鐵皮石斛種質(zhì)資源與遺傳改良研究進(jìn)展

劉羽佳，陳堰珊，理 雅，3，徐煒俊，劉博婷，于白音

（1. 韶關(guān)學(xué)院 廣東省粵北食藥資源利用與保護(hù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 韶關(guān) 512005；2.韶關(guān)學(xué)院 英東生物與農(nóng)業(yè)學(xué)院，廣東 韶關(guān) 512005； 3.河南農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，河南 鄭州 450046）

鐵皮石斛（Dendrobium officinaleKimura et Migo）是蘭科石斛屬多年附生草本植物，主要分布于中國熱帶和亞熱帶地區(qū)，在海拔800~1 500 m的懸崖或富含腐殖質(zhì)和苔蘚的樹干上常年生長. 在鐵皮石斛的莖和葉中共檢測到649種不同的物質(zhì)，其中以有機(jī)酸、氨基酸及其衍生物、核苷酸及其衍生物和黃酮類化合物為主，因此被譽(yù)為“中華九大仙草之首”［1］. 鐵皮石斛干燥莖為中國藥典歷版收載的珍貴中藥材，具有養(yǎng)陰生津、補(bǔ)脾益胃之功效，早在1987年鐵皮石斛就作為瀕危物種被《國家重點(diǎn)保護(hù)野生藥材物種名錄》收錄［2］. 研究表明，鐵皮石斛對(duì)腸胃病、心血管疾病、糖尿病、腫瘤、白內(nèi)障等均有顯效［3-5］.

近年來，受氣候改變、生境破壞及過度采挖等影響，加之培育者對(duì)選育和改良品種缺乏理論依據(jù)，存在盲目引種、缺乏技術(shù)管理體系與質(zhì)量安全保障等問題，嚴(yán)重影響了鐵皮石斛種質(zhì)馴化、良種選育、規(guī)范化栽培、安全使用以及產(chǎn)業(yè)的快速發(fā)展［6-7］. 筆者主要對(duì)鐵皮石斛種質(zhì)資源與遺傳改良方面進(jìn)行了歸納，并指出了鐵皮石斛資源保護(hù)與利用、良種選育和種質(zhì)創(chuàng)新等方面是未來的重點(diǎn)研究方向，以期為鐵皮石斛野生資源的保護(hù)、開發(fā)與可持續(xù)利用及其產(chǎn)業(yè)的長期穩(wěn)定發(fā)展提供借鑒和研究思路.

1 鐵皮石斛種質(zhì)資源概況

1.1 鐵皮石斛重要農(nóng)藝性狀遺傳多樣性研究

鐵皮石斛種質(zhì)的遺傳多樣性主要體現(xiàn)在莖長度、莖粗細(xì)、莖形、莖節(jié)數(shù)、節(jié)距、莖稈色、葉形、葉面積、葉色等農(nóng)藝性狀上，其中莖形、節(jié)距、葉形和葉色為影響植株表型性狀的4個(gè)主因子，對(duì)其居群分類與鑒別起關(guān)鍵作用；同時(shí)研究發(fā)現(xiàn)莖長度是其表型性狀差異中數(shù)值最高的，因此莖長度可作為鐵皮石斛品質(zhì)篩選與良種選育的重要指標(biāo)［8-9］.

鐵皮石斛根據(jù)其生長形態(tài)分為直立、斜立和斜臥生長3種類型，也可根據(jù)不同植株表觀形態(tài)和解剖結(jié)構(gòu)分為F型“軟腳”和H型“硬腳”2種類型，與H型相比，F(xiàn)型莖長度相對(duì)較短且質(zhì)地柔軟，具有較多糖類黏液，表皮細(xì)胞較薄且角質(zhì)含蠟質(zhì)豐富，外側(cè)纖維群細(xì)胞較少，一般不具備下皮層組織，因此是加工鐵皮楓斗的優(yōu)質(zhì)來源［10］. PCR序列檢測顯示，F(xiàn)型和H型分別在其ITS區(qū)第168個(gè)堿基位點(diǎn)和5.8 S區(qū)第4個(gè)堿基位點(diǎn)上存在顯著差異，表明遺傳差異是決定鐵皮石斛表型性狀的直接因素［11］. 另外，不同地域鐵皮石斛莖稈色具有顯著差異，浙江和福建以淡青色為主，云南和貴州以淡紫色為主，且不同地域其莖長度亦差異較大，表明種植環(huán)境和地理位置不同是造成鐵皮石斛農(nóng)藝性狀表型差異的主要因素［9，12］. 不同居群鐵皮石斛葉面積和數(shù)目存在較大差異，葉面積直接影響作物生長發(fā)育與開花結(jié)果，單片葉面積與葉長寬積之間呈顯著線性關(guān)系，而葉片數(shù)與莖葉總面積呈冪函數(shù)關(guān)系，因此，可以利用F1代葉片數(shù)估計(jì)莖總?cè)~面積，從而估計(jì)完整植株的葉面積，為科學(xué)篩選雜交植株提供依據(jù)和節(jié)省時(shí)間［13］. 此外，利用高通量表型成像技術(shù)，對(duì)鐵皮石斛進(jìn)行多形態(tài)指標(biāo)如植株高度、水平幅寬、緊密度、投影面積和含水量等檢測［14］，可以減少人為測量和主觀判斷帶來的誤差，以輔助篩選具有優(yōu)質(zhì)性狀且適宜人工栽培的鐵皮石斛優(yōu)良品種. 由此可見，農(nóng)藝性狀表型差異可作為鐵皮石斛種質(zhì)分類、資源鑒定和良種選育的重要依據(jù).

