一株楊樹灰霉病原菌的分離及鑒定

馮連榮，宋立志，趙大根，矯麗曼

（遼寧省楊樹研究所，遼寧 蓋州 115213）

新林1號楊（PopulusבXinlin 1’）是國有新民市機械林場培育的楊樹品種，屬于黑楊派與青楊派的雜交種[1]，樹干通直，樹冠冠形圓滿，樹枝多而密，雄株，無飛絮，2015年9月通過遼寧省林木良種委員會被審定為楊樹良種，2016年10月取得了林木良種生產(chǎn)經(jīng)營許可證。與意大利214楊（P.×euramericana cv.‘I-214’）、蓋 楊（P.×gaixianensis）、107楊（P.×euramericana cv.‘Neva’）和108楊（P.×euramericana cv.‘Guariento’）相比，其生長優(yōu)勢明顯且抗逆性較強[2]，目前在遼寧省內(nèi)沈陽、錦州、葫蘆島等地被大面積推廣，推廣效果良好，是纖維材、膠合板材等原料林重要造林品種，也是重要的防護林造林品種之一[1]。

新林1號楊1年生扦插盆栽苗在溫室內(nèi)培養(yǎng)過程中，發(fā)現(xiàn)其中1株盆栽苗葉片上出現(xiàn)圓形病斑，為鑒定引起該病斑的病原菌種類，于室內(nèi)進行了病原菌菌種分離，并利用rDNA-ITS序列分析進行了分子鑒定，為下一步研究該病原菌致病機理及防治方法等奠定基礎(chǔ)。

1 試驗材料與方法

1.1 植物材料

新林1號楊（PopulusבXinlin1’）1年生扦插盆栽苗，置于25℃人工智能溫室內(nèi)培養(yǎng)，空氣濕度70%~80%。

1.2 酶和試劑

TaKaRa Ex Taq、DL2000 Marker購自TaKaRa生物工程有限公司、TIANGEN植物快捷型DNA提取系統(tǒng)（非離心柱型）試劑盒購自北京天根生化有限公司；引物ITS1：CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA；ITS4：TC CTCCGCTTATTGATATGC，引物合成于上海生工生物工程有限公司。

1.3 菌種分離

將采集的新林1號楊病葉于超凈工作臺中按下列步驟進行菌種分離：無菌水清洗病葉3遍，75%酒精消毒2 min，無菌水漂洗3次，0.1%HgCl消毒2 min，無菌水漂洗3次，剪取病健交界處葉片組織約0.5 cm2接種至PDA固體平板培養(yǎng)基中。每個平板接種2塊，置于25℃生化培養(yǎng)箱中進行黑暗培養(yǎng)。待菌落直徑為2 cm左右時，挑取菌落邊緣菌絲進行轉(zhuǎn)接、純化，將純化后的菌株命名為XL-1，于4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 致病性測定

根據(jù)柯赫氏法則，采用離體葉片接種，以菌絲塊作為接種材料進行致病性測定。4℃冰箱中保存的菌株接種于PDA平板培養(yǎng)基上，25℃培養(yǎng)7 d，用直徑為6 mm的打孔器在菌落邊緣打取菌餅。取健康的新林1號楊中上部葉片，葉柄末端用浸水脫脂棉包裹，葉片表面用75%酒精擦拭消毒后，將菌餅放置在主脈兩側(cè)葉片上，每側(cè)放置一個菌餅，對照處理接種PDA培養(yǎng)基塊，將處理后的葉片放置在直徑為11 cm的培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)皿底部鋪2層濾紙，滴1 mL無菌水進行保濕，25℃條件下培養(yǎng)，觀察葉片發(fā)病情況。葉片發(fā)病后，從發(fā)病部位進行再次分離，通過柯赫氏法則以驗證分離菌株是否為病原菌。

1.5 病原菌分子生物學(xué)鑒定

4℃冰箱中保存的菌株接種于PDA平板培養(yǎng)基上，25℃培養(yǎng)7 d，無菌刀片刮取平板菌絲，經(jīng)液氮速凍后進行研磨，用TIANGEN快捷型植物基因組DNA提取系統(tǒng)（非離心柱型）進行DNA提取，具體操作步驟按照說明書進行。提取后的DNA用TE Buffer溶解于－20℃保存?zhèn)溆茫⒗肈HS NanoPro測定DNA濃度。以DNA為模板進行ITS-PCR擴增，反應(yīng)體系及應(yīng)程序見馮連榮[3]。反應(yīng)結(jié)束后，擴增產(chǎn)物送至TaKaRa（大連）生物工程有限公司進行測序，測序結(jié)果登錄NCBI（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）進行序列BLAST比對分析。下載相似性序列，用Clustalw進行多序列比對，并輔以人工修正，分析時所有參數(shù)均為軟件默認值。利用MEGA7.0軟件采用N-J法構(gòu)建進化樹，進行系統(tǒng)發(fā)育分析，構(gòu)建發(fā)育樹時進行自舉檢驗，重復(fù)抽樣1 000次。

