閃式提取法提取油茶果殼中單寧的工藝研究

張余華，吳 艷，黃建軍，賀義昌★，王召瀅，雷小林

（1.井岡山市林業(yè)局，江西 井岡山 343600；2.峽江縣林業(yè)局，江西 吉安 331400；3.江西省林業(yè)科學院，江西 南昌 330013）

油茶（Camellia oleifera）又稱茶子樹、茶油樹、木子樹，為山茶科（Theaceae）山茶屬（Camellia）常綠小喬木。是我國特有的高級木本油料植物，廣泛分布于淮河以南等地[1]，種子榨油供人食用。茶油色香味清，營養(yǎng)豐富，易儲藏，含有許多的不飽和脂肪酸，以及多種抗氧化活性成分，是一種健康食用植物油，長期食用能夠保護人體心血管功能、提高免疫力、預防高血壓疾病等[2-7]，同時其也可作為潤滑油、防銹油以做工業(yè)用途。油茶果殼占油茶果總質量的60%以上[8]，其主要成分有纖維素、半纖維素和植物單寧，它們都是化工、肥料、食品、飼料工業(yè)產品等的原料，油茶果殼還能用來制成糖醛、活性炭等物質[9]。調查發(fā)現(xiàn)，大部分企業(yè)和農戶加工茶油后剩下的油茶果殼通常都會被填埋或者焚燒，不僅導致生物活性化合物的浪費，還造成環(huán)境污染，目前僅有宜春一家企業(yè)利用油茶果殼作為基質生產海鮮菇，大量的油茶果殼尚待開發(fā)利用。因此，通過一定的工藝手段將廢棄的油茶果殼中的活性成分提取出來變廢為寶，不但可以獲得較大的經濟收益，助力鄉(xiāng)村振興，還可以很大程度改善生態(tài)環(huán)境。油茶果殼中單寧含量高，是豐富的天然鞣質來源。單寧又稱作單寧酸，是一種有著生物活性的高分子多元酚類化合物，與蛋白質生物堿多糖具有結合能力，易與金屬離子發(fā)生絡合反應，可溶于水和極性有機溶劑；具有良好的抗菌、抗病毒、抗過敏、抗氧化等生理活性[10]，廣泛應用于皮革生產、食品、日用化工等行業(yè)，也可以作為化妝品的成分，起到收斂、防曬、美白、抗皺、保濕及防腐作用[11-13]。提取油茶果殼中單寧的方法有很多，如浸提法、超聲波提取法[14]、微波提取法[15]等，目前為止，關于閃式提取法提取油茶果殼中單寧的研究鮮有報道。閃式提取法是一種用于植物軟、硬組織破碎的新型提取方法，它是依靠高速機械剪切力和超動分子滲濾技術，在溶劑存在下短時間內把植物破碎至細微顆粒，并使有效成分迅速達到組織內外平衡，通過過濾達到提取目的。閃式提取法能最大限度保留植物的有效成分，且其成分受熱不易破壞，提取時間短，溶劑用量小，且結構緊湊，使用時安全可靠[16]。本研究以油茶果殼為材料，通過單因素和正交試驗篩選出閃式提取法提取油茶果殼中單寧的最優(yōu)工藝條件，并且還對收集自不同地區(qū)的不同品系油茶果殼單寧含量進行差異性分析，以期為后續(xù)研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

在江西省內，收集了6個贛無系列的不同油茶品系，分別是贛無1、贛無2、贛8、贛68、贛70、興48，其中贛無1采自信豐、靖安；贛無2取自高安、信豐、靖安、宜春、豐城；贛8取自高安、靖安、宜春、山茶園、林豐林場；贛68取自信豐、林豐林場、馬13號2小區(qū)、馬18號3小區(qū)；贛70取自宜春、林豐林場；興48取自豐城、宜春、山茶園、林豐林場。試驗使用的油茶果殼樣品經過曬干、除去灰土、碎石和碎屑等步驟之后，用粉碎機粉碎后過篩，備用。

1.2 儀器與試劑

ME104E電子天平（美國梅特勒）；XHF-DY閃式提取器（寧波新芝）；UV-1800紫外可見分光光度計（日本島津）；DW-HL430粉碎機（中科美菱）；RE52-86A旋轉蒸發(fā)儀（上海亞榮）。

單寧酸，二甲基甲酰胺，檸檬酸鐵銨，鎢酸鈉，鉬酸鈉，碳酸鈉，甲醇、無水乙醇均為分析純；水為超純水。

1.3 實驗方法

1.3.1 單寧的提取方法

稱取0.3 g油茶果殼粉末，加入1 mL的蒸餾水，充分搖勻成勻漿后轉移到EP管中，閃式提取，離心10 min，取上清液待測。

1.3.2 單寧的測定方法

單寧在堿性條件下與磷鉬酸反應，生成藍色化合物，在760 nm處有最大吸收峰。波長調節(jié)至760 nm處，用蒸餾水調零；試劑一（鎢酸鈉-鉬酸鈉混合溶液）和試劑二（碳酸鈉溶液）37℃預熱10 min以上。

