TSHR-B亞基的結(jié)構(gòu)、功能及其與自身抗體TSBAb在自身免疫性甲狀腺疾病診治中應(yīng)用的研究進展▲

蘇鑫安 薛冀蘇 陳 慧

(1 蘭州大學第二醫(yī)院內(nèi)分泌代謝科，甘肅省蘭州市 730030； 2 深圳市寶安區(qū)人民醫(yī)院內(nèi)分泌代謝科，廣東省深圳市 518101)

【提要】 自身免疫性甲狀腺疾病(AITD)在臨床上比較常見，包括Graves病、橋本甲狀腺炎、產(chǎn)后甲狀腺炎等疾病。研究顯示，促甲狀腺激素受體(TSHR)通過與促甲狀腺激素受體抗體(TRAb)相結(jié)合來調(diào)控AITD的發(fā)生和發(fā)展。TSHR包含TSHR-A亞基和TSHR-B亞基，TRAb分為TSHR刺激性抗體(TSAb)和促甲狀腺激素(TSH)刺激阻斷性抗體(TSBAb)，TSAb通過與TSHR-A亞基結(jié)合，模擬TSH的作用，刺激甲狀腺濾泡細胞增生和功能增強，引起甲狀腺功能亢進；TSBAb通過與TSHR-B亞基結(jié)合，能抑制甲狀腺增生和甲狀腺激素的合成和分泌，導致甲狀腺功能減退和甲狀腺萎縮。目前，已有大量有關(guān)TSHR-A亞基及其自身抗體TSAb的研究，但鮮見有關(guān)TSHR-B亞基的研究。研究TSHR-B亞基及其自身抗體TSBAb對AITD的診治尤為重要，故本文就TSHR-B亞基的結(jié)構(gòu)、功能及其與自身抗體TSBAb在AITD診治中的應(yīng)用等研究進展進行綜述。

促甲狀腺激素受體(thyroid-stimulating hormone receptor,TSHR)存在于甲狀腺濾泡上皮細胞和其他多種細胞的質(zhì)膜上，是一種7次跨膜糖蛋白受體，屬于G蛋白偶聯(lián)受體[1]。TSHR能和促甲狀腺激素(thyroid-stimulating hormone,TSH)結(jié)合，是T淋巴細胞和自身免疫性甲狀腺疾病(autoimmune thyroid disease,AITD)TSHR抗體(TSHR antibody,TRAb)最常見的抗原靶點[2]。TSHR主要由TSHR-A亞基和TSHR-B亞基組成，兩個亞基通過C肽二硫鍵形成TSHR的二級結(jié)構(gòu)。TRAb是一組多克隆抗體，主要包括TSHR刺激性抗體(TSH receptor stimulating antibody,TSAb)和TSH刺激阻斷性抗體(TSH-stimulation blocking antibody,TSBAb)兩種類型。病理條件下，TSAb和TSBAb分別作用于TSHR上的A、B亞基，介導AITD的發(fā)生和發(fā)展。本文對TSHR-B亞基的結(jié)構(gòu)、功能及其與自身抗體TSBAb在AITD診治中的應(yīng)用等研究進展進行綜述，以期為探討AITD的發(fā)病機制、診斷、治療及評估預后提供參考依據(jù)。

1 TSHR-B亞基的結(jié)構(gòu)和功能

TSHR基因位于染色體14q31.1上，由10個外顯子和9個內(nèi)含子組成，TSHR-B亞基主要由TSHR基因第10號外顯子編碼。TSHR有764個氨基酸，B亞基的C末端位于TSHR的第764位氨基酸殘基，但對于B亞基的起始位點目前尚未達成共識，諸多研究者采用不同的劃分方法，得到的B亞基的相對分子質(zhì)量大小不一。目前最常見的劃分方法為B亞基的N末端起始于TSHR的第370位氨基酸殘基，相應(yīng)的B亞基的相對分子量約為45 000。其他較常見的劃分方法還有第310～764位氨基酸殘基、第367～764位氨基酸殘基、第380～764位氨基酸殘基，對應(yīng)的B亞基的相對分子量分別為52.6 000，45.3 000和42 000[3-4]。但迄今為止，TSHR-B亞基的大小及劃分規(guī)范仍未統(tǒng)一。B亞基是跨膜兼細胞內(nèi)的亞單位，主要包括一小段胞外域、跨膜結(jié)構(gòu)域和胞內(nèi)區(qū)(胞質(zhì)羧基端部分)，具有信息傳遞、維持自身三維結(jié)構(gòu)及生物活性等功能。

