奶牛A6型溶血性曼氏桿菌與牛支原體混合感染的實驗室診斷

金圣子 ， 尢振東 ， 黃思琪 ， 劉星堯 ， 鄭 鐸 ， 劉雪松 ， 劉 云

(1.東北農業(yè)大學動物醫(yī)學學院黑龍江省實驗動物與比較醫(yī)學重點實驗室 ， 黑龍江 哈爾濱 150030 ;2.黑龍江省農業(yè)科學院畜牧獸醫(yī)分院 ， 黑龍江 齊齊哈爾 161005)

隨著養(yǎng)牛業(yè)的快速發(fā)展，呼吸系統(tǒng)疾病成為危害養(yǎng)牛業(yè)發(fā)展的一類重要疾病。且牛呼吸道疾病的原因很復雜，常由病毒、細菌和牛支原體單獨或混合感染引起，給養(yǎng)牛業(yè)造成了巨大的經濟損失。溶血性曼氏桿菌(Mannheimiahaemolytica，Mh)是反芻動物上呼吸道的共生細菌[1]。但當動物免疫機能損害時，Mh會侵入下呼吸道，是引起牛運輸熱 (Shipping fever)及牛呼吸道疾病(Bovine respiratory diseases，BRD)的主要病原菌[2]。Mh可根據表面蛋白的抗原性差異分為12種莢膜血清型，其中血清型A1和A6目前最容易造成牛場大規(guī)模肺炎的暴發(fā)[3]。另外Clawson 等通過核苷酸多態(tài)性基因型的系統(tǒng)發(fā)育分析將Mh分為2個主要基因型(1型和2型)，其中基因2型Mh被證實是造成BRD的潛在致病株[4]。牛支原體是一種介于細菌與病毒之間的無細胞壁結構的原核微生物，分布于世界各地，且牛支原體常伴隨其他病原混合感染[5]，能夠對機體的免疫防御系統(tǒng)造成嚴重的破壞，以達到增強繼發(fā)感染病原微生物致病力的效果。牛支原體可在宿主體內持久存在，并有多種傳播途徑，牛群中一旦感染便很難清除。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 樣本采集 病料來自某規(guī)?；膛霾∷琅?。該牧場進入12月份后陸續(xù)有奶牛出現(xiàn)體溫升高、流鼻涕、呼吸困難等癥狀,且病程短、死亡率高。其中對病牛呼吸道疾病綜合征相關病毒，牛傳染性鼻氣管炎病毒(Infections bovine rhinotracheitis virus,IBRV)、牛病毒性腹瀉病毒(Bovine viral diarrhoea virus,BVDV)、牛呼吸合胞體病毒病(Bovine respiratory syncytial virus,BRSV)、牛副流感病毒(Bovine parainfluenza virus,BPIV)的檢測結果均為陰性。對病死奶牛進行剖檢,肺表現(xiàn)間質性肺炎、肺氣腫及纖維素性胸膜炎等病理變化。無菌采取肺組織，4～8 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 主要試劑 腦心浸液培養(yǎng)基(BHI)，購自北京奧博星生物技術有限公司；綿羊血平板，購自南京佰杰斯生物技術有限公司；MH肉湯培養(yǎng)基(MHB)，購自廣州鴻泉生物科技有限公司；革蘭染液、瑞氏-吉姆薩染料，均購自于南京建成生物工程研究所；DNA提取試劑盒，購自北京天根生化科技有限公司；細柱式DNA膠回收試劑盒，購自生工生物工程(上海)股份有限公司；藥敏紙片，購自溫州市康泰生物科技有限公司；引物委托哈爾濱擎科生物科技有限公司合成。

1.1.3 實驗動物 清潔級昆明白雌鼠，40日齡，購自長春長生科技有限公司，許可證號：SCXK(遼)2020—0001。

1.2 試驗方法

1.2.1 牛支原體檢測 無菌操作剪取奶牛肺臟后，加入少量生理鹽水研磨，按DNA提取試劑盒說明書提取病料DNA，然后以此為模板對牛支原體uvrC特異性基因進行PCR擴增[6]。引物信息見表1。

