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    VPAHPND毒力蛋白PirAB的原核表達與純化*

    2022-02-09 13:03:34范賢平曹曉慧徐軍田胡闖顯
    廣西科學(xué) 2022年6期
    關(guān)鍵詞:毒力克隆質(zhì)粒

    范賢平,張 晟,蔣 葛,曹曉慧,喬 毅,成 婕,徐軍田,胡闖顯,沈 輝**

    (1.江蘇海洋大學(xué)海洋生命與水產(chǎn)學(xué)院,江蘇連云港 222000;2.江蘇省海洋水產(chǎn)研究所,江蘇南通 226007;3.江蘇農(nóng)墾金鯉漁業(yè)有限公司,江蘇鹽城 224500)

    急性肝胰腺壞死病(Acute Hepatopancreatic Necrosis Disease,AHPND)是一種新出現(xiàn)的對蝦病害,可感染凡納濱對蝦(Penaeusvannamei)、斑節(jié)對蝦(Penaeusmonodon)和中國對蝦(Fenneropenaeuschinensis),死亡率為70%-100%[1]。據(jù)相關(guān)研究表明,AHPND病原為攜帶一個69 kD的pVA1質(zhì)粒,可編碼pirA、pirB毒力基因的一類弧菌(VPAHPND),通過基因重組和敲除技術(shù),發(fā)現(xiàn)pirA和pirB的突變導(dǎo)致菌株致病力消失,證明PirA和PirB毒力蛋白是引起AHPND的主要致病因子[2]。Victorio-De Los Santos等[3]通過克隆重組PirA和PirB毒力蛋白,發(fā)現(xiàn)PirB亞基是一種特異性氨基糖凝集素,可與蝦肝胰腺上皮細胞膜上受體分子結(jié)合,從而觸發(fā)細胞大量脫落,這進一步證實了PirA、PirB毒力蛋白是AHPND的關(guān)鍵致病因子。

    研究發(fā)現(xiàn)pirA和pirB毒力基因共同位于1 665 bp的基因片段上,pirA(336 bp)與pirB(1 317 bp)基因之間相隔12 bp基因序列,該序列分析結(jié)果與熒光發(fā)光桿菌(Photorhabdus)的pirA2B2[4]和致病桿菌屬(Xenorhabdus)的pirAB[5]基因相似,二者都利用自身的啟動子進行表達,重組表達產(chǎn)生的PirAB毒素對四齡棉鈴蟲(Helicoverpaarmigera)具有較強的殺蟲毒性[6]。Sirikharin等[7]將pirA和pirB基因片段分別克隆并連接到pET-17b載體和pGEX-4T-1載體,并在大腸桿菌(Escherichiacoli) BL-21(DE3)中表達,結(jié)果發(fā)現(xiàn)單獨表達pirA或pirB基因所得到的蛋白沒有毒性或毒性較低,猜測PirA和PirB重組蛋白需要結(jié)合才能誘發(fā)AHPND的典型癥狀。然而,誘導(dǎo)死亡所需的重組PirA和重組PirB組合的數(shù)量相對較高,其次表達載體、重組蛋白的構(gòu)建方法和表達細胞系的選擇不同,可能導(dǎo)致重組蛋白的構(gòu)象和活性發(fā)生變化,影響毒力大小[7-10],最后PirA和PirB在致病機制中的作用尚未完全確定。本研究通過PCR擴增獲得VPAHPND的毒力基因,克隆并連接到pET 21b(+)原核表達載體上,并進行原核表達和純化,以獲取大量PirA、PirB及PirAB蛋白,為下一步的PirA/PirB毒力和抗體的研究積累技術(shù)基礎(chǔ)。

    1 材料與方法

    1.1 菌株和質(zhì)粒

    VPAHPND菌株(編號1669)和表達質(zhì)粒pET 21b(+)由江蘇省海洋水產(chǎn)研究所生物技術(shù)室保存并提供,克隆菌株E.coliTop10、表達菌株E.coliBL-21(DE3)購自南京諾唯贊生物科技股份有限公司。

