd2bhd2chd2d).

2.2.3 材料處理 擬南芥野生型 WT和突變體hd2q的種子在超凈工作臺中，用70%乙醇消毒15 min后，無菌水多次洗滌，均勻點(diǎn)在1/2 MS培養(yǎng)基和含有150 mmol/L NaCl的1/2 MS培養(yǎng)基上.所有植物材料生長條件一致，均培養(yǎng)在恒溫溫室(22 ℃)，濕度65%，光周期為16 h光照，8 h黑暗.

2.2.4 RNA提取、cDNA文庫和深度測序 用CWBIO 公司的植物RNA提取試劑盒提取10 d幼苗的總RNA，吸取部分RNA交給金唯智有限公司使用Illumina HiSeq2000進(jìn)行測序.其余RNA用TaKaRa公司反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA第一鏈.

2.2.5 差異表達(dá)基因(DEG)分析 基因表達(dá)計(jì)算使用Htseq軟件(V0.6.1)，使用FPKM(Fragments Per Kilo bases per Million reads)方法計(jì)算基因表達(dá)量[18]，公式為FPKM=Total exon fragment/[Mapped fragment (millions) × exon length (KB)]. 差異表達(dá)基因以edgeR軟件對WT vs hd2q和WT處理 vs hd2q處理進(jìn)行篩選，篩選標(biāo)準(zhǔn)為P≤0.05且log2 fold change≥1[19].

2.2.6 GO和KEGG富集分析 使用GOSeq v1.34.1和TopGO v2.18.0分析對照組和實(shí)驗(yàn)組的差異基因，獲得每個(gè)基因的GO信息.運(yùn)用KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)網(wǎng)站對所有基因進(jìn)行代謝通路分析，獲得KEGG注釋信息和pathway注釋.

2.2.7 基因表達(dá)量的分析 Real-Time PCR擴(kuò)增使用TaKaRa公司TB GREEN試劑盒，Actin-R為擬南芥的內(nèi)參基因，采用BIO-RAD定量PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增.Real-Time PCR程序?yàn)?5 ℃ (10 min); 95 ℃ (15 s); 60 ℃ (1 min), 40個(gè)循環(huán).根據(jù)程序?qū)С鯟T值數(shù)據(jù)，利用2-ΔΔCT 獲得相對表達(dá)量數(shù)據(jù)，每個(gè)樣本3次生物性重復(fù).

3 結(jié)果與分析

3.1 擬南芥HDAC不同亞家族基因在高鹽條件下的表達(dá)特征

擬南芥全基因組有18個(gè)組蛋白去乙酰化酶基因(HDAC)，以前的研究顯示HD2亞家族中的HD2A，HD2B，HD2C和HD2D在高鹽和ABA處理下總體呈下降趨勢[13]，為了全面了解擬南芥HDAC是否受高鹽調(diào)控，我們采用RT-qPCR的進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究HDAC全家族在不同程度高鹽處理下的表達(dá)特征.在RPD3亞家族中，顯著而持續(xù)地受到模擬高鹽環(huán)境誘導(dǎo)的基因有HDA8和HDA14.其中HDA8的相對表達(dá)量呈現(xiàn)鹽濃度的增加而提高，HDA14的相對表達(dá)量在不同濃度的NaCl處理下持續(xù)維持一種高表達(dá)狀態(tài)(約2.7～2.9倍)(如圖2所示)；相反地，顯著受到高鹽抑制的RPD3亞家族的基因：HDA2，HDA5，HDA15，HDA10和HDA17.其中受到抑制最為明顯的是:HDA2，HDA5和HDA10.另外HDA7和HDA18在幼苗組織中表達(dá)量極低[20]，野生型幼苗在各種高鹽梯度處理下qPCR均沒有檢測到這兩個(gè)基因有效的擴(kuò)增.在HD2亞家族中，顯著而持續(xù)地受到模擬高鹽環(huán)境誘導(dǎo)的基因:HD2C和HD2D；兩者的表達(dá)量均隨鹽濃度的提高而逐漸增加，HD2C的變化幅度高于HD2D(如圖2所示).HD2B基因的表達(dá)量的上升雖未達(dá)2倍的基準(zhǔn)，但從趨勢可以發(fā)現(xiàn)其隨鹽濃度的提高也逐漸增加，只是增加的幅度較小，尚不能判斷為顯著變化.在SIR亞家族中，僅有的兩個(gè)成員SRT1和SRT2在高鹽處理下表達(dá)量變化不顯著.從高鹽處理下整個(gè)HDAC家族mRNA的表達(dá)特征看，HDA8，HDA14，HD2C和HD2D受誘導(dǎo)明顯并且表達(dá)變化的趨勢與鹽濃度的提高較為一致，顯示這些基因與擬南芥幼苗應(yīng)對高鹽環(huán)境有直接聯(lián)系；而HDA2，HDA5，HDA15，HDA10和HDA17則明顯受到高鹽抑制，這些基因主要在擬南芥的發(fā)育胚胎或花序分生組織中表達(dá)[20]，我們推測由于它們在擬南芥幼苗應(yīng)對逆境時(shí)不發(fā)揮作用因而被抑制.