1.1 胞外域 B亞基的胞外域主要指TSHR的第370～418位氨基酸殘基，此片段含有潛在的磷酸化位點、C-激酶和G-蛋白偶聯(lián)受體激酶，負責接收TSH信號并將信號傳導至胞內(nèi)[5]。B亞基胞外域的第381～385位氨基酸殘基和A亞基上的第246～260位氨基酸殘基、第277～296位氨基酸殘折疊在一起，形成一個“結(jié)合口袋”以便與TSH結(jié)合[6]。其中，第385位氨基酸(酪氨酸)殘基和第390位氨基酸(半胱氨酸)殘基是與TSH結(jié)合的重要部分，它們對TSHR空間構(gòu)象發(fā)揮著決定作用[7]。TSHR翻譯后修飾導致部分A亞基及C肽從B亞基上脫落，使B亞基上硫酸化的酪氨酸殘基暴露在胞外，以便于TSH及TSBAb與TSHR結(jié)合[8]。B亞基的胞外域是它的免疫原性區(qū)段，也是AITD抗原決定簇所在的重要部位。研究表明，TSBAb在B亞基的結(jié)合靶點主要有第370～386位氨基酸殘基、第382～401位氨基酸殘基、第392～415位氨基酸殘基等，這些表位以散在不連續(xù)的方式分布，參與TSBAb與TSHR的結(jié)合[9]。

1.2 跨膜結(jié)構(gòu)域 B亞基的跨膜結(jié)構(gòu)域7次穿膜，呈蛇形，共有264個氨基酸殘基(第419～682位氨基酸殘基)，將胞外信號傳遞給G蛋白，包括7個跨膜螺旋(TM1～TM7)、3個胞外環(huán)(e1～e3)和3個胞內(nèi)環(huán)(i1～i3)；B亞基跨膜結(jié)構(gòu)域中存在鉸鏈區(qū)，這個部位對于TSHR與TSH的結(jié)合，以及TSHR激活后向細胞內(nèi)進行信號轉(zhuǎn)導起著非常重要的作用[10]。一般情況下TSHR處于非激活狀態(tài)，而它的激活依賴于受體內(nèi)抑制的解除，這種抑制作用除了與A亞基和B亞基細胞外環(huán)之間的靜電相互作用有關(guān)，還與B亞基跨膜部分的分子開關(guān)有關(guān)[11]。B亞基TM5中的第601位氨基酸殘基、TM6中的第633位氨基酸殘基、TM7中的第674位氨基酸殘基被認為是G 蛋白偶聯(lián)的分子開關(guān)[12]，它們協(xié)同影響TSHR的激活。當TSHR被激活后，胞內(nèi)環(huán)i2中的第525～530位氨基酸殘基參與Galphas/Galphaq雙重蛋白激活、i3中的第605～622位氨基酸殘基參與Galphaq介導的信號傳導[13]、i3中第652～656位氨基酸殘基的疏水簇通過影響G蛋白的活化，它們共同影響TSHR的分子內(nèi)信號轉(zhuǎn)導[14]，同時B亞基的3個胞外環(huán)負責維持TSHR的結(jié)構(gòu)和活性。

B亞基跨膜結(jié)構(gòu)域容易突變并使TSHR產(chǎn)生獨特的刺激性反應(yīng)，與AITD的發(fā)生密切相關(guān)[15]。如B亞基跨膜部分第486位氨基酸殘基/第568位氨基酸殘基/第656位氨基酸殘基三重突變，TSH信號傳導可增加70倍[16]；TM6中F631S處的突變可使激動型G蛋白介導的環(huán)磷酸腺苷(cyclic adenosine monophosphate,cAMP)途徑激活，促進甲狀腺激素的產(chǎn)生和甲狀腺生長[17]；胞內(nèi)環(huán)i3中第617～620位氨基酸殘基的突變可導致功能性甲狀腺腺瘤[18]。開展針對這些區(qū)域基因突變的研究可協(xié)助探索相關(guān)B亞基跨膜片段的功能。

1.3 胞內(nèi)區(qū) B亞基胞內(nèi)區(qū)有82個氨基酸殘基(第683～764位氨基酸殘基)，并有一個C端和C激酶磷酸化位點與G蛋白偶聯(lián)，負責將胞外信號傳遞到胞內(nèi)而產(chǎn)生效應(yīng)，對TSHR的信號傳導活動至關(guān)重要[19]。有研究報告，B亞基胞內(nèi)區(qū)尾段第691位氨基酸殘基有助于保持TSHR 在激動型Gα蛋白/cAMP 通路中的非激活狀態(tài)，而且在Gαq/11蛋白/磷酸肌醇級聯(lián)中亦起關(guān)鍵作用[20]。B亞基第684～692位氨基酸殘基及其相鄰的胞內(nèi)區(qū)域在激動劑誘導的磷酸肌醇信號傳導中也有重要作用[21]。

