免疫檢查點抑制劑的研究進展

張文欣，郭弘潔，潘孝匯，陳羲，陶泉偉，吳洪海，丁玲

（1. 浙江大學(xué)藥學(xué)院，浙江 杭州310058；2. 杭州先導(dǎo)醫(yī)藥科技有限責(zé)任公司，浙江 杭州 311121）

機體免疫系統(tǒng)具有免疫監(jiān)視作用，當體內(nèi)出現(xiàn)惡變細胞時，免疫系統(tǒng)能識別并通過細胞免疫機制特異性清除“非己”細胞，以維持機體內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)態(tài)。然而，腫瘤細胞通過招募免疫抑制性細胞、下調(diào)腫瘤抗原表達、誘導(dǎo)T細胞凋亡或功能耗竭，并產(chǎn)生誘導(dǎo)抑制性免疫檢查點表達的免疫抑制分子，從而形成高度免疫抑制的腫瘤微環(huán)境（tumor microenvironment，TME）以逃避免疫監(jiān)視[1]。研究表明，程序性死亡受體1（programmed death-1，PD-1）及程序性死亡受體配體1（programmed death-ligand 1，PD-L1）在介導(dǎo)腫瘤免疫逃逸中發(fā)揮關(guān)鍵作用[2]。腫瘤細胞通過高表達PD-L1，以抑制腫瘤特異T細胞的活化、增殖和細胞因子的產(chǎn)生，介導(dǎo)腫瘤免疫逃逸。此外，細胞毒性T淋巴細胞相關(guān)抗原4（cytotoxic T lymphocyte-associated antigen-4，CTLA-4）通過反式內(nèi)吞作用可減少抗原呈遞細胞（antigen-presenting cell，APC）表面分 化 簇80（cluster of differentiation 80，CD80）/CD86水平，從而抑制T細胞激活[3]。淋巴細胞激活基因3（lymphocyte activation gene-3，LAG-3）競爭結(jié)合主要組織相容性復(fù)合體Ⅱ類分子（major histocompatibility complex II，MHCⅡ）抑制T細胞活化，介導(dǎo)免疫逃逸[4]。

針對免疫檢查點在介導(dǎo)腫瘤免疫逃逸中的重要作用，開發(fā)抑制免疫檢查點活性的藥物是有效的抗腫瘤策略，這類藥物統(tǒng)稱為免疫檢查點抑制劑（immune checkpoint inhibitors，ICIs）。CTLA-4抗體伊匹單抗（ipilimumab）在2011年被美國食品藥品監(jiān)督管理局（Food and Drug Administration，F(xiàn)DA）批準用于黑色素瘤治療。隨后，PD-1/PD-L1抗體在多項臨床試驗中展現(xiàn)出顯著的抗腫瘤作用，被批準用于包括黑色素瘤、非小細胞肺癌和腎細胞癌在內(nèi)的多種惡性腫瘤[5]。ICIs在多種惡性腫瘤中顯著的療效，使免疫治療成為除手術(shù)、放化療和靶向治療外極具潛力的腫瘤新療法，在《科學(xué)》雜志2013年十大科學(xué)突破中居首位。LAG-3是繼CTLA-4和PD-1/PD-L1后研究最成熟的免疫檢查點，已有LAG-3抗體獲批應(yīng)用于臨床抗腫瘤治療[6]。目前，其他ICIs，包括T細胞免疫球蛋白黏蛋白3（T cell immunoglobulin and mucin domain-containing protein 3，TIM-3）、CD47、T細 胞 免 疫 球 蛋 白和ITIM結(jié)構(gòu)域（T cell immunoglobulin and ITIM domain protein，TIGIT）和T細胞活化的V結(jié)構(gòu)域免疫球蛋白抑制因子（V-domain Ig suppressor of T-cell activation，VISTA）也正在廣泛地進行研究開發(fā)和臨床試驗。

1 細胞毒性T淋巴細胞相關(guān)抗原4抑制劑

CTLA-4廣泛表達于活化的T細胞。T細胞表面受體CD28與APC上CD80/CD86的結(jié)合可產(chǎn)生共刺激信號，與抗原特異性T細胞受體（T cell receptor，TCR）識別MHC產(chǎn)生的第一信號共同組成T細胞活化的雙重信號。而CTLA-4與CD28的胞外域高度同源，且與CD28相比，CTLA-4與CD80/CD86具有更高的親和力，這種高親和力使得CTLA-4可以拮抗CD28與配體的相互作用，從而減少共刺激信號的產(chǎn)生進而抑制T細胞活化[7]。此外，CTLA-4也表達于調(diào)節(jié)性T淋巴細胞（regulatory T cells，Tregs），Tregs上的CTLA-4通過反式內(nèi)吞作用促進APC上CD80/CD86內(nèi)化，減少其表達水平，進一步發(fā)揮免疫抑制功能[3,8]。因此，靶向阻斷CTLA-4將解除T細胞的免疫抑制并允許T細胞活化，進而實現(xiàn)腫瘤殺傷作用（見圖1）。

圖1 細胞毒性T淋巴細胞相關(guān)抗原4及抑制劑作用模式圖Figure 1 Mode of action of cytotoxic T lymphocyte-associated antigen-4 and its inhibitors