2 結(jié)果與分析

2.1 純種菌絲的獲得

經(jīng)過組織分離及轉(zhuǎn)接，獲得了XL-1純種菌絲，菌落特征見圖1，菌落平展邊緣整齊，菌絲絮狀、灰白色，后期變?yōu)榛液稚?，不產(chǎn)生色素。菌絲生長速度較快，5 d左右可以長滿整個平板。

圖1 XL-1菌落正、反特征Fig.1 Positive and negative characteristics of XL-1 colony

2.2 XL-1致病性測定

致病性測定結(jié)果（圖2）顯示,接種PDA培養(yǎng)基的對照組未產(chǎn)生病斑，接種XL-1菌餅的處理組發(fā)病，隨著接種時間的延長病斑面積逐漸增大：接種后第2天，菌餅邊緣長出菌絲，菌餅覆蓋處葉片組織出現(xiàn)小病斑，病斑直徑約1 cm；第3天病斑面積增大且菌絲透過葉片生長；第5天葉片表面出現(xiàn)大量霉層，第6天霉層布滿整個葉片。對病斑組織再次進行病原菌分離獲得相同菌絲，證明新林1號楊葉部病斑由XL-1引起。

圖2 XL-1致病性測定Fig.2 Determination of pathogenicity of XL-1

2.3 XL-1分子生物學(xué)鑒定

提取XL-1菌絲DNA，利用DHS NanoPro測定DNA濃度為68.953 ng·μL-1，A260/A280為1.96。DNA經(jīng)0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測，條帶單一明亮（圖3A），證明DNA質(zhì)量較好。以DNA為模板，ITS1/ITS4為引物進行PCR擴增，結(jié)果獲得大小約為500 bp的目的條帶（圖3B）。PCR產(chǎn)物送至TaKaRa（大連）生物工程有限公司進行測序，測序結(jié)果顯示目的片段

行BLAST序列比對，獲得的相似序列均為Botrytis屬真菌，大多數(shù)為B.cinerea和B.fabae，其中與登陸號為MH212236.1的B.cinerea覆蓋度為100%，相似性為100%。下載排名靠前的B.cinerea和B.fabae序列，利用MEGA7.0構(gòu)建進化樹（圖4），XL-1與B.cinerea聚為一支，親緣關(guān)系較近。另外通過GenBnak下載Botrytis屬標準菌株ITS序列，進行系統(tǒng)進化樹構(gòu)建（圖5），結(jié)果顯示XL-1同樣與B.cinerea聚為一支，故將XL-1鑒定為B.cinerea（灰葡萄孢）?；移咸焰邽榻z孢綱（Hyphomycetes）叢梗孢目（Miniliales）叢梗孢科（Moniliaceae）葡萄孢屬（Botrytis）。

3 結(jié)論與討論

圖3 DNA電泳結(jié)果Fig.3 Results of DNA electrophoresis

圖4 基于ITS序列N-J法構(gòu)建進化樹Fig.4 Construction of phylogenetic tree based on ITS gene using N-J method

圖5 基于N-J法構(gòu)建XL-1與標準菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.5 Construction of phylogenetic tree of XL-1 and standard strains based on N-J method