譚嘉娜等發(fā)現(xiàn)隨著鐵皮石斛植齡的增長，其莖長度、鮮葉重與分蘗數(shù)增加，莖長度、莖粗細(xì)和鮮葉重均與產(chǎn)量呈極顯著正相關(guān)，分蘗數(shù)與產(chǎn)量呈顯著正相關(guān)，但莖長度與鮮葉重沒有明顯相關(guān)性［15］，換言之，可以通過增加莖長度和莖粗細(xì)，提高鮮葉重與分蘗數(shù)，達(dá)到提高產(chǎn)量的目的. 另外，栽培環(huán)境對(duì)鐵皮石斛生長發(fā)育和代謝物積累具有較大影響［16］，與設(shè)施盆栽相比，巖壁附生和梨樹附生的鐵皮石斛植株粗壯矮小，莖稈逐漸變?yōu)樽霞t色且根系發(fā)達(dá)，葉片稀疏、變厚，氣孔變小而加密，但生物量較低［17］；巖壁附生的鐵皮石斛多糖和醇溶性浸出物成分含量最高（且其醇溶性物質(zhì)的化學(xué)成分最為復(fù)雜），梨樹附生其次，設(shè)施盆栽居末［18］；鐵皮石斛種質(zhì)、種植方式、年限、產(chǎn)地以及形態(tài)特征均對(duì)鐵皮石斛總生物堿含量有顯著影響［19］.

1.2 鐵皮石斛種質(zhì)資源分子聚類分析

近年來，由于不同種源鐵皮石斛在不同產(chǎn)地的混亂引種，致使鐵皮石斛種質(zhì)來源日漸模糊，利用分子標(biāo)記技術(shù)進(jìn)行聚類分析，能夠較準(zhǔn)確地獲得鐵皮石斛種內(nèi)和種間親緣關(guān)系及其遺傳多樣性信息. SSR多態(tài)性聚類分析顯示，紅褐色莖稈與綠色莖稈的鐵皮石斛分別聚在相對(duì)獨(dú)立的亞組［20］，這一結(jié)論與SRAP標(biāo)記聚類分析結(jié)果一致，推測莖稈色與鐵皮石斛的親緣關(guān)系存在密切聯(lián)系［21］. 然而，僅依靠單一農(nóng)藝性狀的差異或單一技術(shù)的聚類分析，難以對(duì)不同來源鐵皮石斛進(jìn)行準(zhǔn)確區(qū)分［22］，必須采用多種分子標(biāo)記技術(shù)相結(jié)合的方法來進(jìn)行聚類分析，才能提高鐵皮石斛種源間遺傳多樣性和親緣關(guān)系分析的可靠性［23］.