Ipilimumab是唯一上市的CTLA-4單抗，于2011年被FDA批準用于晚期黑色素瘤的治療。至今，其適應(yīng)證已包含腎細胞癌、非小細胞肺癌以及結(jié)直腸癌等實體瘤，約10% ～ 20%的腫瘤患者可以從ipilimumab的治療中獲益[9]（見表1）。此外，阿斯利康的曲美木單抗（tremelimumab）與信達生物的IBI-310已處于Ⅲ期臨床研究。其中，一項tremelimumab的Ⅲ期臨床研究（臨床試驗編號：NCT03298451）結(jié)果顯示，tremelimumab聯(lián)合德瓦魯單抗（durvalumab）表現(xiàn)出總生存期（overall survival，OS）的顯著改善?；谶@項研究，tremelimumab獲得了FDA的優(yōu)先審查權(quán)，將有望成為第2個上市的CTLA-4單抗[10]。除上述藥物外，已有大量CTLA-4抗體藥物進入臨床及臨床前研究階段，主要圍繞單抗的療效以及安全性兩方面展開[11]。

早期觀點認為，ipilimumab通過介導(dǎo)空間位阻阻斷CTLA-4與CD80/CD86結(jié)合，從而促進T細胞活化，進而發(fā)揮抗腫瘤作用[12]。然而，近期的研究發(fā)現(xiàn)，抗體依賴細胞介導(dǎo)的細胞毒作用（antibodydependent cell-mediated cytotoxicity，ADCC）或 許是ipilimumab發(fā)揮抗腫瘤作用的主要機制。研究認為，由Fc段引起的ADCC可靶向清除高表達CTLA-4的Tregs，從而解除Tregs帶來的免疫抑制[13]。因此，增強Fc介導(dǎo)的ADCC效應(yīng)已成為CTLA-4單抗研發(fā)的重要方向。百時美施貴寶研發(fā)的新一代CTLA-4單抗BMS-986249對ipilimumab的Fc段進行了非巖藻糖基化改造，以期通過增強ADCC效應(yīng)以達到對Tregs的有效清除，目前該藥正處于Ⅰ/Ⅱ期臨床研究階段。

CTLA-4單抗治療所引起的免疫相關(guān)不良事件（immune-related adverse events，irAEs）是 限 制ipilimumab臨床應(yīng)用的重要原因。常見的不良反應(yīng)包括腹瀉、結(jié)腸炎、皮疹以及轉(zhuǎn)氨酶升高等，嚴重的可導(dǎo)致患者死亡[14]。其中，ipilimumab的3級或4級不良反應(yīng)的發(fā)生率在10% ～ 15%。由于CTLA-4主要表達于Tregs以及活化的T細胞，其配體則主要表達于APC表面，而在多數(shù)腫瘤細胞表面無表達或低表達，靶向CTLA-4常引起免疫系統(tǒng)中廣泛的T細胞活化，由此引發(fā)irAEs[15]?；诖?，新一代CTLA-4單抗BMS-986249通過與屏蔽肽的偶聯(lián)提高其對腫瘤組織的選擇性，從而減少irAEs的發(fā)生。此外，研究發(fā)現(xiàn)，ipilimumab引起的CTLA-4溶酶體途徑降解也是導(dǎo)致irAEs發(fā)生的重要原因，CTLA-4的大量降解會導(dǎo)致機體免疫耐受的破壞。因此，減弱單抗藥物對CTLA-4的溶酶體降解作用或許是減少irAEs的一個新策略[16]。此外，與其他ICIs聯(lián)用也得到了廣泛研究[17-18]。由于CTLA-4單抗作用于抗腫瘤免疫的早期階段且具有長效性的特點，與作用于T細胞效應(yīng)階段的PD-1/PD-L1單抗聯(lián)用可顯著改善響應(yīng)率并提高抗腫瘤療效。

2 程序性死亡受體1/程序性死亡受體配體1抑制劑

PD-1是一種負性共刺激分子，表達于活化的T細胞、自然殺傷細胞（natural killer，NK）和單核細胞表面。PD-L1作為PD-1的配體，與T細胞表面的PD-1結(jié)合后，促使PD-1的免疫受體酪氨酸轉(zhuǎn)換基序中的酪氨酸發(fā)生磷酸化，隨后招募含Src同源2結(jié)構(gòu)域蛋白酪氨酸磷酸酶2（Srchomology region 2-containing protein tyrosine phosphatase 2，SHP-2）引起下游蛋白激酶脾酪氨酸激酶（spleen tyrosine kinase，Syk）和磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K）去磷酸化，抑制下游蛋白激酶B（protein kinase B，PKB,又稱AKT）和細胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶（extracellular regulated protein kinase，ERK）等信號傳導(dǎo)，最終抑制T細胞活化所需基因及細胞因子的轉(zhuǎn)錄，發(fā)揮負向調(diào)控T細胞活性的作用[5]。高表達PD-L1的腫瘤細胞能與腫瘤特異T細胞的PD-1結(jié)合，抑制T細胞活化、增殖和細胞因子的產(chǎn)生，介導(dǎo)腫瘤免疫逃逸。因此，阻斷PD-1/PD-L1信號通路能恢復(fù)T細胞免疫殺傷功能，激活內(nèi)源性抗腫瘤免疫反應(yīng)，從而發(fā)揮抗腫瘤作用[19]。

