CORRECT介導的人HBB-28基因定點突變細胞株的建立及其應用*

劉永祥，麥慶云，黎允詩，梅珺琰，梁愛軍，彭新良，周瑞鴻，周少虎**

(1.廣州中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院生殖醫(yī)學科，廣東廣州 510405；2.中山大學附屬第一醫(yī)院生殖醫(yī)學中心，廣東廣州 510080；3.廣州醫(yī)藥研究總院有限公司，廣東廣州 510220)

β-地中海貧血(簡稱β-地貧)是由人β-珠蛋白(HBB)基因突變引起的，是我國南方發(fā)病率最高的單基因遺傳病[1]。其中，HBB-28(A>G)突變是我國β-地貧患者攜帶的5種最常見的HBB突變之一[2]。與其他亞型不同，HBB-28(A>G)突變位于起始密碼子上游28個堿基的啟動子區(qū)內，突變的產(chǎn)生破壞了轉錄因子ATA box的結合，降低了HBB的RNA表達[3]。純合子或復合雜合子-28(A>G)突變的患者可出現(xiàn)重度貧血或中間型貧血[4]，然而，由于純合子患者臨床材料有限，并且其基因突變位于非編碼區(qū)，目前非編碼區(qū)突變影響相關基因轉錄組表達水平的研究較少。

近年來，由于操作簡單、成本低和效率高等優(yōu)點，規(guī)律間隔成簇短回文重復序列(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats,CRISPR)技術被廣泛應用于各種生物體的基因組編輯[5]。利用CRISPR/Cas9基因編輯技術在特定位點制造特定的DNA雙鏈斷裂(DNA Double Strand Breaks,DSBs)和同源定向修復(Homology Directed Repair,HDR)以引入或糾正特定的基因突變已經(jīng)成為首選的方法[6]。本研究在CRISPR/Cas9技術的基礎上，通過沉默突變阻斷連續(xù)的再次靶向或再次切割的CRISPR/Cas靶點(Consecutive re-Guide or re-Cas steps to Erase CRISPR/Cas-blocked Targets，CORRECT)的新型無痕基因組編輯技術[7]，在人HBB基因上引入HBB-28(A>G)點突變，高效建立人β-地貧HBB-28(A>G)HEK293T純合突變細胞株，為后續(xù)疾病的細胞和分子基礎研究，以及建立基因突變修復方法奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞株和質粒

HEK293T細胞由本實驗室保存，CRISPR/Cas9質粒PX459購自美國Addgene公司，pCMV-GFP-p62購自上海碧云天生物技術有限公司。

1.1.2 主要試劑和儀器

限制性核酸內切酶BbsⅠ、T7EⅠ、AatⅡ、T4連接酶、T4磷酸化酶均購于美國NEB公司，小向導RNA (small guide RNA，sgRNA)以及PCR引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，單鏈寡核苷酸(single-stranded Oligo DNA Nucleotides,ssODNs)由蘇州金唯智生物科技有限公司合成，Trans 5α感受態(tài)細胞購自北京全式金生物技術有限公司，質粒提取試劑盒購自天根生化科技(北京)有限公司，X-tremeGENE HP DNA細胞轉染試劑盒購于上海羅氏制藥有限公司。熒光倒置顯微鏡為德國徠卡(Leica)儀器有限公司產(chǎn)品，PCR基因擴增儀為賽默飛世爾科技(中國)有限公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 sgRNA的設計與CRISPR/Cas9表達質粒構建