取兩支試管標記為對照管和測定管，在對照管中加入135μL蒸餾水，測定管中加入5μL樣本和130 μL蒸餾水，混勻后兩支試管分別加入35μL試劑一，搖勻靜置5 min，分別加入30μL試劑二，混勻，室溫靜置30 min，760 nm處讀取吸光值A，△A=A測定-A對照。

1.3.3 單寧含量計算

用微量石英比色皿測定的公式如下：

標準條件下測定的回歸方程為：y=1.6418x+0.0134；x為標準品質量濃度（mg·mL-1），y為△A（其值為A測定-A對照）。

單寧含量（mg·g-1）=[(ΔA-0.0134)÷1.6418×V1]÷(W×V1÷V2)=0.609×(ΔA-0.0134)÷W

V1為加入樣本體積，mL；V2為加入提取液體積，mL；W為樣本質量，g。

1.3.4 單因素試驗和正交試驗

在上述實驗操作方法上，選取閃式提取時間（1 min、2 min、3 min、4 min、5 min）、乙醇體積分數（30%、40%、50%、60%、70%）、料液比（g∶mL）1∶8、1∶10、1∶12、1∶14、1∶16作為影響因素，以單寧含量作為測定指標進行單因素試驗；通過單因素試驗結果選取最佳影響因素進行正交試驗，測定單寧含量，得到閃式提取油茶果殼單寧的最優(yōu)工藝條件。

1.3.5 數據處理

使用Excel進行數據的整理與計算；利用DPS數據處理系統(tǒng)進行差異性分析。

2 結果與討論

2.1 單因素試驗

2.1.1 提取時間對油茶果殼中單寧含量的影響

稱取油茶果殼樣品0.3 g，按乙醇體積分數50%，料液比（g∶mL）1∶10，轉速15 000 r·min-1,在提取時間分別為1 min、2 min、3 min、4 min、5 min的條件下提取，按照1.3項下的實驗方法進行操作。由圖1可知，當提取時間＜3 min時，單寧含量隨提取時間的增加而增加，當提取時間＞3 min后，果殼中單寧含量反而逐漸下降，原因可能是提取時間越長，溫度升高導致分子結構被破壞，生物活性下降，導致單寧含量降低。故后續(xù)實驗的提取時間確定為3 min。

圖1 提取時間對單寧含量的影響Fig.1 Effect of extraction time on tannin content

2.1.2 乙醇體積分數對單寧含量的影響

稱取油茶果殼樣品0.3 g，按提取時間3 min，料液比（g∶mL）1∶10，轉速15 000 r·min-1，在乙醇體積分數分別為30%、40%、50%、60%、70%的條件下提取，按照1.3項下的實驗方法操作。由圖2可知，當乙醇體積分數低于60%時，油茶果殼中單寧的含量隨乙醇體積分數的增加而上升，當乙醇體積分數高于60%時，油茶果殼中單寧含量隨乙醇體積分數的增加而下降，原因可能是油茶中的其他醇溶性物質隨著體積分數的增加而溶解，與單寧競爭乙醇導致單寧含量降低。因此，本文后續(xù)實驗的乙醇體積分數確定為60%。

圖2 乙醇體積分數對單寧含量的影響Fig.2 Effects of ethanol on tannin content

2.1.3 料液比對單寧提取的影響

圖3 料液比對單寧含量的影響Fig.3 Effect of solid-liquid ratio on tannin content

稱取油茶果殼樣品0.3 g，按乙醇體積分數為60%，轉速15 000 r·min-1，提取時間3 min，在料液比（g∶mL）分別為1∶8、1∶10、1∶12、1∶14、1∶16的條件下提取，按照1.3項下的實驗方法操作。由圖3可知，當料液比低于1∶12時，油茶果殼中單寧含量隨料液比的增加而增大，當液料比高于1∶12時，單寧含量出現(xiàn)小幅度的減少。這可能是由于一開始油茶果殼中的單寧沒有被提取完全，當溶劑的用量增加時，增大了其與提取溶劑的接觸面積，固液濃度差拉大，有利于擴散速度的提高，所以提取量不斷增加。因此在后續(xù)的實驗中將使用1∶12的料液比進行實驗。

2.2 正交試驗

在單因素試驗的基礎上，為了進一步考察各因素對油茶果殼中單寧含量的影響，得出閃式提取法提取油茶果殼中單寧的最佳工藝條件，本文選擇提取時間（2 min、3 min、4 min）、乙醇體積分數（50%、60%、70%）、料液比（g∶mL）1∶10、1∶12、1∶14為主要影響因素，進行3因素3水平的正交試驗，采用L9(33)正交表探究提取時間、乙醇體積分數、料液比對油茶果殼中單寧的提取量的影響程度大小及閃式提取法最佳的工藝條件，結果見表1、表2。