2.1 程序性死亡受體1/程序性死亡受體配體1抗體藥物及臨床應(yīng)用

臨床應(yīng)用的PD-1/PD-L1單抗通過阻斷PD-1與PD-L1蛋白的結(jié)合，重新激活T細胞對腫瘤的免疫應(yīng)答，達到抗腫瘤的效果。自2012年P(guān)D-1單抗在Ⅰ/Ⅱ期臨床試驗中表現(xiàn)出良好安全性和抗腫瘤療效，多項針對黑色素瘤、非小細胞肺癌和腎細胞癌等惡性腫瘤的Ⅲ期臨床試驗相繼開展。針對晚期黑色素瘤的Ⅲ期臨床試驗CheckMate-066[20]中，納武單抗（nivolumab）治療組1年生存率顯著高于達卡巴嗪組（73%vs42%）。此外，2項nivolumab治療非小細胞肺癌的Ⅲ期臨床試驗（CheckMate-057，CheckMate-017）顯示，nivolumab治療與多西他賽相比具有顯著的臨床受益。PD-1/PD-L1抗體藥物具有廣泛的抗癌譜，并且在部分腫瘤患者中表現(xiàn)出持久而強大的療效。截至目前，已有10種PD-1單抗和3種PD-L1單抗被批準用于非小細胞肺癌、黑色素瘤、頭頸癌、結(jié)直腸癌和胃癌等11個癌種的治療[5]（見表1）。

表1 免疫檢查點抑制劑獲批藥物匯總表Table 1 List of approved immune checkpoint inhibitors

雖然PD-1/PD-L1抗體在多類惡性腫瘤中具有顯著的抗腫瘤活性，然而其在大部分腫瘤中應(yīng)答率較低。PD-1抗體單藥僅在霍奇金淋巴瘤、增生性黑素色瘤以及錯配修復(fù)缺陷（mismatch repair deficiency，dMMR）和微衛(wèi)星高度不穩(wěn)定（microsatellite instability-high，MSI-H）的腫瘤中具有高于50%的應(yīng)答率，而在大部分實體瘤中應(yīng)答率僅為15% ～ 25%[21]。開發(fā)PD-1/PD-L1抗體聯(lián)合策略，是提高PD-1/PD-L1單抗治療應(yīng)答率的策略之一，一方面可聯(lián)合抑制導(dǎo)致PD-1/PD-L1抗體耐藥的因素，如抑制其他免疫檢查點、異常血管生成、免疫抑制性細胞或細胞因子等；另一方面能誘導(dǎo)免疫原性癌細胞死亡和增加免疫細胞浸潤。當前，聯(lián)合PD-1/PD-L1療法與其他抗腫瘤藥物的臨床試驗正在廣泛進行中，包含其他免疫療法[其他ICIs、溶瘤病毒、干擾素基因刺激因子（stimulator of interferon gene，STING）激動劑以及嵌合抗原受體T細胞（chimeric antigen receptor T-Cell，CAR-T）治療等]、放射治療、化學(xué)療法和分子靶向治療等[22]。然而，目前FDA批準的PD-1/PD-L1聯(lián)合策略僅限于與化學(xué)療法、血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）靶向藥物以及CLTA-4單抗合用。ICIs與化療聯(lián)用在非小細胞肺癌、小細胞肺癌和三陰性乳腺癌中已獲得成功[23]。PD-L1單抗聯(lián)合VEGF靶向抑制劑被批準用于晚期腎細胞癌的治療[24]。此外，PD-1/PD-L1和CTLA-4抑制劑的聯(lián)合治療可增加黑色素瘤、腎細胞癌、非小細胞肺癌和MSI-H結(jié)直腸癌的持久緩解，已被應(yīng)用于臨床治療中。

此外，尋找有效預(yù)測PD-1/PD-L1單抗療效的生物標志物對于篩選應(yīng)答患者至關(guān)重要[25]。大量臨床研究證實，腫瘤細胞和（或）腫瘤相關(guān)免疫細胞的PD-L1表達水平與免疫治療療效和預(yù)后密切相關(guān)。免疫組織化學(xué)檢測PD-L1表達已被批準作為非小細胞肺癌、黑色素瘤和尿路上皮癌等多類腫瘤的生物標志物。此外，臨床研究顯示腫瘤突變負荷（tumor mutation burden，TMB）可用于評估ICIs的療效，高TMB者接受PD-1/PD-L1抗體治療有效率更高。存在dMMR或MSI-H的惡性腫瘤被證實具有更好的PD-1/PD-L1抗體療效，是結(jié)直腸癌免疫治療的生物標志物。此外，腫瘤浸潤淋巴細胞（tumor infiltrating lymphocyte，TIL），TIL衍生的干擾素-γ（interferon-γ，IFN-γ）、腸道菌群、致癌驅(qū)動突變和外周血指標（外周免疫細胞、循環(huán)腫瘤細胞和可溶性PD-L1）均表明與PD-1/PD-L1抗體療效相關(guān)，被認為是有效的候選生物標志物[25]。然而，單一生物標志物用以預(yù)測PD-1/PD-L1抗體療效仍存在顯著的局限性，整合多組學(xué)層面生物標志物將為ICIs療效預(yù)測、動態(tài)監(jiān)測和預(yù)后評估創(chuàng)造新的機遇。

PD-1/PD-L1抗體在臨床治療中也存在irAEs[26]。3級或4級irAEs的發(fā)生率為20% ～ 32%。但其irAEs大多程度較輕，常見為腹瀉、皮膚瘙癢和急性腎損傷等。然而，部分患者在治療過程中會出現(xiàn)假性進展與超進展[27]等罕見事件，甚至出現(xiàn)致死性不良反應(yīng)，如免疫間質(zhì)性肺炎和嚴重的皮膚毒性等。目前irAEs的發(fā)生機制尚不明確，可能與體內(nèi)免疫細胞過度活躍、炎癥性細胞因子增多以及自身免疫抗體增多相關(guān)?？贵w藥物半衰期較長、組織滯留時間久且具有免疫系統(tǒng)刺激也是導(dǎo)致irAEs發(fā)生的重要原因。加強irAEs的臨床監(jiān)管是當前有效避免irAEs限制免疫治療開展的解決策略之一。此外，通過生物標志物準確篩選敏感人群以避免不必要的irAEs將是另一有效的策略。

2.2 程序性死亡受體1/程序性死亡受體配體1小分子抑制劑研究進展

PD-1/PD-L1抗體在多類惡性腫瘤中具有顯著的療效，但仍存在單抗藥物生產(chǎn)成本昂貴、口服生物利用度差、腫瘤滲透性差以及免疫原性等問題。與大分子抗體藥物相比，小分子藥物通常具有器官或腫瘤滲透性好、對免疫系統(tǒng)刺激小及可以口服等優(yōu)點。因此尋找靶向PD-1/PD-L1的小分子抑制劑被認為是克服抗體藥物缺陷的重要途徑[28]。

根據(jù)PD-1/PD-L1復(fù)合物的晶體結(jié)構(gòu)，開發(fā)直接阻斷PD-1與PD-L1蛋白結(jié)合的小分子化合物是研發(fā)PD-1/PD-L1小分子抑制劑的主要策略之一。隨著PD-1/PD-L1晶體結(jié)構(gòu)的解析，其相互作用模式以及關(guān)鍵位點被不斷揭露，為PD-1/PD-L1小分子抑制劑的發(fā)現(xiàn)提供了結(jié)構(gòu)生物學(xué)基礎(chǔ)（見圖2）?；诖耍酋０奉?、聯(lián)苯類、雜環(huán)類和 二唑類等阻斷PD-1/PD-L1結(jié)合的化合物被陸續(xù)研發(fā)，并進行廣泛的抗腫瘤臨床前與臨床研究[29]。AUNP-12作為首個PD-1/PD-L1通路的肽抑制劑，在臨床前研究中顯著抑制了小鼠黑色素瘤以及乳腺癌的生長，且沒有顯著毒性。此外，以聯(lián)苯為核心結(jié)構(gòu)開發(fā)的一系列PD-1/PD-L1小分子抑制劑（BMS-202，BMS-1001與BMS-1166等）通過促進并結(jié)合二聚化的PD-L1導(dǎo)致PD-1/PD-L1無法發(fā)生相互作用。CA-170是一款口服PD-1與VISTA的雙重小分子抑制劑。研究顯示，CA-170在非小細胞肺癌和霍奇金淋巴瘤中總體臨床受益率分別為70%和77.8%，且生物安全性明顯優(yōu)于抗體藥物[30]。另一種PD-L1小分子抑制劑INCB086550的Ⅰ期臨床試驗結(jié)果顯示，INCB086550治療組患者的客觀緩解率（objective response rate，ORR）為11.8%，疾病控制率（disease control rate，DCR）為19.1%。此外，其他的PD-1/PD-L1小分子抑制劑，如GS-4224，ASC61，MAX-10181和IMMH-010正在臨床試驗中。

圖2 程序性死亡受體1/程序性死亡受體配體1及抑制劑作用模式圖Figure 2 Mode of action for PD-1/PD-L1 and their inhibitors

PD-1/PD-L1小分子抑制劑開發(fā)的另一策略是基于PD-L1的表達調(diào)控機制，采用小分子化合物對關(guān)鍵環(huán)節(jié)進行干預(yù)，從而抑制其表達或促進其降解[31]。目前已報道的小分子抑制劑主要干預(yù)了以下幾個環(huán)節(jié)：1）表觀遺傳調(diào)控，組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑、zeste基因增強子同源物2（enhancer of zeste homolog 2，EZH2）的藥理學(xué)抑制劑與組蛋白去乙?；福╤istone deacetylase，HDAC）抑制劑等被報道通過改變CD274啟動子區(qū)甲基化或乙酰化水平從而調(diào)控PD-L1的水平，并在多種小鼠模型中增強了PD-1/PD-L1抗體的療效。目前，多類表觀遺傳藥物與ICIs的組合正在開展臨床研究[32]。2）轉(zhuǎn)錄調(diào)控，表皮生長因子受體（epithelial growth factor receptor，EGFR）、PI3K-AKT、絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）、Janus激酶-信號轉(zhuǎn)導(dǎo)子和轉(zhuǎn)錄激活子（Janus kinasesignal transducer and activator of transcription，JAKSTAT）信號通路以及細胞性骨髓細胞瘤病毒癌基因（cellular-myelocytomatosis viral oncogene，c-Myc）與溴結(jié)構(gòu)域蛋白4（bromodomain-containing protein 4，BRD4）等轉(zhuǎn)錄因子是調(diào)控CD274活性的關(guān)鍵因子[19]。因此，基于上述信號通路或轉(zhuǎn)錄因子的抑制劑均報道可調(diào)控多類腫瘤細胞中PD-L1的表達，并在動物模型中增強單抗的療效。3）轉(zhuǎn)錄后調(diào)控，MAPK通路抑制劑和人類抗原R（human antigen R，HuR）抑制劑被報道通過不同的富含AU元件（AU-rich element，ARE）結(jié)合蛋白干預(yù)PDL1 mRNA的穩(wěn)定性。此外，tomivosertib通過抑制真核起始因子4E（eukaryotic initiation factor 4E，eIF4E）磷酸化從而抑制PD-L1翻譯[33]。在Ⅱ期臨床試驗中，聯(lián)合tomivosertib治療使41%的非小細胞肺癌患者在24周內(nèi)無疾病進展。4）翻譯后修飾調(diào)控，N-糖基化被報道對于PD-L1蛋白的穩(wěn)定性至關(guān)重要。KYA1797K或依托泊苷靶向β-聯(lián)蛋白可抑制寡糖基轉(zhuǎn)移酶活性亞基STT3表達，從而降低結(jié)腸癌和三陰性乳腺癌小鼠模型中PD-L1N-糖基化和表達[34]。此外，二甲雙胍和A-769662激活腺苷酸活化蛋白激酶[adenosine 5'-monophosphate（AMP）-activated protein kinase，AMPK]使PD-L1發(fā)生磷酸化降解，并增強CTLA-4單抗的抗腫瘤療效。E3泛素連接酶斑點型鋅指結(jié)構(gòu)蛋白（speckle-type POZ protein，SPOP），β-轉(zhuǎn)導(dǎo)重復(fù)相容蛋白（β-transducin repeat-containing protein，β-TrCP）以及去泛素化酶COP9信號復(fù)合體（COP9 signalosome，CSN）第5亞基參與PD-L1的泛素化降解[35]?；诖?，周期蛋白依賴性激酶4/6（cyclin-dependent kinases 4/6，CDK4/6）抑制劑以及姜黃素等誘導(dǎo)PD-L1泛素化降解，并在小鼠模型中增敏ICIs治療。

雖然PD-1/PD-L1小分子抑制劑具有巨大的抗腫瘤潛力，但目前尚無小分子抑制劑被批準用于臨床治療。由于PD-1/PD-L1相互作用界面較大且小分子結(jié)合口袋小，小分子抑制劑結(jié)合位點的發(fā)現(xiàn)以及結(jié)合能力的評估面臨挑戰(zhàn)，研發(fā)PD-1/PD-L1小分子抑制劑因成藥性和毒性問題仍進展緩慢。此外，不同腫瘤存在PD-L1表達和調(diào)控機制的異質(zhì)性，針對PD-L1表達調(diào)控的小分子抑制劑的研究仍處于早期階段，需要更多的臨床研究進一步明確其作用。

3 淋巴細胞激活基因3抑制劑

LAG-3是繼CTLA-4和PD-1/PD-L1后，又一重要的免疫檢查點。LAG-3表達于各種淋巴細胞表面，其與CD4結(jié)構(gòu)相似，且與MHCⅡ的親和能力更強[36]，能與肽-MHCⅡ復(fù)合物穩(wěn)定結(jié)合，抑制T細胞活化[4]。此外，纖維蛋白原樣蛋白1（fibrinogen-like protein 1，F(xiàn)GL1）也 被 發(fā) 現(xiàn) 是LAG-3的配體。LAG-3的阻斷或缺失可增強小鼠的抗腫瘤免疫。研究發(fā)現(xiàn)，在接受PD-1單抗治療的荷瘤小鼠中，其TIL表面LAG-3存在代償性上調(diào)，聯(lián)合使用PD-1與LAG-3抗體具有協(xié)同的抗腫瘤作用[37]。此外，阻斷FGL1-LAG-3相互作用也可以增強腫瘤免疫，抑制荷瘤小鼠的腫瘤生長[38]。

目前，靶向LAG-3的療法主要有2種形式：1）輸送可溶性二聚體LAG-3作為輔助治療；2）使用抗體阻斷LAG-3與其配體的相互作用，并與PD-1阻斷治療相結(jié)合。可溶性二聚體LAG-3將其的4個胞外Ig結(jié)構(gòu)域與人IgG1的Fc部分融合，其能與APC上MHCⅡ結(jié)合，促進CD8+T細胞活化[39]。在Ⅰ期臨床研究中，IMP321（可溶性LAG-3蛋白）與流感疫苗共同注射具有較好的安全性，并提高了疫苗免疫原性，進一步激活了T細胞[40]。IMP321與其他抗腫瘤療法聯(lián)合用于實體瘤已開展了一系列臨床研究，顯示可增強免疫反應(yīng)和抗腫瘤活性[41]。此外，LAG-3抗體還可以抑制Tregs的免疫抑制活性。Relatlimab是首個臨床開發(fā)的LAG-3單抗。在Ⅱ期臨床試驗中，單獨使用relatlimab的抗腫瘤效果有限，而將其與多種ICIs聯(lián)用可以提高抗腫瘤療效。Relatlimab與nivolumab聯(lián)合用于黑色素瘤治療能延長患者的無進展生存期（progression-free survival，PFS），是nivolumab單藥組的2倍（10.1個月vs4.6個月）[6]。FDA已批準nivolumab和relatlimab聯(lián)合用于治療患有不可切除或轉(zhuǎn)移性黑色素瘤的成人和兒童患者。另一個LAG-3單抗LAG525與spartalizumab（PD-1單抗）聯(lián)合的Ⅰ/Ⅱ期臨床試驗結(jié)果表明，聯(lián)用組患者具有良好的耐受性，并且相對于PD-1單抗組，聯(lián)用組具有更高比例的6個月或更長時間的疾病穩(wěn)定期（6.6%vs4.5%）[42]。目前還有多種LAG-3抗體處于臨床試驗階段，如GSK2831781，HLX26和Sym022。

盡管LAG-3抗體單一療法安全性良好，但因其配體和作用機制的多樣性，LAG-3單一療法無法發(fā)揮良好的抗腫瘤作用。目前多項臨床研究顯示LAG-3與PD-1/PD-L1單抗的聯(lián)用策略在療效與安全性上具有很大的應(yīng)用前景。LAG-3與配體以及抗體藥物結(jié)合的結(jié)構(gòu)域的不斷明晰將促進闡明LAG-3調(diào)節(jié)T細胞活性的機制，并為開發(fā)靶向LAG-3藥物提供理論基礎(chǔ)[43]。

4 新型免疫檢查點抑制劑

4.1 T細胞免疫球蛋白黏蛋白3抑制劑

TIM-3也是一種負性共刺激分子，廣泛表達于多種免疫細胞中。目前TIM-3共發(fā)現(xiàn)有4個配體，包括半乳糖凝集素9（galectin9，Gal-9）、癌胚抗原相關(guān)細胞黏附分子1、高遷移率族蛋白B1和磷脂酰絲氨酸，其中Gal-9是TIM-3的主要配體。TIM-3通過與Gal-9結(jié)合，介導(dǎo)TIM-3+T細胞功能障礙和T細胞耗竭[44]。給予TIM-3抗體不僅可以增加先天性抗腫瘤活性，如增加NK細胞IFN-γ的分泌和樹突狀細胞（dendritic cell，DC）趨化因子（C-X-C基序）配體9[chemokine（C-X-C motif）ligand 9，CXCL-9）]的釋放等[45]，還能通過促進T細胞分泌IFN-γ，提高T細胞抗腫瘤免疫[46]。臨床前研究顯示，抗TIM-3治療在多種小鼠模型中具有抗腫瘤作用。在小鼠結(jié)腸癌模型中，腫瘤細胞分泌的Gal-9可以誘導(dǎo)腫瘤浸潤TIM-3+CD8+T細胞凋亡，而給予TIM-3抗體能有效減少其凋亡，并延緩腫瘤的生長[47]。

目前，靶向TIM-3的抗體藥物Sym023，INCAGN2390和LY3321367作為單一療法正在開展用于晚期實體瘤和淋巴瘤的臨床試驗（NCT03489343，NCT03652077，NCT04443751）。

LY3321367單藥在Ⅰ期臨床試驗中表現(xiàn)出良好的安全性，但抗腫瘤活性有限[45]。此外，研究表明PD-1抗體耐藥性的產(chǎn)生與TIM-3上調(diào)有關(guān)。一項TIM-3抗體與PD-1抗體聯(lián)合治療晚期實體瘤的臨床試驗顯示，聯(lián)用組在耐受性良好的同時也顯示出了更好的抗腫瘤活性[48]。目前正在廣泛開展TIM-3抗體與PD-1抗體聯(lián)合治療的研究。

盡管大量的臨床前和臨床研究表明TIM-3是一個有潛力的免疫檢查點，但仍有問題亟待解決。例如，由于TIM-3在多類細胞中廣泛表達，其抗體的全身應(yīng)用可能會帶來嚴重的不良反應(yīng)，因此需要研發(fā)出能特異性靶向TILs中TIM-3的抗體藥物。此外，TIM-3抗體的抗腫瘤免疫療效也有待進一步確證。與其他ICIs的聯(lián)合使用是TIM-3抗體當前最主要的應(yīng)用策略，但其仍處于早期研究階段，尋找有效的生物標志物來提高合用的有效性具有關(guān)鍵性意義。

4.2 分化簇47抑制劑

CD47在機體細胞中普遍表達，并在多種類型的實體瘤和血液系統(tǒng)腫瘤細胞中存在過度表達。CD47對于腫瘤免疫的調(diào)控主要是通過與配體信號調(diào)節(jié)蛋白α（signal regulatory protein α，SIRPα）相互作用，抑制巨噬細胞對腫瘤細胞的清除。腫瘤細胞上表達的CD47與巨噬細胞上的SIRPα相互作用，向巨噬細胞發(fā)出“不要吃我”信號，從而逃避巨噬細胞對腫瘤的監(jiān)控。因此，CD47-SIRPα被認為是腫瘤吞噬檢查點信號[49]。在臨床前研究中，CD47抗體在多類實體瘤和血液系統(tǒng)腫瘤中都具有抗腫瘤活性，卵巢癌、乳腺癌和結(jié)腸癌接種的荷瘤小鼠的腫瘤生長均被CD47抗體抑制[50]。

目前針對CD47的藥物研發(fā)主要包括3個方面：1）靶向CD47，在實體瘤Ⅰ期臨床試驗中，Hu5F9-G4（CD47人源化抗體）的耐受性良好，且該試驗中有2名患者的疾病穩(wěn)定期分別為5.2和9.2個月[51]。2）靶向SIRPα，在BI765063（SIRPα人源化抗體）的Ⅰ期臨床研究中，BI765063顯示出了單藥治療活性，并在1名晚期肝癌患者中具有持久的部分緩解。3）靶向腫瘤細胞CD47分子的SIRPα-Fc融合蛋白[49]，融合蛋白既通過SIRPα區(qū)段中和抑制CD47吞噬的信號，也可以通過Fc區(qū)與巨噬細胞上Fc受體結(jié)合進而促進吞噬作用的激活[52]；一項Ⅰ期臨床研究顯示，TTI-621（SIRPα-Fc融合蛋白）在彌漫性大B細胞淋巴瘤和T細胞非霍奇金淋巴瘤中總體反應(yīng)率分別為29%和25%，并具有良好的耐受性[53]。

CD47被認為是具有潛力的免疫檢查點，但靶向CD47的治療方案存在一定的不良反應(yīng)。例如，由于CD47在衰老紅細胞和血小板上普遍表達，CD47抗體的臨床治療常出現(xiàn)貧血與血小板減少癥。目前有多種策略用以改善其不良反應(yīng)，包括將導(dǎo)致紅細胞大量消耗的IgG1型CD47抗體轉(zhuǎn)換為Fc受體結(jié)合能力低的IgG4型；由于SIRPα不在紅細胞上表達，SIRPα靶向抗體能有效阻斷CD47與SIRPα的結(jié)合，并且避免由于CD47在衰老紅細胞和血小板中表達而導(dǎo)致CD47靶向抗體產(chǎn)生的血液毒性。同時，為提高CD47抗體的療效，目前正在廣泛開展CD47抗體與其他ICIs聯(lián)用的臨床試驗，仍有待進一步的研究確認。

4.3 T細胞免疫球蛋白和ITIM結(jié)構(gòu)域抑制劑

TIGIT主要表達于T細胞和NK細胞，3個配體分別是CD155，CD112和CD113[54]。其中，TIGIT與CD155的結(jié)合親和力高于CD112和CD113。TIGIT與CD155結(jié)合會抑制T細胞和NK細胞活性，并導(dǎo)致DC抗原呈遞減少、抗炎細胞因子分泌減少，從而導(dǎo)致T細胞活化受損。研究發(fā)現(xiàn)，TIGIT抗體單藥不足以抑制小鼠腫瘤的生長[55]，但在腫瘤形成之前使用TIGIT單抗可以延緩腫瘤的形成與轉(zhuǎn)移[56]。此外，研究表明TIGIT單抗與PD-1/PD-L1單抗聯(lián)用能增強TIGIT單抗的抗腫瘤作用[55]。

目前，已有多個TIGIT抑制劑進入臨床研究，但均未獲批上市。其中，只有4個TIGIT抗體進入了Ⅲ期臨床試驗，包括tiragolumab，vibostolimab，ociperlimab和domvanalimab。Tiragolumab是 目 前研發(fā)進展最快的TIGIT抗體，然而，不久前的一項Ⅲ期臨床試驗結(jié)果顯示tiragolumab聯(lián)合阿替利珠單抗（atezolizumab）相較于單藥組未能顯著延長非小細胞肺癌患者的PFS。此外，TIGIT抗體vibostolimab，可通過阻斷TIGIT與其配體CD112和CD155之間的相互作用，從而激活T淋巴細胞，發(fā)揮抗腫瘤作用。TIGIT抗體domvanalimab在治療非小細胞肺癌的早期臨床試驗中聯(lián)合PD-1抗體而療效增強，正在開展Ⅲ期臨床試驗。Ociperlimab（BGB-A1217）是宮頸癌治療臨床研究中最重要的TIGIT單抗之一。Ociperlimab保留了Fc效應(yīng)功能，可有效抑制腫瘤生長，且聯(lián)合tislelizumab可更好地達到抑制腫瘤的效果。

4.4 T細胞活化的V結(jié)構(gòu)域免疫球蛋白抑制因子抑制劑

VISTA與PD-L1和PD-L2具有一定的同源性，高度表達于髓源性抑制細胞以及免疫細胞。此外，VISTA也被發(fā)現(xiàn)高度表達于人類肺癌、腎癌和結(jié)直腸癌等多類腫瘤中。目前，VISTA已確認有2個具有免疫抑制功能的結(jié)合配體：V-set和含免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域蛋白3（V-set and immunoglobulin domain containing 3，VSIG3）和P選擇素糖蛋白配體1（P-selectin glycoprotein ligand 1，PSGL-1）[57]。在生理pH下，VISTA與VSIG3相互作用；在酸性pH下，表達VISTA的細胞可與T細胞上的PSGL-1結(jié)合。這2種相互作用都會抑制T細胞功能[58]。大多數(shù)有效的VISTA治療的模型都依賴于組合方法。在結(jié)腸癌小鼠模型中VISTA和PD-L1聯(lián)合治療，成功導(dǎo)致所有小鼠的腫瘤消退且長期存活，治愈率遠大于任一單一療法[59]。

