藏藥五味姜黃膏藥效學(xué)及急性毒性分析

丹增次珍，普布扎西，朱星昊，陳計智，吳宗耀

(1.西藏藏醫(yī)藥大學(xué)藏醫(yī)藥研究所，西藏 拉薩 850000；2.西藏自治區(qū)藏醫(yī)院藥劑科，西藏 拉薩 850000；3.國家中醫(yī)藥管理局監(jiān)測統(tǒng)計中心，北京 100027)

隨著生活水平不斷提高，人們對皮膚健康的關(guān)注度越來越高。目前，西醫(yī)治療皮膚病多以對癥治療為主，常用來治療皮膚病的激素類藥物，雖具有時間短、療效快的特點，但存在用藥依賴性問題。藏醫(yī)藥治療皮膚病具有獨(dú)特療效，已有上千年的歷史，薈萃藏民族千年來藏醫(yī)藥系統(tǒng)的理論基礎(chǔ)和豐富的臨床經(jīng)驗，對皮膚病病因、癥狀診療、預(yù)防養(yǎng)顏等獨(dú)具特色，形成治療皮膚病的藏藥古方秘方。據(jù)文獻(xiàn)[1]記載，有關(guān)藏醫(yī)治療皮膚病古籍挖掘到成藥古方有959種，經(jīng)過篩查整理后，有392種單味藥，其中礦物藥67種、植物藥212種、動物藥113種，從中選擇主要的藥物，對藥味和化味、功能、古方來源等內(nèi)容整合后發(fā)現(xiàn)，在藏醫(yī)古籍文獻(xiàn)[2]中，治療朗秀病(濕疹)的五味姜黃膏出現(xiàn)頻率19次，加減方法最多，各時期使用普遍，五種藥較溫和，沒有涉及動物藥和礦物藥，均由草藥組成。臨床上，五味姜黃膏對濕疹療效明確，為探討其作用特點，課題組觀察了五味姜黃膏對DNCB誘導(dǎo)小鼠濕疹模型的干預(yù)作用以及對家兔皮膚急性毒性作用。

1 實驗材料

1.1 動物

BALB/c 小鼠50只，雄性，SPF 級，體質(zhì)量19～22 g，由山東省濟(jì)南朋悅動物繁育有限公司提供，合格證號 SCXK(魯)2019—0003；實驗室許可證號SCXK(豫)2020—0004。實驗前先將動物適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d，小鼠自由飲水、進(jìn)食標(biāo)準(zhǔn)小鼠飼料。

新西蘭家兔16只，清潔級，雌雄各半，體質(zhì)量2.0～2.5 kg，購于濟(jì)南西嶺角養(yǎng)殖繁育中心，動物合格證號No.1108221911000286，動物中心許可證號SCXK(魯)20150001，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后開始實驗。飼養(yǎng)條件：溫度(26±2)℃，相對濕度(49±5)%，自由進(jìn)食飲水。

實驗動物倫理審查批準(zhǔn)編號：DWLL202104100。

1.2 藥物

五味姜黃膏由西藏藏醫(yī)藥大學(xué)藏醫(yī)藥與高原生物省部共建重點實驗室提供。

五味姜黃膏制備：取處方量姜黃、小檗、廣木香、止瀉木子、煙絮(吐吧)精確稱量，粉碎，將藥粉過80目篩，以藥粉與凡士林的質(zhì)量比分別為1∶2、1∶4、5∶4配置，凡士林置水浴上加熱至熔化，然后加入上述藥粉，攪拌均勻，放冷后分裝即可。產(chǎn)品批號：20210515A(藥物質(zhì)量濃度為0.4 g/mL)、20210515B(藥物質(zhì)量濃度為0.2 g/mL)、20210515C(藥物質(zhì)量濃度為1 g/mL,供家兔皮膚毒性實驗使用)。

1.3 試劑[3-4]