2 TSHR-B亞基與其自身抗體TSBAb

TSHR是導致AITD發(fā)生和發(fā)展的最主要自身抗原之一，其中A、B亞基發(fā)揮著最主要的致病作用[22]。TSHR產(chǎn)生的自身抗體稱為TRAb，主要分為TSAb和TSBAb。TSAb與TSHR氨基端的A亞基結(jié)合形成復合體，激活腺苷酸環(huán)化酶-CAMP通路系統(tǒng)，導致甲狀腺功能亢進及甲狀腺細胞增生；A亞基可從跨膜的B亞基上脫落，在病理條件下暴露的B亞基可誘導TSBAb的產(chǎn)生[8]，TSBAb與TSHR羧基端的B亞基結(jié)合后，通過競爭性結(jié)合影響TSH與TSHR的結(jié)合，阻斷TSHR的信號傳導進而產(chǎn)生抑制效應(yīng)，從而抑制甲狀腺激素的分泌，導致甲狀腺功能減退(簡稱甲減)和甲狀腺細胞萎縮[23]。

研究表明，TSBAb通過與TSHR-B亞基相結(jié)合，與AITD的發(fā)生有關(guān)[24]。據(jù)統(tǒng)計，約10%的AITD患者為TSBAb陽性[25]，其中多數(shù)為甲減相關(guān)的AITD，如橋本甲狀腺炎、萎縮性甲狀腺炎、黏液性水腫等[26-28]，隨著體內(nèi)TSBAb水平的降低，患者甲減癥狀逐漸恢復。TSBAb還可出現(xiàn)在Graves病患者中，Graves病患者在接受抗甲狀腺藥物治療期間或治療后均可檢測到較高的TSBAb[29]。還有學者通過CT掃描發(fā)現(xiàn)，TSBAb水平與Graves眼病癥狀呈強負相關(guān)性[30]。此外，有研究顯示隨著TSBAb水平的降低，TSBAb陽性的甲減患者可發(fā)展為甲亢[31]，是自身免疫性甲減向甲亢自發(fā)性轉(zhuǎn)化可能的影響因素?？梢奣SBAb與AITD的發(fā)生密切相關(guān)，并且這種相關(guān)是通過其與TSHR-B亞基相互作用引起的，因此開展有關(guān)TSHR-B亞基及其自身抗體TSBAb的相關(guān)研究具有重要臨床意義。

3 TSHR-B亞基及其自身抗體TSBAb在AITD中應(yīng)用的前景分析

3.1 TSBAb應(yīng)用于診斷及評估AITD的價值 大量研究表明，TSBAb有助于AITD的診斷和病情評估，是一種鑒別可逆性甲減的指標。例如，Wallaschofski等[32]發(fā)現(xiàn)采用TSBAb進行篩檢，可早期發(fā)現(xiàn)TRAb相關(guān)性AITD患者及新生兒甲減，及時進行早期治療可取得最大的臨床治療效果。然而，目前國內(nèi)外對TSBAb的檢測方法均有一定的局限性，如放射受體分析法只能檢測TRAb總和，不能區(qū)分TSAb和TSBAb；化學發(fā)光法檢測TSBAb操作步驟煩瑣，流程長且價格昂貴，目前多用于科研，在臨床上難以應(yīng)用推廣。近年來，眾多研究者基于TSHR-B亞基蛋白制備的酶聯(lián)免疫分析法檢測試劑盒為TSBAb的檢測提供了新的方法，如李寧[33]通過在原核系統(tǒng)表達截短的B亞基片段開發(fā)出以檢測人血清TSBAb為主的TRAb/TSBAb-CLEIA試劑盒，提高了血清TSBAb檢測的敏感性及特異性；周靜[34]以TrxTSHRn(B亞基片段)蛋白為抗原建立的TSBAb檢測方法，對橋本甲狀腺炎伴甲減的診斷具有重要意義。這些基于TSHR-B亞基制備的酶聯(lián)免疫分析法檢測試劑盒提高了臨床上檢測TSBAb的準確性，且不需要額外的特殊儀器，未來可為AITD的臨床診斷及治療提供幫助。