查詢人HBB基因序列(Genbank:NC_000011.10;https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)，利用網(wǎng)站https://crispr.mit.edu設計sgRNA靶點。根據(jù)確定的sgRNA靶點序列合成2對互補引物，sgRNA均為正義鏈序列靶點，因此，需在引物5′端加上BbsⅠ酶的黏性末端，其中，CACC加在正向引物前，AAAC加在反向引物前(表1)。sgRNA引物磷酸化與退火：分別取1 μL T4磷酸化酶、1 μL正向引物和1 μL 反向引物(濃度均為100 μmol)，混勻后進行5′端磷酸化修飾，并經(jīng)退火形成雙鏈(37℃，30 min；95℃，10 min)。雙鏈sgRNA與線性化CRISPR/Cas9質粒連接：分別取1 μL T4連接酶、2 μL退火產(chǎn)物，以及100 ng經(jīng)BbsⅠ酶處理的線性化二合一CRISPR/Cas9質粒，混勻后于16℃連接過夜，獲得PX459-sgRNA1-Cas9和PX459-sgRNA2-Cas9的共表達質粒。轉化(熱激法)：按照Trans 5α感受態(tài)細胞的產(chǎn)品說明書，將10 μL連接產(chǎn)物轉化入100 μL感受態(tài)細胞中，輕輕搖勻，冰上放置30 min，42℃水浴中熱激45 s，迅速置于冰上冷卻2 min，涂布于含50 μg/mL氨芐青霉素(Amp)的LB固體平板，37℃倒置培養(yǎng)16-18 h。測序驗證：分別挑取8個單克隆菌落至LB液體培養(yǎng)基中，37℃、220 r/min搖床擴增培養(yǎng)12-16 h，測序鑒定并挑選連接成功的PX459-sgRNA1-Cas9和PX459-sgRNA2-Cas9共表達陽性克隆，根據(jù)天根質粒小量提取試劑盒說明書提取陽性克隆質粒。

表1 sgRNA互補引物序列

1.2.2 ssODNs序列設計

選擇突變位點左右兩側各50 bp序列作為同源臂，合成外源性同源重組模板ssODNs (圖1)。設計ssODNs時采用CORRECT技術[7]，即在不引起氨基酸移碼突變或錯義突變的前提下，為防止基因組DNA成功突變后被CRISPR/Cas9系統(tǒng)二次切割，依據(jù)氨基酸的簡并性，在前間隔序列的鄰近基序(Protospacer Adjacent Motif,PAM)附近引入同義突變堿基(A>C)，重組后以終止Cas9 蛋白切割活性。因為HBB-28(A>G)位于非編碼區(qū)，故本研究均用阻斷突變(Blocking Mutation Base)表示。為方便后續(xù)的鑒定，在引入阻斷突變堿基的同時，引入一個新的限制性內切酶AatⅡ識別位點(5′-GACGTC-3′)。如圖1所示，ssODN1序列為正向序列，ssODN2為反向序列。

The red font is sgRNA sequence,the green font is PAM sequence,the yellow font is HBB-28 (A>G) mutation site,the blue font is A>C blocking mutation site,the lower horizontal line is the target sequence

1.2.3 脂質體轉染

轉染前于細胞培養(yǎng)瓶中復蘇HEK293T細胞，使用含有10%的新生牛血清(FBS)、1%雙抗(100 U/mL青霉素和鏈霉素)的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，當細胞傳代2-3次性狀穩(wěn)定且狀態(tài)較好時，將細胞消化后鋪于細胞六孔板中，待六孔板中每孔的HEK293T細胞密度匯合到該孔總細胞的70%-80%時，使用X-tremeGENE HP DNA細胞轉染試劑盒進行轉染操作。在HEK293T細胞中脂質體分別轉染1 μg、2 μg和3 μg含綠色熒光蛋白(Green Fluorescent Protein，GFP)的pCMV-GFP-p62表達載體，48 h后在熒光顯微鏡下觀察GFP的表達豐度，評估轉染效率，選擇合適的質粒濃度進行轉染。

轉染：將脂質體X-tremeGENE HP、PX459-sgRNA1-Cas9/PX459-sgRNA2-Cas9共表達質粒、ssODN1/ssODN2和無血清培養(yǎng)基室溫平衡至15-25℃，短暫漩渦混勻脂質體X-tremeGENE HP；用無血清培養(yǎng)基將PX459-sgRNA1-Cas9或PX459-sgRNA2-Cas9共表達質粒稀釋至終濃度為1 μg質粒DNA/100 μL無血清培養(yǎng)基(0.01 μg/μL)，輕柔混勻；再加入1.5倍PX459-sgRNA1-Cas9或PX459-sgRNA2-Cas9共表達質粒體積的脂質體(脂質體切勿接觸到塑料管壁)，室溫孵育15-20 min，得到轉染復合物；用吸管沿著邊緣輕輕吸去六孔板中的細胞培養(yǎng)液，再加入2 mL新鮮的含有10%的FBS、1%雙抗的DMEM培養(yǎng)基后，將處理好的轉染復合物逐滴全部加入，輕輕搖勻，培養(yǎng)24 h后棄去培養(yǎng)液，并更換為2 mL含有0.6 μg/mL嘌呤霉素(Puromycin)的無血清培養(yǎng)基進行藥物篩選，繼續(xù)培養(yǎng)48 h，收集孔內的一半細胞并提取基因組DNA，PCR擴增含有突變位點的片段進行測序鑒定，得到作用sgRNA1和sgRNA2靶點的陽性克隆。