硫化鈉[西亞化學(xué)科技(山東)有限公司，批號 20200405]；2,4-二硝基氯苯(DNCB)(成都市聯(lián)合化工試劑研究所，批號 20200428)；丙酮(成都市聯(lián)合化工試劑研究所，批號 20190328)；橄欖油(貝蒂斯，批號 2021-01-08/L37)；凡士林(成都金山化學(xué)試劑有限公司，批號 20201012)；丁酸氫化可的松乳膏(尤卓爾)(天津金耀藥業(yè)有限公司，批號 202011061)；多聚甲醛(成都市科隆化學(xué)品有限公司，批號 20200616)。

1.4 儀器

高速離心機(jī)(上海精學(xué)科學(xué)儀器有限公司，JK-IRC-3H16R1)；半自動洗板機(jī)(長春賽諾邁德醫(yī)學(xué)技術(shù)有限責(zé)任公司，SAR-520B)；酶標(biāo)儀(賽默飛世爾，Multiskan GO)；電子天平[上海民橋精密儀器有限公司，F(xiàn)A(N)124A]；三頻數(shù)控超聲清洗器(昆山市超聲儀器有限公司，KQ-700VDB)；電動推剪(飛科，F(xiàn)S5806)；數(shù)字測微計[基恩士(中國)有限公司，LS-7000]。

2 實驗方法

2.1 五味姜黃膏對DNCB誘導(dǎo)小鼠濕疹模型的干預(yù)

2.1.1 致敏及激發(fā)溶液的制備

精密稱取DNCB 1.4 g，用丙酮橄欖油(4∶1)20 mL 溶解，制成 7% DNCB，作為致敏溶液。精密稱取 0.05 g DNCB，用丙酮橄欖油(4∶1)10 mL 溶解，制得0.5% DNCB， 作為激發(fā)溶液。

2.1.2 DNCB 致敏小鼠模型制備[5-6]

實驗前1天，用電動推剪于小鼠背部脫毛約2 cm×2 cm，選取皮膚無破損的小鼠進(jìn)行實驗。將實驗用雄性小鼠 50 只，隨機(jī)選取10只作為空白組，其余40只制備小鼠濕疹模型。

造模：將40只擬制備濕疹模型小鼠脫毛24 h后，用7%高濃度DNCB丙酮橄欖油溶液(體積比為4∶1)100 μL致敏小鼠背部1次，48 h后用50 μL上述溶液加強(qiáng)致敏1次，第5天在小鼠右耳內(nèi)外側(cè)用0.5%低濃度DNCB丙酮橄欖油溶液20 μL激發(fā)1次；空白組小鼠背部、右耳涂抹等量的丙酮橄欖油溶液。

模型判斷：第5天完成第1次低濃度DNCB激發(fā)12 h后，肉眼觀察各組小鼠背部皮損和右耳皮膚變化情況，造模小鼠背部皮膚出現(xiàn)紅斑、水腫及滲出液等急性皮炎現(xiàn)象，小鼠右耳出現(xiàn)紅腫；而空白組小鼠背部及右耳皮膚光滑、不紅腫。造模成功。

2.1.3 給藥

將造模成功的小鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為4組，每組10只。分別為模型組、丁酸氫化可的松乳膏組、五味姜黃膏高劑量組、五味姜黃膏低劑量組。第5、10、15、20、25、30天，在各組小鼠右耳內(nèi)外側(cè)用0.5%低濃度DNCB丙酮橄欖油溶液20 μL各激發(fā)1次，每次完成激發(fā)24 h、48 h、72 h，模型組不給藥，其余3個治療組分別涂藥于小鼠背部及右耳。五味姜黃膏高劑量組0.6 g(0.4 g/mL、給藥期間定時定量，每隔1 h涂藥1次，每次0.1 g)、五味姜黃膏低劑量組0.3 g(0.2 g/mL)、0.1%丁酸氫化可的松乳膏組0.3 g。

2.1.4 采血及指標(biāo)檢測[7-8]

實驗的第15天、第30天，模型組及各治療組小鼠按照以下標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行皮損程度計分：0～1分，無紅斑、水腫；2 ～3分，紅斑、水腫均不明顯，輕度水泡滲出液；3～4分， 紅斑、水腫較輕，有中度滲出液或角化；4～5分，紅斑、水腫明顯，滲出液多；5～6分，潰爛，角化結(jié)痂。每組小鼠評分取平均值。