    1.2 試劑及儀器

    高分子量蛋白marker、2×Taq PCR MasterMix、DNA分子量 marker、Nhel和Scal限制性內(nèi)切酶、異丙基硫代半乳糖苷(Isopropyl β-D-thiogalactoside,IPTG)、辣根過氧化氫酶DAB顯色試劑盒、Mag-Beads His-Tag蛋白純化磁珠、硝酸纖維素印跡膜(NC印跡膜)、10×TBST WB漂洗液購自生工生物工程(上海)股份有限公司;細菌基因組DNA提取試劑盒、DNA純化回收試劑盒購自天根生化(北京)科技有限公司;兔抗(PirA和PirB)一抗、山羊抗兔IgG二抗(辣根過氧化物酶HRP標記)購自康為世紀生物科技有限公司,ClonExpressⅡ重組克隆試劑盒購自南京諾唯贊生物科技股份有限公司;SDS-PAGE凝膠制備試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司。蛋白電泳槽(DYCZ-24DN)、濕轉(zhuǎn)儀(DYCZ-4OD)購自北京六一生物科技有限公司;冷凍離心機、PCR儀、移液槍均購自德國艾本德公司(Eppendorf);超微量分光光度計(DeNovix DS-11)購自廣州市深華生物技術(shù)有限公司。

    1.3 方法

    1.3.1 目的片段的擴增

    將經(jīng)平板純化的VPAHPND1669菌種轉(zhuǎn)接到LB液體培養(yǎng)基,28℃、200 r/min培養(yǎng)16 h,6 000 g離心收集菌體,采用細菌基因組DNA提取試劑盒提取DNA。根據(jù)GenBank登錄的pirAB基因(NC_025152.1)序列設(shè)計3對引物,分別用于擴增pirA、pirB、pirAB (表1)。下劃線分別為Nhel、Scal兩個酶切位點。pirA引物:pirA-F-Nhel/pirA-R-Scal,pirB引物:pirB-F-Nhel/pirB-R-Scal,pirAB 引物:pirAB-F-Nhel/pirAB-R-Scal。反應(yīng)體系:2×Taq PCR MasterMix 12.5 μL,DNA 模板1 μL,上下游引物各1 μL (10 μmol/L),ddH2O 9.5 μL。PCR反應(yīng)程序:94℃預(yù)變性5 min;94℃變性30 s,55℃退火30 s,72℃延伸60 s,共30個循環(huán);最后72℃終延伸10 min。擴增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定后,用DNA純化回收試劑盒純化并回收目的片段。

    表1 PCR引物

    1.3.2 重組表達質(zhì)粒的構(gòu)建

    使用Nhel和Scal限制性內(nèi)切酶酶切載體pET 21b(+),酶切體系:ddH2O 11 μL,載體30 μL,10×QuickCut Buffer 5 μL,Nhel和Scal各2 μL;酶切反應(yīng)條件:37℃水浴2 h。酶切產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定,用DNA回收試劑盒純化并回收目的片段。利用ClonExpressⅡ重組克隆試劑盒將pirA、pirB和pirAB的PCR擴增DNA片段連接到質(zhì)粒載體pET 21b(+),將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細胞Top10中,涂布于含有100 μg/mL 氨芐青霉素(Amp)的LB平板上,37℃過夜培養(yǎng)后,挑取單克隆進行Nhel和Scal雙酶切驗證,驗證正確的質(zhì)粒送南京擎科生物科技有限公司測序。將鑒定正確的重組表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)入E.coliBL21 (DE3)中,涂布于LB平板(添加 100 μg/mL Amp),37℃過夜培養(yǎng),挑取單克隆菌落送南京擎科生物科技有限公司測序,進一步驗證連接的正確性及所克隆基因的完整性。