表1 本研究中寡核苷酸引物序列Table 1 Sequence of oligonucleotide primers used for this study

1.2.2 細菌的分離純化及染色鏡檢 將5頭病死奶牛無菌采集的肺組織接種于綿羊血平板上，于37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h后觀察菌落生長狀態(tài)，挑取單個菌落接種于BHI液體培養(yǎng)基進行純化，置于37 ℃搖床，220 r/min培養(yǎng)12 h。取菌液進行革蘭染色及瑞氏染色后鏡檢。

1.2.3 致病菌分子學鑒定 分別從接種5頭奶牛肺臟的培養(yǎng)皿中挑取菌落，按基因組提取試劑盒說明書提取細菌的基因組DNA，并以此為PCR擴增的模板，應用引物AJ11[7]隨機擴增多態(tài)性DNA(Random amplified polymorphic DNAs，RADP)技術進行歸類。PCR擴增16S rRNA并進行測序，擴增產物測序結果提交 GenBank數據庫，再用NCBI BLAST及DNASTAR的MegAlign軟件對序列進行比對。引物信息見表1。

1.2.4 菌株莢膜血清型及基因型鑒定 菌株莢膜血清型的鑒定采用Klima等[9]建立的鑒定Mh莢膜血清型1型、 2型和6型的PCR鑒定法。提取菌株的全基因組DNA后,分別以Hyp、Core2、TupA為靶基因進行PCR擴增,其中Hyp、Core2、TupA基因分別代表血清型1型、2型和6型。引物信息見表1。菌株基因型的鑒定采用Wynn等[10]建立的菌落表型目測鑒定法。菌株先在血瓊脂平板上于37 ℃、5%CO2的條件下培養(yǎng)兩代后，再于血平板上培養(yǎng)18 h，根據固體培養(yǎng)基上的菌落顏色及三維形狀等表型特征來區(qū)分基因1型和2型菌株。

1.2.5 小鼠致病性試驗 取1 mL分離菌液接種于200 mL BHI培養(yǎng)液中，置于全自動控制的細菌發(fā)酵罐37 ℃、200 r/min培養(yǎng)，保證氧氣充足。每隔一段時間從發(fā)酵罐中抽取菌液0.2 mL測OD600 nm值，并記錄對應的數據，繪制生長曲線。采用稀釋平板計數法測定對數生長期的菌液濃度，將1、0.2、0.04濃度的菌液腹腔注射小鼠(0.2 mL/只)，觀察4 d，記錄病死數，按Reed-Muench法計算半數致死量(Median lethal dose,LD50)。

1.2.6 藥敏試驗 采用紙片擴散法測定致病菌對頭孢克肟、頭孢拉定、頭孢噻肟、頭孢唑林、頭孢曲松、洛美沙星、恩諾沙星、環(huán)丙沙星、氨芐西林、阿莫西林、四環(huán)素、多西環(huán)素、美羅培南、慶大霉素共14種抗菌藥的敏感性。判讀標準遵循臨床和實驗室標準協(xié)會(Clinical and Laboratory Standards Institute,CLSI) 2020年發(fā)布的《M100抗微生物藥物敏感性試驗執(zhí)行標準》。

2 結果

2.1 牛支原體檢測 5頭病死奶牛肺組織DNA經牛支原體uvrC特異性引物PCR擴增后均可見對應大小的目的條帶 (圖1)，可見5頭病死奶牛均感染支原體。

圖1 uvrC基因PCR擴增Fig.1 PCR amplification of uvrC geneM:DL2 000 DNA 相對分子質量標準；1～5:奶牛編號M:DL2 000 DNA Marker;1-5:Number of cows

2.2 細菌的分離純化及染色鏡檢 將5頭病死奶牛的肺臟組織接種于綿羊血平板上，37 ℃培養(yǎng)24 h后在血平板才可觀察到表面光滑的灰白色小菌落(圖2A)，且具有β溶血特征(圖2B)，除此之外未分離到其他細菌。革蘭染色后呈陰性桿菌(圖3A)、瑞氏染色可見兩極濃染(圖3B)；菌體長度在1.2～2.5 μm，寬度在0.5～0.8 μm。

圖2 致病菌培養(yǎng)特性Fig.2 Growth characteristics of pathogenic bacteriaA：致病菌在綿羊血平板上形成表面光滑的灰白色小菌落；B：致病菌在綿羊血平板上形成β溶血環(huán)A:Pathogenic strains formed small grayish colonies with smooth surface on sheep blood plates;B:Pathogenic strains formed β hemolytic rings on sheep blood plates