末次激發(fā)5 h后，采用單盲法電子數(shù)顯游標(biāo)卡尺分別測量每組小鼠左右耳中部厚度，并平行測量3次，計算耳腫脹厚度(耳腫脹厚度=右耳厚度-左耳厚度) 。小鼠眼眶取血，分離血清，按照ELISA試劑盒說明書測定血清中IL-6、TNF-α水平。取血后處死，立即取脾臟，稱量，計算脾臟指數(shù)，脾臟指數(shù)=脾的質(zhì)量(mg)/體質(zhì)量(g)。

2.2 五味姜黃膏對家兔皮膚急性毒性作用評價方法[9-12]

取新西蘭家兔16只，雌雄各半，體質(zhì)量2.0～2.5 kg，將家兔按體質(zhì)量由低到高編號，按隨機(jī)數(shù)字表法分為4組，即完整皮膚給藥組、完整皮膚對照組、破損皮膚給藥組和破損皮膚對照組，每組4只。于給藥前24 h，實驗兔背部脫毛，脫毛面積約150 cm2。將需要被破損皮膚的兩組家兔進(jìn)行破損皮膚造模，實驗兔背部脫毛區(qū)用75%乙醇消毒，然后用無菌針頭在脫毛區(qū)劃“井”字，以滲血無明顯出血為度。脫毛、造模24 h后，在完整皮膚給藥組和破損皮膚給藥組(各4只)家兔背部脫毛區(qū)均勻涂抹藏藥五味姜黃膏(1 g/mL)20 g，完整皮膚對照組和破損皮膚對照組(各4只)家兔背部脫毛區(qū)均勻涂抹等體積溶媒(甘油、羊毛脂與水的混合物)。 以雙層紗布和聚乙烯薄膜覆蓋,用無刺激性膠布加以固定。敷藥24 h后，用溫水洗凈家兔背部脫毛區(qū)殘余藥物。立即觀察，并連續(xù)觀察14 d，每日觀察2次。觀察指標(biāo)：家兔皮膚、毛發(fā)、飲食、二便、呼吸、眼和黏膜的變化、精神狀態(tài)、四肢活動及死亡情況、局部皮膚變化。評價指標(biāo)：完整皮膚2組和破損皮膚2組家兔分別于給藥前、給藥第7天、給藥第14天進(jìn)行稱量，以體質(zhì)量變化值為指標(biāo)，進(jìn)行藥物急性毒性評價。實驗結(jié)束，取用藥部位皮膚，福爾馬林固定，切片，病理觀察。

2.3 統(tǒng)計學(xué)處理

3 結(jié)果

3.1 五味姜黃膏對DNCB誘導(dǎo)小鼠濕疹模型的干預(yù)作用

3.1.1 表觀指征

對各組小鼠背部皮膚采用盲法計分，五味姜黃膏高、低劑量對小鼠背部皮損組織有良好的愈合作用。給藥第15天、給藥第30天，小鼠背部皮損情況：丁酸氫化可的松乳膏組明顯好轉(zhuǎn)，五味姜黃膏高劑量組、低劑量組均較模型組有明顯好轉(zhuǎn)，見圖1、圖2。

A 空白組；B 模型組；C 丁酸氫化可的松乳膏組；D 五味姜黃膏高劑量組；E 五味姜黃膏低劑量組圖1 五味姜黃膏給藥第15天小鼠背部皮膚損傷病變情況

A 空白組；B 模型組；C 丁酸氫化可的松乳膏組；D 五味姜黃膏高劑量組；E 五味姜黃膏低劑量組圖2 五味姜黃膏給藥第30天小鼠背部皮膚損傷病變情況

3.1.2 五味姜黃膏對濕疹模型小鼠皮損積分、耳腫脹厚度的影響

與模型組比較，五味姜黃膏高、低劑量和丁酸氫化可的松乳膏均可降低第15、30 天皮損積分(P<0.01)，可降低小鼠耳腫脹厚度(P<0.01)，各治療組與模型組比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義。但是，各治療組間比較，耳腫脹厚度和第15天皮損積分：丁酸氫化可的松乳膏組<五味姜黃膏高劑量組<五味姜黃膏低劑量組，說明丁酸氫化可的松乳膏治療效果最好，五味姜黃膏高劑量治療效果次之，五味姜黃膏低劑量治療效果略差；各治療組之間比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義。但隨著實驗時間的延長，五味姜黃膏低劑量治療效果超過高劑量，接近于丁酸氫化可的松乳膏的治療效果，由此，可將低劑量組的劑量作為五味姜黃膏治療劑量的參考值。實驗結(jié)果見表1。

