利用光譜法檢測(cè)血痕變化時(shí)序性研究

曹 娜

（河南警察學(xué)院，河南 鄭州 450046）

血液主要由血漿和血細(xì)胞組成，除了大量水分，還有無(wú)機(jī)鹽、纖維蛋白原、酶、激素等化學(xué)基團(tuán)[1]。血液離體后水分不斷揮發(fā)，酰胺、脂類(lèi)、核酸血紅蛋白及其衍生物（高鐵血紅蛋白、高鐵血紅素原）等化學(xué)基團(tuán)會(huì)隨客觀環(huán)境發(fā)生變化。血液中的大多數(shù)化學(xué)基團(tuán)不斷分解，不同物質(zhì)的分解速率不同，同一物質(zhì)的不同基團(tuán)、同一基團(tuán)的不同振動(dòng)類(lèi)型變化趨勢(shì)亦不相同，這些都會(huì)對(duì)光譜的吸收效果造成影響。

當(dāng)前，有多種技術(shù)方法用于推斷血痕形成時(shí)間，如核糖核酸（Ribonucleic Acid，RNA，分為mRNA或microRNA）降解分析法[2]、傅里葉變換衰減全反射紅外光譜（Attenuated Total internal Reflectance Fourier Transform Infraredspectroscopy，ATR-FTIR）技術(shù)[3]、紫外可見(jiàn)積分球反射光譜法[4]、紫外可見(jiàn)漫反射光譜法[5]、數(shù)字圖像分析技術(shù)[6]等。本研究利用光譜法對(duì)血液樣品進(jìn)行檢測(cè)并對(duì)光譜圖進(jìn)行分析處理，以期找到血痕的時(shí)序性變化規(guī)律。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)儀器及材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)儀器及工作條件

（1）島津牌紫外分光光度計(jì)，光波波長(zhǎng)為250～800 nm。

（2）島津牌傅里葉紅外光譜儀（AIM-9000）。光譜波數(shù)：4 000～400 cm-1。測(cè)定模式：透過(guò)率。變跡函數(shù)：Happp-Genzel。分辨率：4.0 R。掃描次數(shù)：32。光束：內(nèi)部。動(dòng)鏡速度：2.8 mm/s。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)耗材

石英比色皿，醫(yī)用酒精，滅菌采血針，消毒棉簽若干。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)檢材

健康成年男性的新鮮血液：記錄志愿者的相關(guān)信息（年齡/性別/健康情況），利用消毒棉簽沾取酒精對(duì)志愿者手指進(jìn)行消毒，然后使用滅菌采血針對(duì)志愿者進(jìn)行現(xiàn)場(chǎng)采血，采集新鮮血液1 mL。

1.2 方法

打開(kāi)傅里葉紅外光譜儀，調(diào)整好實(shí)驗(yàn)設(shè)備參數(shù)；依次進(jìn)行空白背景掃描和金剛石背景掃描并保存圖譜；安裝ATR附件；用一次性滴管吸取一滴樣本1號(hào)血液，滴在ATR金剛石表面；點(diǎn)擊樣本掃描，待掃描完成后導(dǎo)出實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)至新建文件夾中；等待10 min后再次點(diǎn)擊樣本掃描，導(dǎo)出數(shù)據(jù)；以10 min為間隔進(jìn)行24小時(shí)段間隔掃描。將每次掃描光譜圖按照測(cè)量時(shí)間命名進(jìn)行編號(hào)，保存至文件夾。

打開(kāi)紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)等相關(guān)儀器，并打開(kāi)相關(guān)軟件，設(shè)置好相關(guān)參數(shù)，進(jìn)行空白背景掃描，充分預(yù)熱機(jī)器。預(yù)熱機(jī)器30 min后，將抽取的新鮮血液滴在石英比色皿中，放入紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)進(jìn)行檢驗(yàn)，保存數(shù)據(jù)并記錄相關(guān)事件，等待10 min后再次掃描檢材。多次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，記錄并保存相關(guān)數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果與討論

2.1 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)前期預(yù)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，設(shè)定好相關(guān)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，按照實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行操作，獲得穩(wěn)定的數(shù)值。