圖3 致病菌鏡檢Fig.3 Microscopic examination of pathogenic bacteriaA：革蘭染色； B：瑞氏染色A：Gram staining; B:Raynaud's staining

2.3 致病菌分子學鑒定 分別采自5頭病死奶牛的5株溶血菌在隨機引物擴增下，得到數量、大小一致的條帶譜(圖4A)，提示5頭病死奶牛感染相同的致病菌，將該致病株命名為RX2020。

經16S rRNA通用引物擴增，進行凝膠電泳后，在1 465 bp左右處得到條帶(圖4B)，測序結果提交 GenBank數據庫，登錄號為MW325979，BLAST比對結果顯示，5株分離菌均為Mh。核苷酸序列對比結果顯示，其與2014年廣東省動物衛(wèi)生監(jiān)督研究所分離到的牛源Mh(GenBank登錄號：KM5768489)同源性為99.9%。

圖4 分離菌株隨機引物(A)及16S rRNA 通用引物(B)PCR擴增Fig.4 PCR amplification of random primers (A) and 16S rRNA universal primers (B) of isolated strainsM:DL2 000 DNA 相對分子質量標準； 1～5:5株分離株的PCR擴增產物M:DL2 000 DNA Marker; 1-5:PCR amplification products of 5 isolates

2.4 菌株莢膜血清型及基因型鑒定 RX2020的莢膜血清型PCR擴增結果顯示，僅6型特異性基因TupAPCR結果為陽性 (圖5)，鑒定其為血清6型Mh。

圖5 RX2020莢膜血清型鑒定Fig.5 Capsular serotype identification of RX2020M:DL500 DNA 相對分子質量標準M:DL500 DNA Marker

按Wynn等[10]的方法培養(yǎng)后可觀察到RX2020在血平板上生長為乳白色菌落，呈圓頂狀，能均勻反射光線，邊緣反射光與中心反射光一致 (圖6)，鑒定其為Mh基因2型菌株。

圖6 RX2020菌落表型Fig.6 RX2020 colony phenotyping

2.5 小鼠致病性試驗 根據生長曲線可知致病菌在培養(yǎng)5 h時處于對數生長期(圖7)，用稀釋平板計數法測定此時菌液濃度為2.4×108CFU/mL，3個濃度的菌液腹腔注射后小鼠死亡情況見表2,按Reed-Muench法計算出RX2020對小鼠的LD50為1.94×107CFU。

表2 RX2020對小鼠的LD50Table 2 LD50 in mice for RX2020

圖7 RX2020的生長曲線Fig.7 Growth curve for RX2020

2.6 藥敏試驗 RX2020的藥敏試驗結果見表3，此分離株對大多數抗菌藥敏感。

表3 藥敏試驗結果Table 3 Results of antibiotics sensitivity

表3 藥敏試驗結果Table 3 Results of antibiotics sensitivity

藥物名稱Antibiotic抑菌圈直徑判斷標準/mmCriteria of inhibition zone diameter (IZD)耐藥(R)中介(I)敏感(S)RX2020抑菌圈直徑/mmIZD耐藥性判定Resistance頭孢克肟CFM≤1516～18≥1946.18±0.30S頭孢拉定CE≤1718～20≥2135.03±0.25S頭孢噻肟CTX≤2223～25≥2651.07±0.38S頭孢唑林CZ≤1415～22≥2342.37±0.42S頭孢曲松CRO≤1920～22≥2348.90±0.32S阿莫西林AMX≤1314～17≥1840.05±0.35S氨芐西林AMP≤1112～14≥1536.08±0.30S美羅培南MEM≤1516～17≥1845.33±0.27S恩諾沙星ENR≤1415～18≥1943.77±0.19S環(huán)丙沙星CIP≤2122～25≥2645.55±0.28S洛美沙星LMF≤1819～21≥2240.98±0.30S多西環(huán)素DOX≤1011～13≥1451.10±0.25S四環(huán)素TC≤1112～14≥1534.90±0.33S慶大霉素GM≤1213～14≥1525.70±0.24S