表1 五味姜黃膏對濕疹模型小鼠皮損積分、耳腫脹厚度的影響

3.1.3 對濕疹模型小鼠脾臟指數(shù)的影響

與空白組比較，模型組小鼠脾臟指數(shù)升高明顯，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，由此說明小鼠濕疹模型造模是成功的；與模型組比較，五味姜黃膏高、低劑量和丁酸氫化可的松乳膏均可降低小鼠脾臟指數(shù)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。各治療組間比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義，見表2。

表2 五味姜黃膏對濕疹模型小鼠脾臟指數(shù)的影響 mg·g-1

3.1.4 對濕疹小鼠血清 IL-6、TNF-α水平的影響

與空白組比較，模型組小鼠血清 IL-6、TNF-α 水平明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；與模型組比較，五味姜黃膏高、低劑量和丁酸氫化可的松乳膏均可降低小鼠血清 TNF-α水平，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；與模型組比較，五味姜黃膏高、低劑量可降低小鼠血清 IL-6，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義，丁酸氫化可的松乳膏可降低小鼠血清IL-6 水平，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。各治療組間比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義，見表3。

表3 五味姜黃膏對濕疹模型小鼠血清 IL-6、TNF-α水平的影響 pg·mL-1

3.2 五味姜黃膏對家兔皮膚急性毒性作用評價

3.2.1 對家兔完整皮膚的急性毒性

家兔完整皮膚給藥部位與對照組相應(yīng)部位皮膚狀況差異無統(tǒng)計學(xué)意義，家兔脫毛部位皮膚均正常。給藥組、對照組家兔毛發(fā)、飲食、二便、呼吸、眼和黏膜、精神狀態(tài)、四肢活動等也未見異常。在觀察的14 d內(nèi)，動物正常，無死亡。局部組織病理觀測可見，正常皮膚用藥后與對照組一致，表皮與真皮層無明顯病變，均為正常。給藥前，給藥第7、14天，完整皮膚給藥組與對照組家兔體質(zhì)量相比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；隨著時間延長，兩組家兔體質(zhì)量均見增加，家兔生長正常，在時間影響方面差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。兩組家兔體質(zhì)量變化見表4。

表4 五味姜黃膏對完整皮膚家兔體質(zhì)量的影響 kg

3.2.2 對家兔破損皮膚的急性毒性

家兔破損皮膚給藥組在洗去殘余藥物后觀察，可見局部有輕度發(fā)紅、輕度水腫，第2天用藥部位皮膚基本恢復(fù)正常。對照組洗去甘油、羊毛脂與水的混合物后觀察，“井”字無滲血，局部皮膚正常。給藥組、對照組家兔毛發(fā)、飲食、二便、呼吸、眼和黏膜、精神狀態(tài)、四肢活動等也未見異常。在觀察的14 d內(nèi)，動物正常，無死亡。從局部組織病理觀測可見，破損皮膚給藥組與對照組基底細(xì)胞均可見少量空泡，棘層細(xì)胞可見稍許松解情況，其他未見明顯異常。給藥前，給藥第7、14天，破損皮膚給藥組與對照組家兔體質(zhì)量相比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；隨著時間延長，兩組家兔體質(zhì)量均有增加，在時間影響方面差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。兩組家兔體質(zhì)量變化見表5。