雖然靶向VISTA的抗體在多種臨床前腫瘤模型中具有顯著的治療效果，但目前尚無批準上市的抗體藥物。VISTA單抗W-0180（K01401-020）尚處于Ⅰ期臨床試驗階段，其在pH 6 ～ 7.4時與VISTA結(jié)合，可破壞腫瘤中PSGL-1和VISTA之間的相互作用。另一個VISTA單抗HMBD-002，以高親和力和特異性結(jié)合人和鼠VISTA蛋白。在CT26小鼠模型中，HMBD-002治療對腫瘤進展產(chǎn)生了顯著的抑制作用，對腫瘤生長的抑制率大于60%，且未觀察到毒性。此外，HMBD-002與PD-L1單抗的聯(lián)用比任一單一療法更有效，特別是在有大量髓源性抑制細胞浸潤的腫瘤中。

5 討論

過去10年來，ICIs快速發(fā)展并被獲批用于多類惡性腫瘤的治療。雖然CTLA-4和PD-1/PD-L1抑制劑展現(xiàn)出顯著的療效，但由于腫瘤微環(huán)境的復(fù)雜性和腫瘤的異質(zhì)性，當前ICIs總體治療的有效率較低，并且部分ICIs療法存在不良反應(yīng)。為了提高對免疫療法的反應(yīng)性，研發(fā)基于新型免疫檢查點的ICIs以及針對多個免疫檢查點的雙特異性抗體用于癌癥治療是當前的一大研究熱點。雙特異性抗體能同時靶向2個不同的抗原，作用于2種協(xié)同或互補的信號通路，對表達2個靶點的腫瘤組織親和力增加，能有效增強ICIs的抗腫瘤免疫作用和降低ICIs的耐藥性。目前已研發(fā)了多種針對不同免疫檢查點的雙特異性抗體，如抗PD-1/TIM-3、抗PD-L1/TIGIT和抗PD-1/CTLA-4等，大量臨床試驗正在評估其安全性和療效。

此外，靶向新型免疫檢查點包括共抑制受體（LAG-3，TIM-3和CD47等）、共 刺 激 受體[糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)的腫瘤壞死因子受體相關(guān)蛋白（glucocorticoid-induced tumor necrosis factor receptor-related protein，GITR）和腫瘤壞死因子受體超家族成員4（tumor necrosis factor receptor superfamily member 4，TNFRSF4，又稱OX40）等]以及其他潛在靶點[吲哚胺2，3-雙加氧酶（indoleamine 2，3-dioxygenase，IDO）和Toll樣 受 體（Toll-like receptor，TLR）等]的藥物具有巨大的應(yīng)用前景。目前，大量ICIs正在開展臨床前和臨床研究，然而僅有很少的藥物獲批上市，新型ICIs的抗腫瘤作用仍有待臨床試驗確證。此外，新型ICIs的研發(fā)仍存在許多挑戰(zhàn)：1）部分檢查點蛋白結(jié)構(gòu)尚未完全解析，如LAG-3和VISTA，這增加了研發(fā)靶向小分子抑制劑的難度；2）部分免疫檢查點配體/受體識別尚不明確，如VISTA和B7-H3，配體/受體的準確識別將是充分了解免疫檢查點療效潛力的關(guān)鍵；3）部分免疫檢查點作用機制尚不明晰，存在多種作用機制或雙面性，如LAG-3和VISTA，明確免疫檢查點在腫瘤微環(huán)境中的作用機制將為ICIs的開發(fā)提供研究基礎(chǔ)。目前部分臨床研究表明這些新型ICIs單獨使用不足以發(fā)揮強效的抗腫瘤作用，免疫療法的合理聯(lián)用能最大程度實現(xiàn)抗腫瘤免疫的協(xié)同作用。

生物標志物能有效協(xié)助預(yù)測ICIs治療的有效性。PD-L1和dMMR/MSI-H是目前批準用于臨床指征PD-1/PD-L1抗體療效的生物標志物，其他潛在的預(yù)測性生物標志物仍需要更多的臨床研究證據(jù)支持。然而，單一生物標志物用以預(yù)測療效仍存在顯著的局限性，結(jié)合基因組、轉(zhuǎn)錄組、免疫特征分析和微生物組等多組學(xué)分析是更綜合的預(yù)測性標志物。此外，近幾年液體活檢生物標志物的發(fā)現(xiàn)為精準指導(dǎo)免疫治療提供了實時監(jiān)測的可能性。當前，多種ICIs聯(lián)用是腫瘤免疫治療的一大研究熱點，未來的研究需找到能有效預(yù)測ICIs療效和毒性的生物標志物，并結(jié)合藥效學(xué)參數(shù)來優(yōu)化其方案和新的聯(lián)合手段。