鐵皮石斛基因組內(nèi)含有大量多態(tài)性較高的簡單重復(fù)序列，使其自然種群具有相當(dāng)豐富的遺傳多樣性［24］. 研究發(fā)現(xiàn)，我國鐵皮石斛主要分布于浙江、江西、福建、云南、廣東等南方地區(qū)，而不同地域分布的鐵皮石斛種質(zhì)間是否存在親緣關(guān)系的相關(guān)性，得出的結(jié)果并不一致. 苑鶴等利用RAPD標(biāo)記對(duì)14個(gè)居群的鐵皮石斛進(jìn)行聚類分析，結(jié)果表明鐵皮石斛種質(zhì)的親緣關(guān)系遠(yuǎn)近與其地理種源具有顯著相關(guān)性，與栽培地點(diǎn)無關(guān)［25］，利用RAMP和SSR標(biāo)記對(duì)不同種源地鐵皮石斛親緣關(guān)系的多態(tài)性聚類分析也證實(shí)了這一結(jié)論［26-27］，而且隨著方法的改進(jìn)與人工栽培鐵皮石斛范圍的不斷擴(kuò)大，鐵皮石斛的區(qū)域差異性有所減弱［28］；徐蕾等利用SSR標(biāo)記進(jìn)行遺傳多樣性聚類分析，結(jié)果顯示位于同一居群的鐵皮石斛來源地卻不同，而遺傳相似系數(shù)較大的同源鐵皮石斛卻被分配在不同居群，推測鐵皮石斛親緣關(guān)系與來源地缺少相關(guān)性［29］；Ding等通過ISS與RAPD標(biāo)記技術(shù)分析了廣東、廣西、浙江等7省共9個(gè)鐵皮石斛居群，發(fā)現(xiàn)居群內(nèi)遺傳多樣性高達(dá)78%，同樣暗示鐵皮石斛居群間親緣關(guān)系與地域分布缺乏直接相關(guān)聯(lián)系［30］；此外，對(duì)比野生與人工栽培的鐵皮石斛的遺傳多樣性，顯示野生與人工栽培的鐵皮石斛存在較遠(yuǎn)的親緣關(guān)系，這可能意味著野生鐵皮石斛的遺傳多樣性更為豐富，且群內(nèi)的變異系數(shù)遠(yuǎn)大于群間變異系數(shù)［31］. 由此可見，野生鐵皮石斛居群發(fā)生了嚴(yán)重遺傳漂變，與過度采挖與源生地環(huán)境惡劣高度相關(guān)，因此迫切需要保護(hù).

2 鐵皮石斛遺傳改良研究現(xiàn)狀

2.1 雜交育種在鐵皮石斛遺傳改良中的應(yīng)用

對(duì)具有親本優(yōu)良性狀的植株加以人工培育以獲得遺傳相對(duì)穩(wěn)定的新品種，是目前鐵皮石斛育種最主要方法，可以有針對(duì)性地開發(fā)鐵皮石斛新品種. 研究發(fā)現(xiàn)，鐵皮石斛全同胞F1代家系的農(nóng)藝性狀相對(duì)穩(wěn)定（半同胞的變異率較高），可以利用來獲得穩(wěn)定且遺傳性狀優(yōu)質(zhì)的家系植株［32］；人工異株授粉試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，雜交育種技術(shù)可以將鐵皮石斛的結(jié)實(shí)率由自然授粉的2%顯著提高至36%［33］. 雜交育種也是提高鐵皮石斛多糖含量的有效手段. 章曉玲發(fā)現(xiàn)，同一環(huán)境不同種源的鐵皮石斛，其多糖含量和醇溶性浸出物種類差異顯著，多糖含量低的可借助含量高的遺傳優(yōu)勢，通過親本雜交顯著提高子代多糖含量，表現(xiàn)出雜種優(yōu)勢［34］；同樣地，F(xiàn)1代雜交鐵皮石斛產(chǎn)量和主要農(nóng)藝性狀的雜種優(yōu)勢也明顯，與表型因子相關(guān)的莖粗細(xì)、葉片數(shù)、葉長寬等量化指標(biāo)與產(chǎn)量均顯著相關(guān)［35］. 因此，結(jié)合對(duì)產(chǎn)量顯著相關(guān)的農(nóng)藝性狀相關(guān)量化指標(biāo)的監(jiān)測［13］，可以在早期提高鐵皮石斛雜交植株品種選擇的效率.

2.2 誘變育種在鐵皮石斛遺傳改良中的應(yīng)用

目前多采用物理射線和化學(xué)誘變劑等進(jìn)行鐵皮石斛誘變育種. 其中，137Cs γ射線誘變育種的鐵皮石斛表型性狀會(huì)明顯改變：發(fā)育不良、葉片缺綠、老化提前、產(chǎn)生非整數(shù)倍植株但多糖含量變化不大［36］，隨著輻射劑量增加突變率上升、存活率下降，證實(shí)誘變育種存在突變方向不受控、有用突變頻率低等［37］；人工模擬UV-B輻射誘變的鐵皮石斛葉片焦黃、掉葉，多糖、黃酮、生物堿等含量增加，但來源不同的植株表現(xiàn)多樣［38］. 空間誘變技術(shù)也是鐵皮石斛育種的有效方法，徐靖等利用太空強(qiáng)輻射、高真空等特殊環(huán)境，將雜交的F1代鐵皮石斛蒴果進(jìn)行航天搭載，獲得了適應(yīng)性強(qiáng)、抗逆性好、產(chǎn)量高的新品種“仙斛3號(hào)”［39］. 常用化學(xué)誘變劑秋水仙素（也可用烷化劑或核酸堿基類似物）能將鐵皮石斛誘變?yōu)槎啾扼w，使得代謝加快、抗逆性強(qiáng)、產(chǎn)量增益［40-41］，但鐵皮石斛不同組織器官對(duì)秋水仙堿的耐受不同［42］.另外，鐵皮石斛多倍化不僅可以改變植株形態(tài)，也可增加植株多糖含量［43］：吳睿發(fā)現(xiàn)鐵皮石斛四倍體多糖含量比二倍體增加了30.34%，多糖合成相關(guān)基因相對(duì)表達(dá)量均呈上調(diào)變化，其中PEPC顯著上調(diào)［44］. 因此對(duì)以多糖為主要藥用成分的鐵皮石斛而言，加大誘變多倍化對(duì)多糖、生物堿等的影響研究，對(duì)鐵皮石斛優(yōu)質(zhì)品種選育意義重大.