表5 五味姜黃膏對破損皮膚家兔體質(zhì)量的影響 kg

4 討論

五味姜黃膏最早出現(xiàn)于《醫(yī)學(xué)四續(xù)》第三部《秘訣續(xù)》第六十一章皮膚病治法中，該治法認(rèn)為：姜黃、小檗、廣木香、止瀉木子、煙絮一起熬膏，能醫(yī)治黃水瘡、白癜風(fēng)、疥癬以及一切皮膚病?！夺t(yī)學(xué)四續(xù)》第四部《后續(xù)續(xù)》搽涂療法章節(jié)中記載：“吐吧(煙絮)，姜黃，小檗，廣木香，止瀉木子，酪漿配伍，主治黃水瘡、皮膚病”。

為了推動藏藥現(xiàn)代化和適應(yīng)目前方便用藥的形勢，課題組總結(jié)了五味姜黃膏的藥物組成和藥理作用。姜黃中含有多種天然多酚黃色素，具有較強(qiáng)的抗氧化、抗感染作用；小檗主要成分小檗堿，具有抗感染、抗氧化作用；止瀉木子是藏醫(yī)常用的藏藥莪杜模牛，在每年9月份采集果實，剝開取出種子,陰干使用，其藥性味苦、辛，性寒，具有清熱涼血的功能，主治肺熱咳嗽、咽喉腫痛、熱性腹瀉等；廣木香藏醫(yī)叫如達(dá)，藥用菊科植物廣木香的根部，秋季挖根，洗去泥土及雜質(zhì)，切塊晾干使用，其藥性味辛、苦，化味苦，性潤而濕，具有溫胃、行氣、止痛、破痞結(jié)、生肌等功能，主治胃脹痛、“隆病”、血病、白喉、肺病、“培根”聚滯、熱瀉、瘡口不斂等；煙絮藏醫(yī)叫吐吧，《晶珠本草》記載吐吧能醫(yī)治皮膚病。

本研究對 DNCB 誘導(dǎo)小鼠濕疹模型進(jìn)行干預(yù)，驗證五味姜黃膏的治療作用。方中主藥姜黃，其姜黃素有用于治療炎癥和感染性皮膚病的研究，并有證據(jù)表明姜黃素可能代表了治療幾種皮膚狀況的有效藥物[13]。由于這些特性，姜黃素已被用作預(yù)防和治療皮膚老化和炎癥疾病，如銀屑病、感染、痤瘡、皮膚炎癥和皮膚癌。姜黃素對紫外線 B 輻射引起的慢性皮膚損傷有保護(hù)作用[14]。王莉等[15]整理總結(jié)了姜黃素在治療皮膚病方面發(fā)揮的多種作用，例如抗氧化作用、抗感染作用、抗纖維化作用和抗病毒作用。臣藥小檗所含的小檗堿具有抗感染作用，其抗感染機(jī)制是抑制了 TLR-4 介導(dǎo)的 NF-κB 及絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase, MAPK)信號通路，進(jìn)而抑制了LPS 誘導(dǎo)的炎癥細(xì)胞因子的表達(dá)[16]。王佳等[17]通過體外干預(yù)神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞系 U251細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)小檗堿可能作為細(xì)胞內(nèi)TLR-4 和(或)MAPK 信號通路的拮抗劑，通過誘導(dǎo)關(guān)鍵靶標(biāo)分子 NR4A1表達(dá)發(fā)揮其抗感染保護(hù)作用。廣木香煎劑對許蘭黃蘚菌及其蒙古變種等10種真菌有抑制作用。止瀉木子有清熱解毒作用。煙絮能夠收斂潰爛皮膚。通過五味姜黃膏與丁酸氫化可的松乳膏對DNCB 誘導(dǎo)小鼠濕疹模型干預(yù)作用的對照研究，明確了五味姜黃膏在表觀指征、皮損積分、耳腫脹厚度、脾臟指數(shù)、血清 TNF-α水平等方面具有顯著性效果，發(fā)現(xiàn)其療效僅次于丁酸氫化可的松乳膏。雖然由于本實驗的局限性，對本方針對濕疹治療的具體分子機(jī)制尚不明確，但仍可證實藏醫(yī)古籍中五味姜黃膏對皮膚病中朗秀病(濕疹)的治療作用，為之后藏藥五味姜黃膏治療各種皮膚病的研究打下了扎實的基礎(chǔ)。