楊樹是遼寧省平原地區(qū)的主要造林樹種，在防護林和用材林的建設(shè)中均占有重要地位，具有防風固沙、水土保持、農(nóng)田防護、固碳釋氧、凈化空氣等作用，同時還承擔著產(chǎn)業(yè)建設(shè)的重任，為社會提供大量木材，解決木材短缺、供給不足的問題[1]。在楊樹生長過程中，經(jīng)常會受到各種病原菌的侵染，其中葉部病害較為常見，如楊樹黑斑病[4]、楊葉銹病[5-6]、楊樹葉枯病[7-8]等，目前關(guān)于楊樹灰霉病的研究報道還比較少。楊樹灰霉病主要危害楊樹的莖和葉，在新植楊樹中發(fā)生較重，影響楊樹生長，降低了造林成活率，嚴重時可以導(dǎo)致楊樹大面積死亡[9-10]。段冰冰研究表明Del/Ros基因在新疆楊（P.alba var.pyramidalis）的株系過表達，可顯著提高新疆楊葉片中的丹寧、花青素、槲皮素、山奈酚以及總酚等黃酮類物質(zhì)的含量，進一步提高了其對灰霉病的抗病能力[9]。吉海龍研究了長枝木霉（Trichoderma longibrachiatum）T05對灰霉病菌的抑菌活性，菌落對峙培養(yǎng)結(jié)果顯示T05對灰霉病菌抑菌率達88.4%，其產(chǎn)生的揮發(fā)性物質(zhì)對灰霉病菌抑菌率達91.9%[10]。

灰霉菌又稱灰葡萄孢菌，是一種廣寄主性的、能夠引起多種植物幼苗、果實及儲藏器官的猝倒、落葉、花腐、爛果及爛窖的病源菌[11]。潮濕時病部表層產(chǎn)生大量的灰色霉層（分生孢子梗和分生孢子），稱為灰霉病。灰葡萄孢被認為是新鮮水果蔬菜中最重要的采后病原菌之一，也被認為是全球范圍第二重要的植物病原菌[12-13]。它對各種重要經(jīng)濟作物的災(zāi)難性影響，造成全球每年100億~1000億美元不等的經(jīng)濟損失[14]。在葡萄（Vitis viniferax×V.labrusca'Shuijing'）[15]、番茄（Solanumlyco persicum）[16]、草莓（Fragaria×ananassa）[17]、人參（Panax ginseng）[18]、煙草（Nicotiana tabacum）[19]、藍莓（Vaccinium spp.）[20]、浙貝母（Fritillaria thunbergii）[21]中均有報道。對于灰霉病菌的鑒定，一般基于形態(tài)特征并結(jié)合分子生物學(xué)鑒定來完成。形態(tài)特征一般從菌落形態(tài)、菌絲體、分生孢子及分生孢子梗等方面進行初步鑒定；分子生物技術(shù)鑒定應(yīng)用最為廣泛的是rDNA-ITS序列分析，如應(yīng)用rDNA-ITS序列分析對蝴 蝶 蘭（Phalaenopsis amabilis）[22]、香 蔥（Allium ascalonicum）[23]、煙草[24]、番茄[25]等灰霉病的鑒定。在真核生物基因組的編碼核糖體基因中有5SrDNA、5.8SrDNA、18SrDNA和28SrDNA這樣4種，其中18S、5.8S和28SrDNA基因組成一個轉(zhuǎn)錄單元，其中的間隔區(qū)為內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（internal transcribed spacer，ITS）,包括ITS1及ITS2兩部分[26]。ITS序列通過與GenBank數(shù)據(jù)庫進行BLAST檢索比對,序列相似性為95%～99%，可以鑒別為相同屬；序列相似性≥99%，可以鑒別為相同種[27]。隨著分子生物技術(shù)的發(fā)展，越來越多的基因被應(yīng)用于病原真菌的鑒定，如甘油醛-3-磷酸(Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，gpd)、組蛋白（Histone）、翻譯延伸因子1-α（Elongation factor，EF1-α）、微管蛋白(β-tubulin，BT1和BT2)、幾丁質(zhì)合成酶(chitin synthase，CHS)等[28-29]。

本研究從新林1號楊1年生扦插苗上分離獲得一種引起葉部病害的病原菌XL-1，結(jié)合病原菌菌落形態(tài)特征和rDNA-ITS序列分析對病原菌種屬地位進行了鑒定，其中與登陸號為MH212236.1的B.cinerea覆蓋度為100%，相似性為100%，系統(tǒng)發(fā)育分析與B.cinerea聚為一支，雖然未進行多基因聯(lián)合分析，從比對結(jié)果和系統(tǒng)發(fā)育分析可以確定分離病原菌為灰葡萄孢（B.cinerea）。該病原菌侵染楊樹葉片后可迅速蔓延，導(dǎo)致整個葉片發(fā)霉腐爛，嚴重影響楊樹的生長發(fā)育。下一步需要針對該病原菌的生物學(xué)特性、病原菌對不同楊樹品種的致病能力和致病機理以及防治方法等進行深入研究，提出楊樹灰霉病綜合防治方法，以減輕其對楊樹的危害。