3.2 TSHR-B亞基應(yīng)用于自身免疫性甲減動物模型的制備 國內(nèi)外關(guān)于自身免疫性甲減的動物模型研究較少，目前改模型的構(gòu)建方法有脾細胞體外活化移植免疫法、自發(fā)性甲狀腺炎模型法、基因工程小鼠模型法及外源性甲狀腺抗原免疫法等[35]。脾細胞體外活化法是將實驗小鼠的脾細胞在體外培養(yǎng)，使用特定的異源信號肽免疫后再次注射入同源受體小鼠體內(nèi)，使之發(fā)生自身免疫性甲減，此法可加重甲狀腺淋巴細胞的浸潤，并且會引起肉芽腫性改變，主要用于研究肉芽腫性甲狀腺炎。自發(fā)性甲狀腺炎模型法主要使用具有自身免疫傾向的NOD.H-2h4小鼠和OS雞[36]，這些實驗動物可自發(fā)性形成遺傳性自身免疫性甲減，成功率較高，但這些實驗動物需在無特定病原體清潔等級下喂養(yǎng)，成本較高且疾病周期較長。基因工程小鼠模型主要通過基因重組技術(shù)獲得，此法成本高，效率低且重復性差，目前其使用價值仍在研究探索中。外源性甲狀腺抗原免疫法是一種較為成熟的造模方法，相對于其他方法具有操作較容易、造模周期短、實驗經(jīng)費較低等優(yōu)點。眾多研究者將TSHR-A亞基蛋白通過質(zhì)粒、腺病毒等載體注入小鼠體內(nèi)成功誘發(fā)了Graves動物模型[37-38]。岳瑞宏[39]則使用TSHR胞外段羧基端蛋白(B亞基片段)免疫Balb/c小鼠，誘發(fā)類似于自身免疫性甲減的激素改變及甲狀腺組織病理改變，這為建立自身免疫性甲減動物模型提供了新的思路。此法不僅簡便可行、重復性高，并且能模擬自身免疫性甲減的發(fā)生及發(fā)展，適用于觀察甲狀腺細胞的病理及結(jié)構(gòu)變化。

3.3 TSBAb單克隆抗體的制備 人工獲得的TSHR-B亞基蛋白可協(xié)助動物源性TSBAb單克隆抗體的制備，對AITD的預防及治療意義重大。目前，TSBAb單克隆抗體主要包括5C9、K1-70、RSR-B2、Tab-8、7G10等[40]，其中5C9、K1-70為人源性單克隆抗體，RSR-B2、Tab-8、7G10為動物源性單克隆抗體。人源性單克隆抗體是直接分離人類體內(nèi)B淋巴細胞，通過雜交瘤技術(shù)制備而得；動物源性TSBAb單克隆抗體通過將人工獲得的TSHR-B亞基蛋白注入動物體內(nèi)的方法獲取。相對人源性單克隆抗體，動物源性單克隆抗體的制備操作較簡單，實驗周期短，經(jīng)費較低，易于實現(xiàn)，可用于初期實驗。通過TSHR-B亞基蛋白獲得的TSBAb單克隆抗體，除可用于研究TSBAb與TSHR結(jié)合的分子生物學機制外，還可用于TSBAb檢測手段的研發(fā)及探索AITD的發(fā)病機制及其診斷治療。

3.4 TSBAb檢測對于妊娠期婦女及新生兒的意義 當妊娠期婦女合并自身免疫性甲減時，其體內(nèi)TSBAb常為陽性，并可通過胎盤影響胎兒體內(nèi)甲狀腺激素平衡，導致新生兒甲減[41]。對妊娠合并自身免疫性甲減的婦女進行TSBAb檢測，可以評估新生兒的甲狀腺功能，并且對新生兒是否會患有暫時性甲減具有重要的預測意義。最新研究表明，妊娠期Graves病患者的TSAb水平總體呈下降趨勢，而TSBAb水平呈升高趨勢，妊娠期TSBAb水平的增加可能有助于妊娠期甲亢的緩解[42]。在妊娠期婦女中開展對上述現(xiàn)象的研究，有助于探索免疫療法以實現(xiàn)AITD的病情緩解及新生兒甲減的預防。

4 小 結(jié)

AITD的主要病因之一是TRAb升高，其中TSBAb可以通過與TSHR-B亞基相互作用介導甲減相關(guān)的AITD的發(fā)生與發(fā)展。開展有關(guān)TSHR-B亞基的結(jié)構(gòu)和功能、B亞基與TSBAb的關(guān)系及其應(yīng)用的研究，對深入探討AITD的診斷、治療、預后評估及發(fā)病機制具有重要意義，有望為建立新的AITD診斷和治療模式提供參考依據(jù)。