表1 提取條件因素水平Tab.1 Extraction condition factor level

表2 L9(33)正交試驗表及極差分析結果Tab.2 L 9(33)Orthogonal test design table and range analysis results

正交試驗和極差分析結果如表2所示，分析可知，本實驗影響因素排序為：提取時間＞料液比＞乙醇的體積分數。根據單寧含量進行分析，最佳組合為A2B2C1，即提取時間為3 min，乙醇體積分數為60%，料液比為1∶10，所得單寧含量為0.039 mg·g-1。

2.3 驗證性實驗

精確稱取油茶果殼樣品0.3 g，在最佳工藝A2B2C1（提取時間3 min，乙醇體積分數為60%，料液比1∶10）的條件下，按1.3中的實驗方法進行操作，測定吸光度，并且計算出油茶果殼中單寧含量。進行3次平行驗證性實驗，得到的驗證結果為0.039 mg·g-1，說明該實驗條件下篩選的最佳提取工藝穩(wěn)定性較好，可行性較高。

2.4 不同品系油茶果殼單寧含量的差異性分析

將不同品系的油茶果殼采用1.3中的實驗方法測定其單寧的含量，并對結果采用DPS軟件進行統(tǒng)計分析，結果如表3所示。

表3 不同品系油茶果殼的單寧含量比較Tab.3 Comparison of tannin content in different strains of C.oleifera shell

采集的6個品系油茶果殼單寧含量在0.031～0.04mg·g-1范圍，其中贛70的平均單寧含量最高，為0.039 mg·g-1，其次是贛無2，為0.035 mg·g-1，贛8和興48的單寧含量相近，含量最低的是贛無1和贛68，為0.031 mg·g-1。結果表明6個品系油茶果殼單寧含量差異不明顯，在不同地區(qū)采集的同一品系油茶果殼其單寧含量差異不明顯，原因可能是油茶果殼單寧是油茶果殼次生代謝產物，基本不受不同品系和不同地理因子的影響。

3 結論與討論

本文以油茶果殼為材料，通過單因素試驗確定了閃式提取法提取時間、乙醇體積分數、料液比對單寧含量的影響，通過正交試驗對閃式提取法提取油茶果殼中的單寧工藝進行了優(yōu)化，得出了最佳的工藝條件，即閃式提取時間為3 min，乙醇的體積分數為60%，料液比為1∶10。該條件下提取時間短、效率高、所得單寧含量高。同時對收集到的江西省林業(yè)科學院選育出的6個不同無性系的油茶果殼單寧含量進行測定，結果表明，不同無性系的油茶果殼的單寧含量無顯著差異。

閃式提取法是近年來出現(xiàn)的一種新型提取方法，與傳統(tǒng)提取方法相比較，閃式提取法具有提取時間短、提取效率高、操作簡便、節(jié)能高效且所提取單寧含量也有一定的提高等優(yōu)點，此方法已被用于黃酮、黨參炔苷、植物單寧、香菇多糖等生物活性成分的提取，目前鮮有人用此法來提取油茶果殼中的單寧，本文通過實驗證實了用閃式提取法提取油茶果殼中的單寧這一方法是可行的，并得出了最優(yōu)工藝條件，為后續(xù)純化單寧等研究提供參考和實驗基礎，對今后油茶果殼生物活性成分提取的規(guī)?；瘧镁哂辛己糜绊?。

油茶在我國種植面積大、范圍廣、來源易，其早期研究主要以種子和根莖為主。油茶籽可取出榨油，而油茶果殼常常被視為廢棄物，其實油茶果殼不僅可以用來作生產助劑和表面活性劑的原料，也可以直接磺化，制成磺化油用于絲綢工業(yè)，皂化后用于制皂業(yè)和印染工業(yè)等。油茶果殼所含活性成分較多，有多糖、黃酮、皂苷、多酚、單寧等，其中單寧具有抗菌、抗病毒、抗過敏等作用，從油茶果殼中提取的天然色素也廣泛運用于食品、醫(yī)藥、化妝品等行業(yè)，提取出來的活性成分和天然色素在食品、營養(yǎng)補充劑和化妝品添加劑等領域具有良好的前景。對油茶各個部分進行充分研究不僅可以減少資源的浪費，而且可以推動研究技術的發(fā)展。國家林業(yè)和草原局《林草產業(yè)發(fā)展規(guī)劃（2021-2025年）》中提及茶油年產量從72萬t提升到200萬t，可見國家對油茶產業(yè)的重視程度。江西省也重點支持油茶產業(yè)高質量發(fā)展，發(fā)展油茶產業(yè)大有可為。