1.2.4T7EⅠ實驗與整合效率檢測

如圖1所示，在ssODN發(fā)生整合后，會在1號外顯子上游28個堿基處引入HBB-28(A>G)點突變和1號外顯子上游26個堿基處引入阻斷突變堿基(A>C)，此時將得到一個新的限制性內切酶AatⅡ識別位點(5′-GACGTC-3′)。為了驗證不同靶點的切割效率，以及正、反鏈ssODN的整合效率，將實驗分為4組：①sgRNA1+ssODN1、②sgRNA1+ssODN2、③sgRNA2+ssODN1、④sgRNA2+ssODN2。采用1.2.3節(jié)的方法將各組進行脂質體轉染48 h后收取HEK293T細胞，收集野生型293T細胞和實驗組①-④部分細胞提取基因組DNA，PCR擴增含靶點的片段，引物為HBB-FP：5′-GCAATTTGTACTGATGGTATGG-3′；HBB-RP：5′-ATAACAGCATCAGGAGTGGAC-3′。PCR 擴增反應條件為預變性94℃、4 min;變性94℃、30 s,退火56℃、30 s，延伸72℃、30 s，35個循環(huán)；總延伸72℃、10 min，4℃保存。最后分別取200 ng PCR產(chǎn)物進行T7EⅠ(T7EⅠ 0.5 μL和相應buffer 1 μL，共10 μL體系，37℃，0.5 h)和AatⅡ(AatⅡ 0.5 μL和相應buffer 1 μL，共10 μL體系，37℃，1 h)酶切，使用10×Loading buffer終止酶切反應后，取8 μL酶切產(chǎn)物進行1%瓊脂糖凝膠電泳，選擇有切割效率的PCR產(chǎn)物進行Sanger測序。

凝膠成像后用ImageJ軟件進行灰度分析，比較各組切割效率和整合效率。切割效率用T7EⅠ酶切活性表示，整合效率用AatⅡ酶切活性表示。切割效率[8]=1-[c/(a+b+c)]0.5(其中a、b分別為凝膠圖中被切割2條電泳條帶對應ImageJ軟件的峰面積；c為未被切割條帶的峰面積，也是最大的峰面積)。根據(jù)被整合細胞占T7EⅠ切割陽性細胞的百分比，設定相對整合效率的計算公式：相對整合效率=(AatⅡ酶切活性/T7EⅠ酶切活性)×100%。被AatⅡ切割越多，說明該組發(fā)生基因重組或整合的細胞越多，整合效率越高。

1.2.5 單克隆培養(yǎng)與鑒定

根據(jù)酶切實驗的結果，選擇整合效率最高的實驗組采用96孔板計數(shù)稀釋接種的方法[9]進行單克隆篩選，細胞采用含有10%的FBS、1%雙抗的DMEM培養(yǎng)基，于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)4-5 d后，觀察除去雙細胞和多細胞孔，對細胞形態(tài)正常且單一細胞孔做標記；繼續(xù)培養(yǎng)7-9 d，待細胞長滿整個孔后，吸取孔內2/3的單克隆集落細胞提取基因組DNA，挑選10個單克隆集落細胞,采用1.2.4節(jié)的PCR方法擴增含有突變位點的片段，并進行測序鑒定，獲得含目標純合突變的單克隆細胞株。

2 結果與分析

2.1 CRISPR/Cas9表達質粒構建

根據(jù)圖2的質粒測序分析結果可知，PX459-sgRNA1-Cas9和PX459-sgRNA2-Cas9共表達質粒構建成功。

圖2 PX459-sgRNA1-Cas9和PX459-sgRNA2-Cas9共表達質粒測序結果

2.2 脂質體轉染效率

熒光顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，轉染1 μg質粒時不到20%的細胞表達GFP，轉染2 μg質粒時表達GFP的細胞比例達到80%，轉染3 μg質粒時表達GFP的細胞比例在85%以上(圖3)。為了減少轉染的毒性同時又達到較好的轉染效果，選擇轉染2 μg質粒進行后續(xù)實驗。

(a) Fluorescence spectra of transfected by 1 μg,2 μg and 3 μg GFP plasmids;(b) The bright field and green fluorescence image of 2 μg GFP plasmid transfection

2.3 HBB-28基因(A>G)定點突變HEK293T細胞株的建立

2.3.1 sgRNA切割效率和ssODNs整合效率驗證

sgRNA切割效率實驗(T7EⅠ酶切活性)：PCR擴增包含有突變位點在內的片段，實驗組①-④的PCR產(chǎn)物總長度是578 bp，且均表現(xiàn)出切割活性，酶切后分為3條條帶：原有條帶578 bp，以及被切割后的372 bp和206 bp兩條條帶(圖4)。結合灰度分析，實驗組①-④的切割效率分別為27.19%、22.72%、18.62%和21.49%(表2)。對于HBB-28基因，活性最高的是sgRNA1，因此，后續(xù)的基因定點突變實驗選用sgRNA1進行。

ssODNs整合效率實驗(AatⅡ酶切活性)：當ssODNs整合至目標位置時，會被AatⅡ酶識別并切割，如圖4的電泳圖及表2的灰度分析結果所示，實驗組①-④均有AatⅡ酶的酶切活性，整合效率分別為26.41%、22.25%、14.78%和12.84%，說明這4組均有ssODNs整合。

M:Marker;①:sgRNA1+ssODN1;②:sgRNA1+ssODN2;③:sgRNA2+ssODN1;④:sgRNA2+ssODN2

表2 各組切割效率、整合效率和相對整合效率

根據(jù)表2匯總的各組切割效率、整合效率和相對整合效率可知，實驗組①的切割效率和整合效率最高，其相對整合效率為97.14%，與相對整合效率最高的實驗組② (97.96%)相差不大。為了減少實驗結果的誤差，對實驗中的PCR產(chǎn)物進行T7EⅠ酶切和AatⅡ酶切的重復實驗，結果與初次實驗差異不大。因此，選擇實驗組①進行后續(xù)的單克隆篩選實驗。

2.3.2 測序鑒定

結合圖4和表2的灰度分析，以及圖5峰值結果，實驗組①-④均發(fā)生了切割和整合，引入了β-地貧基因HBB-28(A>G)和阻斷突變堿基(A>C)，且實驗組①和②的雜合峰值比實驗組③和④高(圖5)，說明實驗組①和②的切割效率和整合效率高，但未進行單克隆挑選，故顯示為雜合的峰圖。

2.4 β-地貧基因HBB-28(A>G)定點突變的單克隆HEK293T細胞株的建立

如圖6所示，單克隆HEK2937細胞株同時引入了HBB-28(A>G)和阻斷突變(A>C)堿基。10個單克隆中還包含5個雜合突變、1個非目標突變純合細胞株以及3個無相應堿基突變的野生型細胞株。

The blue arrow shows HBB-28 pathogenic point mutation base (A>G),and the red arrow shows blocking mutation base(A>C)

The blue arrow shows HBB-28 pathogenic point mutation base (A>G),and the red arrow shows blocking mutation base(A>C)

3 討論

CRISPR/Cas9基因編輯技術是繼鋅指核酸酶(Zinc-Finger Nucleases，ZFNs)和轉錄激活因子樣效應物核酸酶(Transcription Activator-Like Effector Nucleases，TALENs)技術之后出現(xiàn)的第三代新型基因編輯技術。CRISPR/Cas9基因編輯技術通過導向sgRNA招募Cas9蛋白在細胞內靶基因特定位點進行特異切割形成DNA雙鏈斷裂，進而誘發(fā)同源重組和非同源末端連接的自我修復過程，實現(xiàn)對基因組特定靶點的編輯[5,10]。該技術操作便捷、重復性好，而且易于設計、插入效率高，已在醫(yī)學、藥物、生命科學等多領域得到廣泛應用[11]。

在哺乳動物細胞中，基因HDR頻率相對少見，大多數(shù)情況下DSBs由非同源連接(Non-Homologous End Joining,NHEJ)修復[12]。然而，HDR介導的基因插入在人類疾病模型制備、基因治療和農(nóng)業(yè)遺傳改良等方面具有重要作用，但是其效率很低[13]。因此，如何提高HDR的頻率對提高編輯效率顯得格外重要。其中，單鏈供體ssODNs模板的應用，有助于提高HDR的頻率。與利用雙鏈DNA(double strand DNA,dsDNA)模板或其他遺傳操作進行小片段插入、缺失或點突變不同，對于短片段的插入，ssODNs作為供體模板具有更高的基因插入效率[14]。另外， dsDNA同源模板受拓撲結構、同源臂長度等影響，構建過程需要數(shù)周，而ssODNs合成時間短，且不需要任何篩選標記就可以一步完成基因精確修復，不會隨機整合到基因組中，是一種更加安全、精確的基因編輯方法[15,16]。

Kwart等[7]和Paquet等[17]利用CRISPR/Cas9和ssODN在人類多功能干細胞中引入與疾病相關的致病突變時發(fā)現(xiàn)，高達95%的已編輯位點的序列會被再次編輯，造成額外的indel突變破壞。利用CORRECT技術能夠有效阻斷多個位點的再次編輯，這些阻斷突變堿基能以高效率、高精度選擇性引入單等位或雙等位基因序列，使HDR的編輯精度提高到每個等位基因的10倍，阻斷突變的位點越接近PAM位點，HDR的效率越高[7，17]。為了提高HDR的頻率，本研究一方面利用CORRECT基因編輯新技術在CRISPR/Cas9靶向所需PAM序列附近插入同義突變堿基到HDR模板中，在很大程度上阻止不良的再次編輯，提高了ssODNs的相對整合效率(達97.14%)，獲得了純合的單克隆HBB-28(A>G)細胞株。另一方面，本研究在PAM前5個堿基處引入限制性內切酶AatⅡ識別位點，同樣得到較好的編輯和整合效率。比較ssODNs的正反方向對整合效率的影響發(fā)現(xiàn)，sgRNA1和sgRNA2均為正義鏈序列的靶點，對于編輯效率高的sgRNA1靶點，正、反向ssODNs的整合效率分別為26.41%和22.25%，相對整合效率分別為97.14%和97.96%，表明正、反方向的ssODNs對相對整合效率影響不大。對于編輯效率相對較弱的sgRNA2靶點，正、反向ssODNs的整合效率分別為14.78%和12.84%，相對整合效率分別為79.42%和59.72%，表明對sgRNA2靶點而言，正向ssODN1的相對整合效率更高。但該結果是否適用于其他靶點，需要進一步驗證。盡管針對單個等位基因的阻斷突變堿基(同義突變)的引入不影響氨基酸序列，但是引入的突變堿基是否在DNA或RNA水平影響細胞的轉錄調控或內部功能尚不清楚。遺傳密碼被破解以來，人們通常認為遺傳密碼具有簡并性，同義突變是無害的，不會改變蛋白質序列[18，19]。然而Shen等[20]最近的研究發(fā)現(xiàn)大多數(shù)同義突變是非常有害的，他們通過改造釀酒酵母基因組中21個有代表性的基因，制造了8 341個突變體，結果顯示至少75%的同義突變顯著損害釀酒酵母的適應度，且損害幅度超過0.1%，是自然選擇在釀酒酵母中所能感知的最小適應度變化的10 000倍。但是該實驗是在單倍體芽殖酵母中進行的，后期需要在不同生物體及其雜合狀態(tài)下做進一步的實驗驗證。

本研究雖然未進行基因點突變后的細胞功能驗證，但是在方法學上提供了一種新型、高效的點突變編輯方法，且該方法同樣適用于特定基因突變位點的修復，為后續(xù)的研究奠定了模型和方法基礎。