2.3 基因工程技術(shù)在鐵皮石斛遺傳改良中的應(yīng)用

雜交育種是轉(zhuǎn)移篩選后親本的基因鏈，而基因工程育種則是直接轉(zhuǎn)移基因片段并在植物體內(nèi)有效表達(dá)出相應(yīng)產(chǎn)物，可以精確對(duì)植株進(jìn)行基因改良［45］. Zhang等成功完成了鐵皮石斛全基因組測序和全基因組基因圖譜繪制，為鐵皮石斛分子水平分析、基因功能鑒定和生理生化效應(yīng)研究奠定了基礎(chǔ)［46］.

目前應(yīng)用于鐵皮石斛基因工程育種的方法主要以農(nóng)桿菌介導(dǎo)法、基因槍法和花粉管通道法為主，并都以研究適宜轉(zhuǎn)化條件來提高轉(zhuǎn)化率為關(guān)鍵［47］. 如崔波等建立了鐵皮石斛原球莖的農(nóng)桿菌介導(dǎo)法遺傳轉(zhuǎn)化體系，為鐵皮石斛新品種的開發(fā)奠定了良好的基礎(chǔ)［48］；張振華等利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法成功將建蘭花葉病毒外殼蛋白表達(dá)載體導(dǎo)入石斛類球莖，育成抗病毒石斛新品種解決了建蘭花葉病毒對(duì)石斛植株造成的葉片發(fā)育不良、開花不正常等問題［49］；武榮花等利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將1-氨基環(huán)丙烷-1-羧酸氧化酶反義基因?qū)腓F皮石斛原球莖，獲得的新植株可減少乙烯合成、抑制開花進(jìn)而提高鐵皮石斛品質(zhì)［50］；基因槍轉(zhuǎn)化技術(shù)能夠?qū)⒋篼溈购的望}基因嵌入鐵皮石斛植株基因組中，使耐鹽性增強(qiáng)、育種效率提高、育種周期縮短［51］；冼康華等利用花粉管通道法將綠色熒光蛋白基因（GFP）和β-葡萄糖苷酸酶基因（GUS）轉(zhuǎn)入鐵皮石斛基因組中，在成熟的轉(zhuǎn)化種子中檢測到GFP和GUS基因表達(dá)信號(hào)［52］.

由此可見，基因工程育種對(duì)鐵皮石斛遺傳改良具有轉(zhuǎn)化效率高、遺傳穩(wěn)定性好、可轉(zhuǎn)化較大基因片段的優(yōu)勢，可培育優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)、抗逆性強(qiáng)的藥用優(yōu)良品種，不再受育種周期長、結(jié)果不可測等因素的限制.

2.4 分子標(biāo)記技術(shù)在鐵皮石斛遺傳改良中的應(yīng)用

利用分子標(biāo)記技術(shù)與分子設(shè)計(jì)育種能提高鐵皮石斛品種鑒別［53］和親緣關(guān)系分析的準(zhǔn)確性［54］. 研究發(fā)現(xiàn)，石斛屬葉綠體DNA中LSC區(qū)的psbK-psbI序列在不同石斛種間均存在差異，可作為石斛屬鑒別的內(nèi)參基因［55］. 徐慧君用RT-PCR結(jié)合ARMS方法對(duì)鐵皮石斛和其他石斛的楓斗進(jìn)行區(qū)分，能有效減弱石斛多糖含量高對(duì)DNA多態(tài)性條帶擴(kuò)增的干擾［56］. 同時(shí)，應(yīng)用分子標(biāo)記技術(shù)可對(duì)不同來源鐵皮石斛進(jìn)行遺傳多樣性和親緣關(guān)系分析. 曹奕鴦等研究發(fā)現(xiàn)，與其它石斛屬植物相比，福建泰寧野生鐵皮石斛葉綠體DNA rps 16序列變異較大，多樣性較高，其中T2型、T65型、D5型是泰寧野生鐵皮石斛獨(dú)有的DNA rps序列，推斷泰寧是福建與周邊野生石斛發(fā)源地之一［57］.