注：R：耐藥； I：中介； S：敏感Note：R:Resistant; I:Intermediate; S:Sensitive

3 討論

細菌感染引起的肺炎對圍產期的奶牛來說是致命的。致病菌Mh是引起奶牛和犢牛肺炎的常見細菌，在我國新疆、內蒙、甘肅、黑龍江、云南、廣西等地均有發(fā)現(xiàn)，重慶地區(qū)暴發(fā)過3次較大流行[11]，給我國養(yǎng)牛業(yè)造成了重大的經濟損失。而牛支原體肺炎在我國各地區(qū)均出現(xiàn)流行，有調查顯示，超半數的牛場發(fā)生牛支原體感染，且許多奶牛場支原體抗體陽性率高于50%[12-13]。牛支原體的自然感染可導致滲出性支氣管肺炎，但試驗性牛支原體的單獨感染僅能引起犢牛及免疫狀態(tài)低下的成年牛亞臨床肺炎[14]。且已有研究發(fā)現(xiàn)，由Mh或其他致病菌的初始感染引起的炎癥會加劇牛支原體的感染[15]?？梢娕Ｖгw引起的成年牛嚴重肺部疾病是由于其與其他微生物之間相互作用，協(xié)同促進疾病發(fā)展。本試驗利用常規(guī)微生物學方法和分子生物學技術，對某奶牛場患肺炎牛進行病原的分離培養(yǎng)以及血清型及基因型鑒定，并對分離菌株進行致病力及藥物敏感性試驗，為奶牛呼吸道疾病的診斷、預防與治療提供參考，為Mh疫苗的生產提供菌種資源。

本次分離的A6型Mh對大多數抗菌藥均敏感，但據駐場獸醫(yī)反饋，頭孢唑林配合青霉素聯(lián)給藥后治療效果不顯著。有統(tǒng)計指出，目前牛支原體對青霉素、頭孢菌素類藥物完全耐藥，對氟喹諾酮類藥物和大環(huán)內酯類藥物都存在耐藥基因，其高度敏感的四環(huán)素類藥物中存在部分國家禁用獸藥[16]。由此本課題組推論在混合感染的情況下，牛支原體可耐受抗菌藥并干擾宿主免疫系統(tǒng)，妨礙宿主對原發(fā)病原Mh的清除，這意味著針對牧場由Mh引起的牛運輸熱及牛呼吸道疾病，早期識別并加強預防為最合理的疾控方式。

目前國內對牛Mh的研究主要集中在流行率和抗菌藥敏感性上，關于Mh血清型流行性的研究很少。對血清型流行情況進行有計劃的監(jiān)測并保證所有致病性的血清型都已被開發(fā)的疫苗所涵蓋，是決定疫苗保護效力的重要組成部分。A1型Mh一直被認為是引起牛呼吸道疾病的最主要血清型，即使研究指出A6型Mh引發(fā)BRD越來越普遍，大多數疫苗依然只針對溶血性曼氏桿菌A1血清型進行保護[17]。這也是國內外使用的Mh疫苗對牛的保護效果不穩(wěn)定的主要原因。本試驗從牛場5頭死亡奶牛肺臟組織均分離出A6型Mh，經RAPD證實為同一株致病株，結合場內奶牛感染情況，可見其水平傳播率極高，Reed-Muench法計算出其對小鼠的LD50為1.94×107CFU。2019年Andres-lasheras 等的研究指出，A6型Mh在BRD中的作用一直被低估，在臨床BRD病例的病原統(tǒng)計中發(fā)現(xiàn)，下呼吸道A6型Mh檢出率明顯高于上呼吸道樣品[18]。也就是說，若發(fā)生A6型Mh感染，僅用鼻拭子對牛進行上呼吸道采樣不能分離主要致病菌。本試驗對牛場分離的A6型Mh野生菌株進行分離鑒定，并將其16S rRNA基因序列上傳NCBI，可為該菌的鑒定與治療提供參考，也可為進一步的疫苗生產提供菌種資源。

本試驗還對2020年Wynn等[10]建立的菌落表型目測鑒定法進行嘗試，將分離的Mh鑒定為基因2型，具有引發(fā)BRD的潛力。據描述此法可準確鑒定91%的菌株，一些特征模棱兩可的菌株還需借助基質輔助激光解析電離飛行時間質譜(MALDI-TOF MS)進行分析驗證，此法可用于臨床強致病力Mh株的快速篩查和粗略分離，值得其他獸醫(yī)從業(yè)者參考。