    1.3.3 重組蛋白表達條件的優(yōu)化

    將鑒定正確的重組菌接種至含100 μg/mL Amp的LB液體培養(yǎng)基,37℃、200 r/min搖床培養(yǎng)過夜。為得到高濃度的重組蛋白,對誘導(dǎo)表達過程中的IPTG濃度、誘導(dǎo)溫度和誘導(dǎo)時間進行優(yōu)化。時間和溫度優(yōu)化:在1.0 mmol/L IPTG濃度下,分別于20℃、25℃和30℃條件下,以150 r/min搖床培養(yǎng)4 h、8 h、12 h、16 h、20 h和24 h,各取2 mL菌液進行檢測。IPTG濃度優(yōu)化:分別以0.01 mmol/L、0.1 mmol/L、0.2 mmol/L、0.4 mmol/L、0.6 mmol/L、0.8 mmol/L、1.0 mmol/L和2.0 mmol/L IPTG于20℃、150 r/min誘導(dǎo)16 h,各取2 mL菌液,離心棄上清。將菌體用0.01 mol/L PBS緩沖液重懸,冰浴超聲波破碎菌體,超聲條件:45 W、超聲5 s 停5 s,總時間5 min,超聲后4℃、10 000 r/min 離心10 min,分別取其上清液和沉淀進行SDS-PAGE電泳分析,確定最佳誘導(dǎo)條件。

    1.3.4 重組蛋白的純化與分析

    按1∶100體積比接種過夜培養(yǎng)的重組菌液于500 mL含100 μg/mL Amp的LB液體培養(yǎng)基中,160 r/min、37℃培養(yǎng)菌液至OD600為0.6-0.8;以實驗確定的誘導(dǎo)時間、溫度、IPTG濃度誘導(dǎo)表達重組蛋白。誘導(dǎo)表達結(jié)束后,10 000 g離心10 min收取菌體,并用0.01 mol/L PBS重懸菌體進行超聲波破碎,10 000 g離心10 min收取上清液。按照Mag-Beads His-Tag蛋白純化磁珠說明書進行操作,使用含有不同濃度咪唑(5 mmol/L、10 mmol/L、20 mmol/L、50 mmol/L、500 mmol/L)的洗脫緩沖液進行目標蛋白純化,并收集洗脫液。純化的蛋白進行SDS-PAGE電泳分析,并采用超微量分光光度計測定其蛋白質(zhì)含量。

    1.3.5 Western blot檢測重組蛋白表達

    純化蛋白經(jīng)12% SDS-PAGE分離,轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜,用5%脫脂牛奶于室溫封閉過夜;用1×TBST WB漂洗液洗滌3次,每次5 min;加入兔抗(PirA和PirB)一抗(1∶1 000稀釋),室溫孵育2-3 h;1×TBST WB漂洗液洗滌3次,每次5 min,加入辣根過氧化物酶HRP標記的山羊抗兔IgG二抗(1∶4 000稀釋),于室溫孵育1 h;1×TBST漂洗液洗滌3次,每次10 min。最后用辣根過氧化氫酶DAB顯色試劑盒底物顯色液顯色,觀察結(jié)果。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 表達菌株的構(gòu)建

    pirA、pirB及pirAB擴增片段分別為336 bp、1 317 bp、1 665 bp,與預(yù)測目的條帶大小一致[圖1(a)];空載質(zhì)粒pET 21b(+)雙酶切后全長為5 442 bp [圖1(b)];將目的片段和雙酶切后的pET 21b(+)質(zhì)粒載體連接后,獲取重組質(zhì)粒pET21b-pirA、pET 21b-pirB、pET21b-pirAB,經(jīng)雙酶切驗證,條帶大小與預(yù)測一致[圖1(c)]。經(jīng)測序結(jié)果分析,pirA、pirB和pirAB序列成功克隆至載體質(zhì)粒中。

    M:DNA marker,(a) Electrophoresis of PCR amplified fragments,(b) Double enzyme digestion of pET 21b(+) vector fragments,(c) Double enzyme digestion of recombinant plasmi

    2.2 重組蛋白表達分析

    2.2.1 IPTG濃度對誘導(dǎo)表達的影響

    PirA (17 kDa)、PirB (50 kDa)及PirAB (50+17) kDa在8個濃度梯度組中均呈現(xiàn)清晰的目的條帶,表明8個濃度的 IPTG 都能誘導(dǎo)重組PirA、PirB和PirAB蛋白的表達,PirB和PirAB在不添加IPTG的情況下也能成功表達 (圖2)。重組蛋白PirB和PirAB在IPTG濃度為0時的表達量顯著低于IPTG濃度為0.01 mmol/L的表達量(圖3),其他濃度的IPTG對重組蛋白表達量影響較小。因此,確定誘導(dǎo)重組蛋白PirA、PirB和PirAB表達的IPTG最適濃度為0.01 mmol/L。