由于種質(zhì)豐富的遺傳多樣性、人工種植工序繁瑣極可能產(chǎn)生種質(zhì)混雜，加之忽視選育，鐵皮石斛已產(chǎn)生了多種遺傳變異類型，容易導(dǎo)致栽培整齊度差、產(chǎn)量低、品質(zhì)不穩(wěn)定［58］. 因此，今后鐵皮石斛選育應(yīng)考慮但不限于以下方面：一是完善人工栽培大幅提高種質(zhì)純度；二是多利用ISSR、TRAP、SSR等分子標(biāo)記技術(shù)來區(qū)分野生還是人工品種［27，59］，并準(zhǔn)確鑒別品種來源地區(qū)［24，60］.

3 研究展望

近年來，野生鐵皮石斛的種質(zhì)資源日漸減少、種質(zhì)來源日漸模糊、中藥臨床療效減退、用藥安全堪憂. 那么，采取何種措施才能有效保護(hù)鐵皮石斛種質(zhì)資源，實(shí)現(xiàn)該產(chǎn)業(yè)的快速發(fā)展呢？目前已有研究多是從種質(zhì)資源的某一或兩個(gè)方面進(jìn)行剖析，實(shí)際上種質(zhì)資源的保護(hù)與利用必然是辯證統(tǒng)一、相互依存、協(xié)同發(fā)展的，因此，有關(guān)鐵皮石斛的種質(zhì)資源收集、質(zhì)量評(píng)價(jià)體系、栽培技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)等方面的規(guī)范化管理策略構(gòu)建，以及重要性狀精準(zhǔn)鑒定技術(shù)和優(yōu)良種質(zhì)發(fā)掘利用等的研究亟待加強(qiáng)，挖掘多種分子標(biāo)記技術(shù)協(xié)同優(yōu)化的聚類分析方法更需系統(tǒng)深入研究. 目前鐵皮石斛種質(zhì)選育多為傳統(tǒng)的選擇育種和雜交育種，而以基因工程技術(shù)和分子標(biāo)記技術(shù)為核心的生物育種技術(shù)已逐步得到應(yīng)用；隨著鐵皮石斛全基因組基因圖譜繪制完成，生物育種（包括轉(zhuǎn)基因育種、分子標(biāo)記育種、分子設(shè)計(jì)育種等）技術(shù)能提高育種的精確性、高效性、可控性和預(yù)見性，并已為加快蘭科植物的發(fā)育速度和種質(zhì)的快速識(shí)別與鑒定提供了可能性［7，61］. 因此，鐵皮石斛的資源利用和種質(zhì)創(chuàng)新需加強(qiáng)基因功能方面研究，并從分子水平闡明功能基因的表達(dá)模式及其生長調(diào)控機(jī)制. 此外，代謝組學(xué)研究表明，鐵皮石斛莖和葉上的代謝物質(zhì)相似，且葉片含有較高水平脂質(zhì)含量［62］，可對(duì)葉片和花朵進(jìn)行開發(fā)利用與安全性評(píng)價(jià)研究，充分挖掘鐵皮石斛各器官的藥用功效.

建議在鐵皮石斛種質(zhì)資源保護(hù)與生物育種實(shí)踐方面，今后需加大以下幾方面的研究：（1）根據(jù)不同種源地野生鐵皮石斛所處的生態(tài)環(huán)境，按其生物特性、環(huán)境適應(yīng)性與生境破壞程度對(duì)種質(zhì)進(jìn)行就地保護(hù)、遷地保護(hù)或發(fā)展人工栽培技術(shù)；（2）盡可能收集來自不同種源地鐵皮石斛資源，建立本地基地，加強(qiáng)對(duì)野生鐵皮石斛的馴化，建立種質(zhì)信息管理系統(tǒng)，共享鐵皮石斛種質(zhì)資源；（3）提高鐵皮石斛種植業(yè)的培育技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)，選育適合本地栽培的優(yōu)良品種，保證鐵皮石斛的藥用品質(zhì)與種植效益；（4）加速推進(jìn)鐵皮石斛功能基因研究，揭示種間與種內(nèi)遺傳物質(zhì)的流向，構(gòu)建遺傳連鎖圖譜，為優(yōu)良新種的選育奠定堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ).