金松酸對(duì)HepG2細(xì)胞中甘油三酯蓄積的影響

溫思思，陸元超，丁 玨，余寧翔，聶小華，孟祥河

(浙江工業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，杭州 310014)

肥胖已成為中國亟需重視的大眾健康問題，2015年至2019年期間，17歲以下青少年肥胖率為11.5%，成人肥胖率為16.4%[1]。肥胖通常是由于能量的攝入、消耗以及儲(chǔ)存之間的不平衡造成的。節(jié)食、藥物甚至手術(shù)是常見的減肥方式，但這些方法都有一定的弊端，比如節(jié)食難以長期堅(jiān)持并可能導(dǎo)致認(rèn)知功能損傷、藥物通常副作用明顯、手術(shù)則風(fēng)險(xiǎn)性較高[2]。因此，開發(fā)有效的減肥食品具有明顯的安全優(yōu)勢。香榧是我國藥食同源的食物[3]，據(jù)報(bào)道香榧油具有一定降脂功效[4]，有可能滿足減肥食品開發(fā)的需求。

香榧(T.grandis)是一種常綠樹種，主要分布于中國亞熱帶丘陵地區(qū)，例如浙江、福建、安徽等地[5]，其種子作為名貴堅(jiān)果在中國已有近千年食用歷史。然而，目前香榧仍以休閑堅(jiān)果形式食用為主，深加工產(chǎn)品極其缺乏，嚴(yán)重制約了香榧產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。香榧仁油脂豐富，質(zhì)量分?jǐn)?shù)在40%～65%[6]，且富含維生素E、角鯊烯等天然生物活性物質(zhì)，具有抗炎[7]、抗腫瘤[8]等諸多生理作用。香榧油中，尤其值得關(guān)注的是獨(dú)特的Δ5多亞甲基間隔不飽和脂肪酸，金松酸(SA)[9]。Endo等[10]給大鼠分別飼喂等量含有10%香榧油(含有10.93% SA)、玉米油和大豆油的飼料，發(fā)現(xiàn)香榧油組大鼠血漿和肝臟中甘油三酯(TG)含量最低，比玉米油組低37.14%和53.33%。隨后該實(shí)驗(yàn)組給大鼠分別投喂等量含有不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)SA(0、5%、10%)的玉米油的飼料(其中玉米油占飼料的10%)；結(jié)果發(fā)現(xiàn)，10% SA組大鼠血漿和肝臟中TG含量分別比空白組低27.27%和52.94%[11]，但SA具體降脂機(jī)制沒有涉及。SA對(duì)TG代謝(脂類合成、分解途徑)的影響也不清楚。

脂質(zhì)代謝研究中常用的細(xì)胞模型有大鼠BRL肝細(xì)胞、人L02肝細(xì)胞和人HepG2肝癌細(xì)胞。BRL肝細(xì)胞經(jīng)脂肪酸誘導(dǎo)后TG升高不明顯；L02肝細(xì)胞通過脂肪酸誘導(dǎo)的高脂模型接近于臨床的肝細(xì)胞脂肪變性狀態(tài)。而HepG2肝癌細(xì)胞雖然為癌癥細(xì)胞，但其擁有與正常肝細(xì)胞一樣的糖、脂代謝功能，最大的優(yōu)點(diǎn)是狀態(tài)穩(wěn)定、易培養(yǎng)，且用油酸進(jìn)行誘導(dǎo)后，細(xì)胞內(nèi)油脂積累明顯，容易形成脂滴，利于降脂實(shí)驗(yàn)的表觀觀察。所以，本研究選擇該細(xì)胞作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象。

鑒于前人的研究結(jié)果及SA Δ5多亞甲基間隔的特殊結(jié)構(gòu)[12]，假設(shè)SA攝入后可能會(huì)影響脂肪酸合成、脂肪酸氧化以及TG代謝相關(guān)基因的表達(dá)，從而間接影響TG的蓄積。研究表明OA能夠顯著上調(diào)脂質(zhì)合成代謝、抑制分解代謝[13]。因此本研究以油酸(Oleic acid，OA)為“陽性”對(duì)照，采用HepG2細(xì)胞模型，探討不同SA替代量對(duì)TG蓄積的影響，并結(jié)合RT-qPCR技術(shù)分析SA對(duì)TG代謝關(guān)鍵基因表達(dá)的調(diào)節(jié)作用，以解明SA對(duì)TG蓄積的影響，為今后以SA為功能因子的健康食品開發(fā)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

HepG2細(xì)胞，購自中國培養(yǎng)物保藏中心。

DMEM培養(yǎng)基、磷酸緩沖鹽溶液、胎牛血清、二甲基亞砜、噻唑藍(lán)、胰酶消化液、雙抗(含100 U/mL青霉素和100 mg/mL鏈霉素)、油紅O干粉、TG濃度測定試劑盒。其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

CKX41倒置顯微鏡，ACB-4A1超凈工作臺(tái)，QB-9001臺(tái)式振蕩器，TDL-60B/16B離心機(jī)，MDF-U32V超低溫冰箱，Power Wave XS酶標(biāo)儀，3111二氧化碳培養(yǎng)箱。

1.3 方法

1.3.1 香榧油以及SA的制備

1.3.1.1 氣流膨化預(yù)處理水酶法制備香榧油。

去殼的香榧仁在氣流膨化機(jī)中進(jìn)行氣流膨化，在罐內(nèi)壓力升到5個(gè)大氣壓后，釋放壓力，進(jìn)行氣流膨化制得質(zhì)地酥松的香榧仁。香榧仁進(jìn)行粉碎后，在料液比1∶5、pH 9.5、堿性蛋白酶質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.8%、酶解溫度45 ℃的條件下，酶解4 h。結(jié)束后，8 000r/min條件下，離心20 min后，收集上層清油，得到香榧油(其中金松酸質(zhì)量占總脂肪酸的7.76%)。將收集的香榧油放置在棕色玻璃瓶中，-80 ℃冰箱保存。

1.3.1.2 SA的制備

將香榧油∶95%乙醇∶Lipozyme TL IM固定化酶以1∶2∶0.5的質(zhì)量比在37 ℃下攪拌反應(yīng)5 h后得到脂肪酸乙酯。將30 g尿素與200 mL 95%乙醇進(jìn)行混合，在70 ℃下磁力攪拌并回流至溶解；而后加入10 g脂肪酸乙酯，繼續(xù)回流2 h。反應(yīng)結(jié)束后在 4 ℃冰箱中放置12 h進(jìn)行包合。結(jié)晶后的混合物趁冷過濾，濾液轉(zhuǎn)移至分液漏斗，加入等體積的正己烷重復(fù)萃取兩次，合并萃取液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)去除有機(jī)相后得到富集后的產(chǎn)物(其中金松酸為60.98%)。

將硝酸銀溶解于90%的甲醇溶液后，與硅膠混勻，在暗處放置30 min。銀化硅膠置于100 ℃干燥，在使用前于130 ℃下活化1 h。用正己烷/乙酸乙酯(95∶5)的洗脫劑以1 mL/min的流速洗脫。通過銀離子柱層析獲得SA純品(>99%)。制得的高純度金松酸在-80 ℃冰箱中保存。

1.3.2 細(xì)胞培養(yǎng)

HepG2細(xì)胞培養(yǎng)于DMEM完全培養(yǎng)基中(DMEM中添加了10%(體積分?jǐn)?shù)，下同)胎牛血清和1%雙抗)，在37 ℃和5% CO2恒溫恒濕的環(huán)境下培養(yǎng)。每2～3 d可傳代1次，待細(xì)胞長滿后，分別接種到實(shí)驗(yàn)所需的平板中進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.3.3 MTT 法檢測細(xì)胞存活率

將SA配置成200 mmol/L的母液置于4 ℃條件下備用，隨后用DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基稀釋至對(duì)應(yīng)的實(shí)驗(yàn)濃度。將細(xì)胞接種于96孔板中(約1萬個(gè)/孔)，分別加入含有不同濃度SA(100、300、500、700μmol/L)和OA(100、250、500、750 μmol/L)的培養(yǎng)液，在37 ℃下培養(yǎng)24 h，每個(gè)濃度3個(gè)平行實(shí)驗(yàn)組。隨后，每孔加入5 mg/mL的MTT溶液10 μL，37 ℃培養(yǎng)4 h；結(jié)束后移除上清液并在每孔加入二甲基亞砜150 μL，振蕩10 min；最后測定490 nm處的吸光度值(Optical density，OD)[14]。確定OA和SA的臨界安全濃度。

1.3.4 細(xì)胞內(nèi)脂滴蓄積情況的觀察

將HepG2細(xì)胞接種于24孔板中，待細(xì)胞生長到70%～80%時(shí)，換用含不同脂肪酸組成(脂肪酸總添加量為500 μmol/L，用不同濃度的SA替換OA)的培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)24 h，每個(gè)濃度3個(gè)平行實(shí)驗(yàn)組；接下來，細(xì)胞用油紅O染料染色后在顯微鏡下進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察。觀察拍照結(jié)束后，用60%異丙醇溶解脂滴吸附的油紅染料，測定在490 nm處的OD值，并以O(shè)A組為對(duì)照，計(jì)算相對(duì)脂質(zhì)積累量[15]。

1.3.5 細(xì)胞內(nèi)脂滴蓄積量的檢測

采用GPO-PAP法試劑盒定量測定細(xì)胞中的TG含量。首先，將HepG2細(xì)胞接種于12孔板中，分別用含有不同脂肪酸組成的培養(yǎng)液培養(yǎng)處理24 h；然后，每孔加1 mL細(xì)胞裂解液裂解細(xì)胞后，根據(jù)試劑盒中步驟進(jìn)行操作；最后，用酶標(biāo)儀于510 nm波長處測定OD值用以計(jì)算每孔中的TG含量。同時(shí)用BCA試劑盒測定蛋白濃度。

1.3.6 RT-qPCR 實(shí)驗(yàn)

將細(xì)胞(約25萬個(gè)/mL)接種于6孔板中，每孔2 mL，待細(xì)胞呈指數(shù)增長時(shí)，按實(shí)驗(yàn)分組處理細(xì)胞24 h，棄掉舊培養(yǎng)基。采用RT-qPCR法檢測細(xì)胞內(nèi)與脂質(zhì)代謝相關(guān)基因的表達(dá)[16]。用Trizol提取細(xì)胞內(nèi)的RNA，并使用cDNA試劑盒將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。按照ChamQ Universal SYBR qPCR Master mix試劑盒的方法，依次加入cDNA、上游引物、下游引物(引物序列如表1所示)和ChamQ Universal SYBR qPCR Master mix試劑；然后在Bio-Rad CFX-96上進(jìn)行RT-qPCR反應(yīng)：將 PCR 管在95 ℃下孵育5 min；在95 ℃下持續(xù)5 s，在60 ℃下持續(xù)31 s，作為一個(gè)循環(huán)，進(jìn)行40個(gè)擴(kuò)增循環(huán)。

表1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物

1.4 數(shù)據(jù)分析

使用GraphPad Prism 8.0.2軟件通過One-way ANOVA檢驗(yàn)，進(jìn)行顯著性分析，每個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次以上，數(shù)據(jù)表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差。

2 結(jié)果與討論

2.1 添加不同濃度OA和SA后HepG2細(xì)胞的存活率

為選擇合適的脂肪酸臨界安全濃度，用MTT法檢測不同濃度OA和SA作用24 h后HepG2細(xì)胞的存活率，結(jié)果如圖1所示。當(dāng)OA的濃度低于500 μmol/L時(shí)，HepG2細(xì)胞的存活率幾乎不隨OA濃度的增大而改變；當(dāng)OA的濃度大于500 μmol/L時(shí)，隨著OA濃度的增加，HepG2細(xì)胞存活率呈下降趨勢，750 μmol/L OA處理后的細(xì)胞存活率下降至49.41%。可見，高濃度OA會(huì)降低HepG2細(xì)胞的存活率。因此，本研究選擇500 μmol/L OA作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)濃度。

當(dāng)細(xì)胞暴露于SA時(shí)，隨著SA濃度的增加，其存活率基本沒有變化。由此可見，SA不會(huì)劑量依賴性地降低HepG2細(xì)胞的存活率。為對(duì)比供給SA和OA后HepG2細(xì)胞TG的蓄積情況，后續(xù)實(shí)驗(yàn)將脂肪酸的總添加量固定為500 μmol/L，用不同濃度SA替代OA(SA替換量從0%到100%)，培養(yǎng)24 h，測定HepG2細(xì)胞TG代謝相關(guān)指標(biāo)。

圖1 OA和SA對(duì)HepG2細(xì)胞存活率的影響(n=3)

2.2 SA對(duì)HepG2細(xì)胞內(nèi)TG蓄積的影響

油紅染色法是觀察細(xì)胞內(nèi)脂滴狀態(tài)常用的方法。本研究通過油紅染色法觀察了SA對(duì)HepG2細(xì)胞內(nèi)TG蓄積情況的影響，結(jié)果如圖2所示。當(dāng)500 μmol/L OA作用于細(xì)胞時(shí)，細(xì)胞內(nèi)聚集大量的紅色脂滴，在40倍放大倍數(shù)下，細(xì)胞呈現(xiàn)紅色不透明狀(圖2)。隨著SA替換量增加(從0%增加到100%)，細(xì)胞內(nèi)紅色脂滴越來越少，細(xì)胞內(nèi)紅色逐漸變少，顏色變淺(圖2)，說明細(xì)胞TG蓄積逐漸減少，最終減少了33.0%(圖3)。

注：圖中組別1為OA(500 μmol/L)、組別2為SA(100μmol/L)/OA(400 μmol/L)、組別3為SA(200 μmol/L)/OA(300 μmol/L)、組別4為SA(300 μmol/L)/OA(200 μmol/L)、組別5為SA(400 μmol/L)/OA(100 μmol/L)、組別6為SA(500 μmol/L)。余同。圖2 油紅染色圖(40×)

與油紅染色結(jié)果一致，TG試劑盒定量結(jié)果表明(圖4)，OA組(0.033 mmol/g)脂質(zhì)積累量是空白組(0.017 mmol/g)的2倍；隨著SA替換量的增加(從0%增加到100%)，HepG2細(xì)胞內(nèi)TG的蓄積程度降低，TG從0.033 mmol/g減低到0.017 mmol/g。結(jié)果表明，與OA相比，SA作用于HepG2細(xì)胞24 h后，細(xì)胞內(nèi)TG的蓄積程度較少。

注：n=3，#P<0.05，###P<0.001, #### P<0.0001 vs空白組，*P<0.05，**P<0.01，*** P<0.001和****P<0.000 1 vs組別1。圖3 用異丙醇處理染色后的HepG2細(xì)胞，用OD 490 nm處的吸光度測定脂質(zhì)積聚

圖4 TG試劑盒測定細(xì)胞中的TG含量

2.3 SA對(duì)HepG2細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)代謝關(guān)鍵基因的表達(dá)的影響

參與脂肪酸合成、脂肪酸β-氧化、脂肪酸轉(zhuǎn)運(yùn)、TG代謝的關(guān)鍵限速酶或轉(zhuǎn)錄因子有9種：硬脂酰輔酶A去飽和酶1(Stearoyl-coA desaturase 1，SCDl)、乙酰輔酶A羧化酶1(Acetyl-coA carboxylase 1，ACC1)、脂肪酸合成酶(Fatty acid synthase，F(xiàn)AS)、肉堿棕櫚?；D(zhuǎn)移酶1(Camitine palmitoyltransferase 1，CPT1)、CD36(Cluster of differentiation 36)、脂肪甘油三酯脂肪酶(Adipose triglyceride lipase，ATGL)、膽固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白1(Sterol-regulatory element binding proteins 1，SREBP1)和過氧化物酶體增殖物激活受體α(Peroxisome proliferators-activated receptor α，PPARα)[17]。因此，本研究以β-actin作為內(nèi)參基因，通過RT-qPCR技術(shù)測定了不同實(shí)驗(yàn)組HepG2細(xì)胞內(nèi)上述相關(guān)基因的表達(dá)情況，從而探究SA對(duì)HepG2細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)代謝關(guān)鍵基因的表達(dá)的影響。

2.3.1 脂肪酸合成關(guān)鍵基因的表達(dá)情況

ACC1、SCD1、FAS是脂肪酸從頭合成途徑中的關(guān)鍵限速酶，SREBP1是調(diào)節(jié)這些合成酶表達(dá)的重要核轉(zhuǎn)錄因子。因此，本研究測定了不同實(shí)驗(yàn)組中，上述4種相關(guān)基因的表達(dá)情況，表達(dá)結(jié)果如圖5所示。結(jié)果表明：OA處理組細(xì)胞內(nèi)ACC1、FAS、SCD1、SREBP1的基因表達(dá)水平顯著高于空白組，分別為空白組的3.29、1.87、1.21、1.95倍；與OA處理組相比，隨著SA替換量的增加(從0%增加到100%)，ACC1、SCD1、FAS和SREBP1的基因表達(dá)水平呈現(xiàn)降低趨勢，最終分別降低了62.01%、40.92%、25.56%和43.79%。

ACC是脂肪酸從頭合成途徑的限速酶，可以控制脂肪酸的合成[18]。ACC能夠催化乙酰輔酶A形成丙酰輔酶A，而丙酰輔酶A可以作為長鏈脂肪酸從頭合成的重要碳來源，合成的長鏈脂肪酸可以進(jìn)一步作為原料合成TG[19]。同時(shí)丙酰輔酶A能抑制CPT1的表達(dá)，是脂肪酸氧化代謝過程的抑制劑[20]。FAS是脂肪合成中的另一限速酶，可以控制脂肪酸的合成[21]。在哺乳動(dòng)物中，F(xiàn)AS位于細(xì)胞的胞漿中，是由多種酶形成的復(fù)合體，它能以乙酰輔酶A和脂肪酰輔酶A為原料，合成長鏈飽和脂肪酸。SCD1是形成單不飽和脂肪酸過程中的重要酶，主要起到Δ9去飽和的作用，將飽和脂肪酸轉(zhuǎn)化為單不飽和脂肪酸[22]。

SREBP1主要控制TG的合成，并且調(diào)節(jié)ACC、FAS、SCD1的表達(dá)水平[23-25]。SREBP的N端形式(成熟形式SREBP1)易位到細(xì)胞核內(nèi)，并促進(jìn)脂肪酸合成基因的表達(dá)[26]。SREBP1 siRNA轉(zhuǎn)染肝細(xì)胞，即沉默SREBP1的表達(dá)后，F(xiàn)AS的表達(dá)水平下調(diào)，脂質(zhì)堆積顯著減少[27]。

RT-qPCR結(jié)果表明，添加等量脂肪酸的情況下，隨著SA替換量的增加，HepG2細(xì)胞內(nèi)脂肪酸合成基因的表達(dá)程度降低，減少從頭合成途徑產(chǎn)生的脂肪酸，從而一定程度上避免TG蓄積。

圖5 HepG2 細(xì)胞中的脂肪酸合成相關(guān)基因表達(dá)

2.3.2 脂肪酸氧化和攝取關(guān)鍵基因的表達(dá)情況

CPT1是脂肪酸β-氧化過程中的關(guān)鍵限速酶，而PPARα作為一種轉(zhuǎn)錄因子能夠控制CPT1的表達(dá)；CD36是重要的跨膜蛋白，參與脂肪酸的轉(zhuǎn)運(yùn)。因此，本研究測定了不同實(shí)驗(yàn)組中相關(guān)基因的表達(dá)情況，表達(dá)結(jié)果如圖6所示。結(jié)果表明：OA處理組細(xì)胞內(nèi)CPT1和PPARα的基因表達(dá)水平顯著低于空白組，相較于空白組的比值分別為0.63和0.32；與OA處理組相比，隨著SA替換量的增加(從0%增加到100%)，CPT1、PPARα的基因表達(dá)水平均增加，最終分別增加了143.94%、445.11%；此外，CD36的表達(dá)水平隨著SA替換量的增大呈上升趨勢，最終比OA組升高了38.59%。

圖6 HepG2細(xì)胞中的脂肪酸攝取和氧化相關(guān)基因表達(dá)

CPT1是一種載脂蛋白，可以將脂肪酸運(yùn)送到線粒體內(nèi)進(jìn)行β-氧化[28]，其活性受丙酰輔酶A影響。本研究發(fā)現(xiàn)，在SA作用下，CPT1催化長鏈脂酰輔酶A進(jìn)入線粒體內(nèi)進(jìn)行β-氧化，從而使HepG2細(xì)胞中脂類分解代謝過程加快，TG蓄積減少。PPAR是配體活化的受體超家族，是一種核轉(zhuǎn)錄因子。PPARα是過氧化物酶體增殖物激活受體的一種亞型，能夠促進(jìn)CPT1的表達(dá)[29]，從而調(diào)節(jié)脂肪酸的氧化[30]。CD36是肝細(xì)胞中重要的跨膜蛋白，是脂肪酸轉(zhuǎn)運(yùn)體，參與促進(jìn)極低密度脂蛋白和長鏈游離脂肪酸的攝取。

因此，RT-qPCR結(jié)果表明，SA能顯著增加HepG2細(xì)胞中脂肪酸氧化基因的表達(dá)水平，促進(jìn)自身合成和外界攝取得到的脂肪酸進(jìn)行β-氧化，從而使得細(xì)胞內(nèi)TG蓄積程度降低。

2.3.3 TG合成與分解關(guān)鍵基因的表達(dá)情況

ATGL能夠特異性水解TG，是TG分解中的限速酶。因此，本研究測定了不同實(shí)驗(yàn)組中，ATGL基因表達(dá)情況，表達(dá)結(jié)果如圖7所示。結(jié)果表明：OA處理組細(xì)胞內(nèi)ATGL的基因表達(dá)情況表達(dá)與正常組沒有顯著性差異；與OA組相比，隨著SA替換量的增加(從0增加到100%)，ATGL的基因表達(dá)水平顯著增加，并呈劑量依賴性，最終增加了123.71%。

圖7 HepG2 細(xì)胞中的TG合成相關(guān)基因表達(dá)

ATGL是近年來研究發(fā)現(xiàn)的啟動(dòng)脂肪動(dòng)員的又一關(guān)鍵脂肪酶。ATGL能特異性地水解TG，是TG分解代謝的限速酶。ATGL在各組織的脂代謝過程中都起到重要作用，其介導(dǎo)的脂解過程與許多代謝疾病存在關(guān)聯(lián)，如肥胖、糖尿病、脂肪肝等[31]。TG可以被ATGL分解成二酰甘油和一個(gè)游離脂肪酸分子，而二酰甘油通過磷酸化的激素敏感性甘油三酯脂肪酶可以進(jìn)一步分解成單酰甘油和一個(gè)游離脂肪酸分子[32]。

RT-qPCR結(jié)果表明，SA作用HepG2細(xì)胞后，能顯著增加TG分解關(guān)鍵基因的表達(dá)，促進(jìn)TG的分解，從而降低了細(xì)胞內(nèi)TG蓄積。

3 結(jié)論

添加等量脂肪酸的情況下，隨著SA替換量的增加，HepG2細(xì)胞內(nèi)TG的蓄積程度減少。其作用機(jī)制通過的途徑為：SA能抑制脂肪合成酶(FAS、ACC1、SCD1)的過度表達(dá)，減少細(xì)胞內(nèi)通過從頭合成途徑產(chǎn)生的脂肪酸，從而減少細(xì)胞內(nèi)TG的合成代謝；SA能促進(jìn)脂肪氧化(CPT1)和TG的分解(ATGL)關(guān)鍵酶的表達(dá)，從而增加細(xì)胞內(nèi)TG的分解代謝。總的來說，SA通過促進(jìn)TG分解代謝同時(shí)抑制TG合成代謝，使得HepG2細(xì)胞內(nèi)TG蓄積減少。因此SA在健康食品開發(fā)方面具有良好的前景。