    M:Protein molecular weight standard;1-9:Supernatant of induced bacterial crushing solution (IPTG concentrations were 0 mmol/L,0.01 mmol/L,0.1 mmol/L,0.2 mmol/L,0.4 mmol/L,0.6 mmol/L,0.8 mmol/L,1.0 mmol/L,2.0 mmol/L,respectively);The target protein is shown in the frame

    M:Protein molecular weight standard;1:IPTG concentration of 0.01 mmol/L;2:IPTG concentration of 0 mmol/L

    2.2.2 誘導(dǎo)溫度和時間對誘導(dǎo)表達的影響

    重組表達的溫度和誘導(dǎo)時間結(jié)果表明,隨著誘導(dǎo)時間的延長,重組蛋白PirA和PirAB表達量顯著上升,并于24 h達到峰值;重組蛋白PirB的表達量在誘導(dǎo)4 h后沒有顯著變化(圖4)。重組蛋白在20℃、25℃和30℃條件下均能較好地表達,細菌裂解液的上清液和沉淀中都能觀察到目的條帶,根據(jù)目的條帶的粗細可知,80%左右的重組蛋白為可溶性表達(圖4)。如圖4:(j)-(l)所示,在20℃、25℃、30℃條件下,PirA和PirAB誘導(dǎo)24 h,PirB誘導(dǎo)4 h時,上清液樣品SDS-PAGE結(jié)果中30℃誘導(dǎo)培養(yǎng)時重組蛋白PirA、PirB和PirAB表達量最大。以上結(jié)果表明,30℃為PirA、PirB和PirAB重組蛋白的最適誘導(dǎo)溫度,重組蛋白PirA和PirAB的最適誘導(dǎo)時間為24 h,重組蛋白PirB的最適誘導(dǎo)時間為4 h。

    M:Protein molecular weight standard;1:Broken liquid of uninduced bacteria;2-7:Supernatant of the disrupted liquid of induced bacteria (times are 4 h,8 h,12 h,16 h,18 h,24 h,respectively);8-13:Broken induced bacteria liquid precipitation (times are 4 h,8 h,12 h,16 h,18 h,24 h,respectively);The target protein is shown in the frame

    2.3 重組蛋白純化及濃度測定

    重組蛋白經(jīng)純化后濃度為1.2-2.0 mg/mL,PirA、PirB重組蛋白經(jīng)10 mmol/L咪唑洗脫后能得到高純度蛋白,PirAB經(jīng)20 mmol/L、50 mmol/L、500 mmol/L咪唑洗脫液后均能得到高純度蛋白,獲得的3種高純度重組蛋白均可滿足多克隆抗體制備的要求(圖5)。

    M:protein molecular weight standard;1:Unpurified crude protein;2,3:Wash miscellaneous liquid;4-8:Eluent (imidazole concentration is 5 mmol/L,10 mmol/L,20 mmol/L,50 mmol/L,500 mmol/L);The target protein is shown in the frame

    2.4 Western blot檢測重組蛋白表達

    Western blot 檢測結(jié)果顯示,PirA、PirB及PirAB分別在17 kDa、50 kDa及(50+17) kDa附近顯色(圖6),與預(yù)測蛋白大小一致,表明所獲得的純化重組蛋白均具有較好的免疫原性。

    M:protein molecular weight standard;1:PirAB;2:PirA;3:PirB

    3 討論

    AHPND主要致病因子為毒力蛋白PirAB,大量獲取該蛋白的方式主要為硫酸銨沉淀法和異源表達。致病菌菌體中毒力蛋白PirAB表達量少,硫酸銨沉淀法獲得的毒力蛋白雜蛋白多,后期純化復(fù)雜,不利于后期的攻毒實驗。原核表達系統(tǒng)可以目標明確地獲得大量融合蛋白,通過親和層析純化,可有效降低雜蛋白含量,獲得高純度重組目的蛋白[11]。本研究直接將pirAB的全序列插入含有6個His標簽的pET 21b(+)載體中,然后將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入E.coliBL21(DE3),并對重組菌種的表達條件進行優(yōu)化,最后成功表達了PirA、PirB和PirAB重組蛋白。

    誘導(dǎo)劑IPTG為乳糖類似物,不受細胞代謝的影響,但IPTG對E.coli生長亦存在抑制作用,因此,在不影響融合蛋白表達的基礎(chǔ)上應(yīng)選用最小的劑量[12]。柴政斌等[13]發(fā)現(xiàn),IPTG濃度對融合蛋白GST-PADI4的表達量無明顯影響,但可溶性目的蛋白的比例會隨著濃度的升高而增加。在本研究中,IPTG濃度為0時的PirB及PirAB表達量顯著低于濃度為0.01 mmol/L的表達量,其他濃度的IPTG對重組蛋白表達量影響較小。另外,相關(guān)研究表明,低溫誘導(dǎo)蛋白能促進蛋白的正確折疊,從而得到較好的可溶性蛋白,但合成的速率較慢[14]。本研究發(fā)現(xiàn),PirA、PirB和PirAB重組蛋白主要以可溶性蛋白形式存在,不易形成包涵體,盡管不同誘導(dǎo)溫度對各重組蛋白的表達影響較小,但在30℃條件下,重組蛋白的表達比例最高。這一結(jié)果與葉彩燕[15]誘導(dǎo)表達VPAHPNDPirB蛋白的誘導(dǎo)溫度一致。

    PirAB與蘇云金芽孢桿菌 (Bacillusthuringiensis,Bt)殺蟲蛋白Cry具有較高的同源性,推測PirAB破壞宿主細胞的作用機制與Cry毒素較相似[16]。Lin等[17]的研究表明,在純化PirA和PirB單體的情況下,兩者相互結(jié)合的親合力較低,并提出了這兩種二元毒力復(fù)合物的異四聚體相互作用模型,認為PirA和PirB蛋白在重組的情況下形成的PirA/PirB復(fù)合體才會具有較強的細胞毒性,且PirA/PirB的結(jié)構(gòu)也不穩(wěn)定。pirA和pirB基因位于毒力質(zhì)粒(pVA1)的同一個操縱子上[18],理論上認為,這兩個基因在共表達情況下才產(chǎn)生PirA和PirB毒素,此時這兩者的相互作用才具有較高的細胞毒力[19]。Yang等[5]將嗜線蟲致病桿菌(Xenorhabdusnematophila) HB310 的pirA基因去除終止密碼子后,通過柔性連接子linker與pirB基因連接重組并融合表達了PirAB-fusion蛋白,同時共表達了PirAB蛋白;經(jīng)針對大蠟螟(Galleriamellonella)的半數(shù)致死量(LD50)驗證,共表達的PirAB蛋白生物活性比PirA/PirB重組蛋白混合物強,PirAB-fusion蛋白喪失了生物活性。在本研究中,在不去除PirA的終止密碼子的前提下,聯(lián)合表達pirA和pirB基因,得到的重組蛋白PirAB具有17 kDa的PirA蛋白和50 kDa的PirB蛋白,該聯(lián)合表達蛋白理論上具有較高的細胞毒性,可為后期抗體的研發(fā)提供技術(shù)資料。

    綜上所述,本實驗在最適誘導(dǎo)條件和高效純化條件下獲得了小批量高純度的PirA、PirB重組蛋白,并首次共表達了VPAHPND的PirAB蛋白,SDS-PAGE電泳分析表明,表達的3種重組蛋白主要以可溶性形式存在,Western blot分析證實該重組蛋白質(zhì)具有良好的反應(yīng)原性。此實驗結(jié)果為下一步的抗體制備和致病機理研究提供了充足的實驗材料,為AHPND的防控研究提供了實踐基礎(chǔ)。

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