2.1.1 紅外光譜檢測(cè)血痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果

利用傅里葉紅外光譜儀檢測(cè)新鮮血痕時(shí)，利用OPUS軟件對(duì)出峰點(diǎn)和峰值數(shù)據(jù)進(jìn)行提取，血痕的光譜隨時(shí)間變化。紅外光譜檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，血痕的變化主要集中在血液滴落后150 min內(nèi)，血痕光譜圖出峰點(diǎn)隨時(shí)間變化。不同時(shí)間光譜圖在不同位置的峰形和峰位有一定差異，變化主要集中在波數(shù)為1 540、1 650、2 360、3 300 cm-1的附近，如圖1所示。

由圖1可以看出，血痕的吸收峰較強(qiáng)，隨時(shí)間變化較為明顯。為了直觀地展現(xiàn)變化規(guī)律，對(duì)出峰點(diǎn)和峰值數(shù)據(jù)進(jìn)行提取并形成表格（見(jiàn)表1）。

表1 紅外光譜圖像峰值

圖1 150 min內(nèi)血液紅外光譜變化

在波數(shù)400～1 000 cm-1，隨著時(shí)間推移，峰型沒(méi)有劇烈變化。在血液滴落1.5 h內(nèi)，該波段曲線比較平穩(wěn)，波峰未出現(xiàn)強(qiáng)烈變化；隨后1.0 h內(nèi)，吸光度明顯下降。在1 000～1 750 cm-1，波峰變化劇烈。在血液滴落2.0 h內(nèi)，吸光度持續(xù)升高。隨后0.5 h，吸光度不斷降低。在2 300～2 390 cm-1，血液滴落前1.5 h內(nèi)，吸光度不斷升高；隨后1.0 h內(nèi)，吸光度持續(xù)降低。在3 000～3 650 cm-1，血液滴落前1.5 h內(nèi)，吸光度不斷提高；隨后1.0 h內(nèi)，吸光度緩慢降低。

2.1.2 紫外光譜實(shí)驗(yàn)結(jié)果

利用紫外光譜儀檢測(cè)新鮮血痕發(fā)現(xiàn)，血液的變化主要集中在2.0 h內(nèi)，血痕光譜圖出峰點(diǎn)隨時(shí)間變化。血液形成的圖像隨時(shí)間的變化表現(xiàn)在出峰點(diǎn)數(shù)量上，在0～1.0 h內(nèi)，樣本的光譜圖像有5個(gè)出峰點(diǎn)，為578、543、416、342、275 nm。1.0 h后，血液的光譜圖像出峰點(diǎn)數(shù)量明顯減少，從5個(gè)變?yōu)?個(gè)（342 nm出峰位置消失）。

血液樣本的出峰點(diǎn)位置相對(duì)固定，一般為578、543、416、275 nm。利用UVWin5紫外軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，整理4個(gè)出峰點(diǎn)的時(shí)序性變化（見(jiàn)圖2）。雖然出峰點(diǎn)會(huì)有一定偏差，但偏差較小，通常出峰點(diǎn)位置偏離1～2 nm，暫且不能排除其他外部環(huán)境干擾或儀器本身導(dǎo)致的出峰點(diǎn)位置偏移。

圖2 120 min內(nèi)血液紫外光譜圖主要峰位時(shí)序性變化

在波長(zhǎng)為275 nm的位置，出峰點(diǎn)的吸光度在0.5 h呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，在0.5～1.5 h呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，在1.5～2.0 h呈現(xiàn)穩(wěn)定狀態(tài)。在波長(zhǎng)為416 nm附近，出峰點(diǎn)的吸光度在0.5 h內(nèi)呈現(xiàn)明顯的上升趨勢(shì)，在0.5～1.0 h呈現(xiàn)不明顯的下降趨勢(shì)，在1.0～3.0 h呈現(xiàn)穩(wěn)定狀態(tài)。在波長(zhǎng)為543 nm附近，出峰點(diǎn)的吸光度在0.5 h呈現(xiàn)明顯的下降趨勢(shì)，在0.5～2.0 h呈現(xiàn)不明顯的上升趨勢(shì)，在2.0～3.0 h呈現(xiàn)相對(duì)穩(wěn)定的狀態(tài)，雖然出現(xiàn)一定波動(dòng)，但是變化并不明顯。在波長(zhǎng)為578 nm附近，出峰點(diǎn)的吸光度在最初0.5 h內(nèi)呈現(xiàn)明顯的下降趨勢(shì)，在0.5～1.5 h呈現(xiàn)不明顯的上升趨勢(shì)，在1.5 h后呈現(xiàn)相對(duì)穩(wěn)定的狀態(tài)，雖然出現(xiàn)一定波動(dòng)，但是變化并不明顯。出現(xiàn)波動(dòng)的原因可能是外部環(huán)境因素干擾或者實(shí)驗(yàn)儀器本身不穩(wěn)定。

2.2 討論

對(duì)照紅外光譜各基團(tuán)特征峰可以看出，O—H的伸縮震動(dòng)區(qū)位于3 000～3 750 cm-1。Tidball J G[6]指出，在1 657 cm-1附近有極強(qiáng)的液態(tài)水O—H及氫鍵的吸收峰。由此可以看出，變化較為劇烈的1 600～1 700 cm-1和3 000～3 650 cm-1區(qū)間血液滴落2.0 h內(nèi)變化明顯，可能是血液中水分大量蒸發(fā)導(dǎo)致的結(jié)果。N—H的伸縮震動(dòng)區(qū)也位于3 000～3 750 cm-1，C—H的伸縮震動(dòng)區(qū)位于3 000～3 300 cm-1，C—O的伸縮震動(dòng)區(qū)位于1 000～1 475 cm-1，這與血液中水分變化的紅外光譜區(qū)域重合，水分的劇烈變化影響了血液中其他蛋白質(zhì)類(lèi)、酰胺類(lèi)物質(zhì)的吸收峰變化。

對(duì)照紫外光譜譜圖[7]，紅細(xì)胞和血紅蛋白在275、415、540 nm處有特征峰，且隨時(shí)間推移，在血液滴落初期的0.5 h內(nèi)吸光度有所變化，后持續(xù)反向變化，在1.5 h后呈穩(wěn)定狀態(tài)。紅細(xì)胞單獨(dú)在575 nm位點(diǎn)有特征峰，但變化與上述位點(diǎn)相似，均是0.5 h內(nèi)和0.5 h后明顯變化，原因可能是血液中水分變化劇烈，紅細(xì)胞逐漸破裂而出現(xiàn)不同變化。

通過(guò)重復(fù)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，利用紅外光譜儀和紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)分析不同人體血痕得到的光譜圖像略有不同，峰值也有一定差異，但是不同個(gè)體血痕的光譜圖像大體曲線和走勢(shì)基本保持一致。

通過(guò)實(shí)驗(yàn)可知，在血痕形成的2.0 h內(nèi)，血痕的光譜圖像變化較為明顯。2.0 h后，血痕的光譜圖像十分穩(wěn)定，無(wú)法通過(guò)光譜圖像的變化規(guī)律確定血痕的形成時(shí)間。

3 結(jié)論

選取不同儀器對(duì)滴落血液的時(shí)序性變化進(jìn)行分析，得到以下結(jié)論：人體血液在紅外光譜儀和紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)的照射下，得到的光譜圖具有相對(duì)穩(wěn)定的出峰點(diǎn)。通過(guò)紅外光譜儀檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，出峰點(diǎn)位置在860、1 650、2 350、3 300 cm-1附近。通過(guò)紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，出峰點(diǎn)位置為275、416、543、578 nm。雖然出峰點(diǎn)位置會(huì)有一定偏移，但偏移距離在允許偏移范圍內(nèi)。利用紅外光譜儀和紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)檢測(cè)血痕，得到的光譜圖像變化主要集中在前2.0 h內(nèi)，2.0 h后光譜圖像相對(duì)穩(wěn)定。2.0 h后血痕光譜圖峰值產(chǎn)生變化的原因可能是外部環(huán)境的改變或儀器本身不穩(wěn)定。

綜上，采用無(wú)損分析法檢測(cè)新鮮血液中不同化學(xué)基團(tuán)的時(shí)序性變化趨勢(shì)，方法簡(jiǎn)便，特征峰變化明顯，后續(xù)希望能建立較精確的數(shù)學(xué)模型推斷血痕形成時(shí)間，以便更好地研究血痕形成機(jī)制。