3.2 四突hd2q鑒定

T-DNA大小帶鑒定和Real-time表達(dá)量如圖1.在hd2q四突里，hd2a、hd2b和hd2d的相對表達(dá)量約為0.5，hd2c的相對表達(dá)量為0.02.從表達(dá)量上看，hd2a、hd2b、hd2d為弱表達(dá)，hd2c接近缺失，確定hd2q四突為可以使用的材料.

3.3 深度測序數(shù)據(jù)的質(zhì)控和評估

以擬南芥野生型WT和hd2q(四基因突變體)為材料，對生長在1/2 MS培養(yǎng)基和含有150 mmol/L NaCl的1/2 MS培養(yǎng)基 10 d后的幼苗進(jìn)行高通量轉(zhuǎn)錄組測序.WT和hd2q的RNA-seq分別得到44 252 886和42 723 880條raw reads，經(jīng)質(zhì)控得到的clean reads分別為44 021 642和42 469 556條.WT和hd2q兩端Q30(99.9%堿基正確率)分別為95.12%和95.19%.此外，WT和hd2q的序列比對參考基因組的mapping率分別為97.11%和96.98%.WT處理和hd2q處理的RNA-seq分別得到43 951 068和43 751 982條raw reads，經(jīng)質(zhì)控得到的clean reads分別為43 864 400和43 652 376條.WT處理和hd2q處理兩端Q30(99.9%堿基正確率)分別為94.65%和94.55%.此外，WT處理和hd2q處理的序列比對參考基因組的mapping率分別為96.92%和96.89%.上述結(jié)果共同表明本研究獲得的測序數(shù)據(jù)良好，可滿足后續(xù)分析.

3.4 差異表達(dá)基因的功能分析

WT和hd2q進(jìn)行差異分析，結(jié)果顯示共有25個(gè)差異基因，其中上調(diào)的基因有2個(gè)，下調(diào)的基因有23個(gè).圖3a顯示了富集最顯著的30個(gè)GO分類和功能注釋的結(jié)果，從圖中可以看出生物學(xué)過程、細(xì)胞組分和分子功能3大類中，每個(gè)類別分別包括17、6、7個(gè)功能組.按聚類數(shù)目依次排序?yàn)椋杭?xì)胞外區(qū)域(8)，以種子休眠結(jié)束的胚發(fā)育(5)，脫落酸反應(yīng)(5)，養(yǎng)分庫活動(dòng)(4)等.

WT處理和hd2q處理進(jìn)行差異分析，結(jié)果顯示共有1407個(gè)差異基因，其中上調(diào)的基因有772個(gè)，下調(diào)的基因有635個(gè).圖3b顯示了富集最顯著的30個(gè)GO分類和功能注釋的結(jié)果，從圖中可以看出生物學(xué)過程、細(xì)胞組分和分子功能3大類中，每個(gè)類別分別包括14、4、12個(gè)功能組.按聚類數(shù)目依次排序?yàn)椋杭?xì)胞外區(qū)域(285)，細(xì)胞壁(71)，氧化還原反應(yīng)(70)，質(zhì)外體(59)，植物性細(xì)胞壁(49)等.

圖3 GO數(shù)據(jù)庫注釋(a) WT和hd2q比較組中DEG的GO數(shù)據(jù)庫注釋；(b) WT處理和hd2q處理比較組中DEG的GO數(shù)據(jù)庫注釋.測定在含有150 mmol/L NaCL的1/2 MS培養(yǎng)基生長10 dhd2q幼苗的mRNA表達(dá)譜.Actin2用作內(nèi)參基因，實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)差Fig 3 GO database annotation

3.5 hd2q四突影響的鹽響應(yīng)基因

我們發(fā)現(xiàn)WT處理和和hd2q處理組中共有41個(gè)與鹽響應(yīng)(response to salt stress)途徑相關(guān)的差異基因，其中上調(diào)的基因有27個(gè)，下調(diào)的有14個(gè).我們列舉了響應(yīng)鹽途徑P值最小的10個(gè)基因(如表1、2).由于去乙?；敢种苹虻谋磉_(dá)，所以我們選取鹽響應(yīng)途徑上調(diào)的10個(gè)基因，對hd2q四突進(jìn)行熒光定量PCR驗(yàn)證，結(jié)果與轉(zhuǎn)錄組一致(如圖4).

表1 WT處理和和hd2q處理組響應(yīng)鹽脅迫上調(diào)的基因Tab.1 Genes up regulated in WT and hd2q groups in response to salt stress

圖4 鹽脅迫途徑上調(diào)10個(gè)基因的RT-qPCR驗(yàn)證

4 討 論

基因表達(dá)可以通過表觀遺傳機(jī)制調(diào)節(jié)，包括DNA甲基化，組蛋白修飾和小RNA的作用.這些表觀遺傳機(jī)制是植物適應(yīng)非生物脅迫的重要決定因素[21].鹽脅迫下組蛋白修飾的變化涉及植物發(fā)育和生長的調(diào)節(jié)，染色質(zhì)結(jié)構(gòu)的改變會改變靶基因的表達(dá).HD2家族是植物中特有的HDAC家族，所以我們選擇對hd2q進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序，尋找植物在組蛋白去乙酰化修飾下影響鹽脅迫相關(guān)響應(yīng)的基因.

對照下，hd2q與WT的差異基因比較少.但鹽處理后，hd2q與WT的差異基因有1000多個(gè).說明了HD2家族會調(diào)控鹽脅迫環(huán)境下的基因.對于為什么hdt四突在對照情況下差異基因較少，我們推測可能是因?yàn)樵摷易宀粚儆贖DAC家族中最重要的成員，在正常環(huán)境下不需要HD2家族成員發(fā)揮去乙?；墓δ?，主要依靠其他HDAC家族成員行使功能.HD2家族負(fù)責(zé)的是鹽脅迫環(huán)境下的基因調(diào)控，所以鹽處理組的hd2q差異基因更多.

對鹽處理組的轉(zhuǎn)錄組分析，我們發(fā)現(xiàn)hd2q影響了很多響應(yīng)鹽脅迫的差異基因，并且在一些與鹽相關(guān)的途徑也有差異基因，比如響應(yīng)脫水過程，Na離子運(yùn)輸體等.這說明了HD2家族通過對組蛋白去乙酰化影響了下游一大類基因.在上調(diào)的基因中，發(fā)現(xiàn)有3個(gè)葡萄糖苷酶(表1)，而且這3個(gè)酶BGLU24(log2fold change=3.9)，BGLU28(log2fold change=2.6)和BGLU30(log2fold change=2.4)都屬于同一個(gè)家族，但這3個(gè)基因不屬于同一染色體上，這說明HD2家族可能是特異性調(diào)控這一類基因.這類酶有可能像葡萄糖轉(zhuǎn)移酶一樣可以結(jié)合其他蛋白一起相互作用[22]，未來可以嘗試去乙?；概c葡萄糖苷酶的相互作用實(shí)驗(yàn).在下調(diào)的基因中我們發(fā)現(xiàn)了1個(gè)明星基因HKT1(log2fold change=-5.7).HKT1主要負(fù)責(zé)鈉離子轉(zhuǎn)運(yùn)[23]，是擬南芥響應(yīng)鹽脅迫中比較重要的基因.植物處于鹽脅迫環(huán)境時(shí)會抑制HKT1的表達(dá)，從而減輕鹽脅迫對植物的損傷[24].目前還需要進(jìn)一步的工作來完全闡明植物對鹽脅迫反應(yīng)的組蛋白去乙酰化修飾機(jī)制.我們的研究揭示了HD2家族影響的基因，為以后進(jìn)一步闡明下游機(jī)制提供了基礎(chǔ).

表3 實(shí)驗(yàn)所用引物Tab.3 Primers used in the experiment

(續(xù)表3)上調(diào)基因表達(dá)量測定BGLU24-RF:GGAGATTGTCTAGGCGGACGR:CGGACTATGTGCGATTCCGABGLU28-RF:CCACGTAGACCAACAACGTCR:TTCTCCGACAACCATGAGGTLSU1-RF:AGTGGCGGAGATGAAGACAGR:GGAAGAGCATGCGATCGTGABGLU30-RF:ATCATCGGACCTGGGGAAGAR:TGGTTTTGTACCGTCGTCGTLTP4-RF:TATCAAAGGGTGGGGTGGTGR:TCGTGGAGATGGGATAGGGGIP5P11-RF:TGCATGTGCCTAGTTTCTCTTR:CCCCATTGTCGGCATGTAGTNAC92-RF:TGTCCACGAGTCCAAAGACGR:TGTACCGGACGAATCACGACADC2-RF:ACGTTGGTTCCTGATTCCCTR:CCCAACCATGCAGAAGTGGATGG2-RF:AGATTGGCACAAGGCTTCCAR:AGCAGAAGATGCAACACCGAHEL-RF:TTTGAGAGCCGTGAGTGCTTR:CAAATCCAAGCCTCCGTTGCRT-qPCR內(nèi)參Actin2-RF:CTTGCACCAAGCAGCATGAAR:CCGATCCAGACACTGTACTTCCTT