補陰益智湯配方顆粒對睡眠剝奪小鼠記憶力及睡眠質量的影響

李克建 李 靜 李 紅

(1 湖北中醫(yī)藥大學附屬湖北省中醫(yī)院神志病科，武漢，430000； 2 武漢市兒童醫(yī)院中西結合科，武漢，430015)

睡眠剝奪(Sleep Deprivation，SD)指自身或外部原因所導致睡眠時間被迫減少的一類疾病，可導致患者注意力下降、學習記憶及認知功能障礙、機體免疫力下降等癥狀[1]。據世界流行病學分析，全球超過三分之一的人口有睡眠障礙及失眠癥狀，且世界衛(wèi)生組織指出SD是一個應得到世界重視和解決的公共衛(wèi)生問題[2]。目前，國內外主要用中樞興奮性藥物和鎮(zhèn)靜催眠藥物治療SD，但因不良反應大、對神經系統(tǒng)造成不良影響而使這些藥物臨床應用受限[3]。中醫(yī)藥防治睡眠障礙歷史悠久且療效顯著[4]，中醫(yī)認為陰虛火旺、陰不斂陽、實火擾心等為失眠癥主要病機[5]，以清熱瀉火、滋陰安神的藥物治療失眠已獲得一定療效[6]。中醫(yī)經驗方-補陰益智湯配方顆粒(Buyin Yizhi Tang Dispensing Granule，BYT)由女貞子、墨旱蓮、梔子、黃芩、甘草組成，可滋陰涼血、清熱除煩、補益肝腎，對肝腎陰虛、心煩不眠等療效較好。近來研究發(fā)現(xiàn)BYT對東莨菪堿所致小鼠記憶損傷有保護作用[7]，基于以上推測BYT亦可能對SD所致學習記憶下降有一定改善作用。因此建立小鼠SD模型，對此進行驗證并初步探討其作用機制，以期為臨床合理用藥及中醫(yī)藥開發(fā)應用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 無特定病原體(Specific Pathogen Free,SPF)級ICR雄性小鼠4周齡，體質量18～22 g，由廣東省醫(yī)學實驗動物中心提供，生產許可證號為SCXK(粵)2018-0002。所有小鼠于本院動物房中常規(guī)飼養(yǎng)。本試驗經本院倫理委員會批準[倫理審批號：IACUC-01(2020317)]，試驗動物符合3R原則。

1.1.2 藥物 補陰益智湯配方：墨旱蓮20 g、女貞子20 g、梔子10 g、黃芩10 g、甘草5 g，藥材均購自本地中藥房，用8倍體積純凈水浸泡后投入中藥藥液濃縮機中進行濃縮，至終濃度為2 g/mL；地西泮片(山西昂生藥業(yè)有限責任公司，生產批號：20180219)。

1.1.3 試劑與儀器 TUNEL細胞凋亡檢測試劑盒(北京索萊寶科技有限公司，貨號：T2190，)；5-羥色胺(5-Hydroxytryptamine，5-HT)酶聯(lián)免疫吸附試驗(Enzyme-linked Immunosorbent Assay，ELISA)試劑盒(武漢純度生物科技有限公司，貨號：CD-102334-ELA，)；谷氨酸(Glutamate，Glu)ELISA試劑盒(上海羽朵生物科技有限公司，貨號：YEF16367，)；蛋白激酶A-催化亞基β(Protein Kinase A-catalytic Subunit Beta，PKA-Cβ)抗體、cAMP反應元件結合蛋白(cAMP Rresponse Element Binding Protein，CREB)及磷酸化CREB(P-CREB)抗體、原肌球蛋白受體激酶(Tropomyosin Receptor KinaseB，TrkB)抗體、神經細胞凋亡相關通路配體蛋白(Wnt)抗體、β-連環(huán)素抗體、β-半乳糖苷酶(β-galactosidase，β-gal)抗體(美國abcam公司，美國，貨號分別為：ab5815、ab32515、ab32096、ab187041、ab109222、ab32572、ab240038)；BCA蛋白定量試劑盒(美國Pierce公司，美國，貨號：P0768)。手動輪轉式切片機(德國Leica公司，德國，型號：RM2125RTS)；光學顯微鏡(日本尼康公司，日本，型號：SMZ745)；蛋白電泳儀、半干轉膜儀(美國Bio-Rad公司，美國，型號：1659001、Trans-Blot SD)等。

1.2 方法

1.2.1 分組與模型制備 將60只小鼠用隨機數(shù)字表法分為正常對照組、模型組、BYT低劑量組(6 g/kg)、BYT中劑量組(12 g/kg)、BYT高劑量組(18 g/kg)、陽性對照組(地西泮0.9 mg/kg)，每組10只。除正常對照組外，其余組小鼠均參照文獻[8]建立SD模型：取SD箱，使小鼠在剝奪箱內自由活動、進食和飲水，在靠近鼠籠底部裝有一個長方形的金屬桿，設置金屬桿的撥動間隔為30 s，剝奪90 min，休息15 min；當撥桿從鼠籠的一端勻速移動到另一端時，小鼠需要跨過金屬桿才可以繼續(xù)活動。如果小鼠睡著，金屬桿撥動就會對小鼠產生觸覺刺激，喚醒小鼠，阻止睡眠，共給予剝奪21 d。21 d后，觀察小鼠行為狀態(tài)，若小鼠出現(xiàn)狂躁及尖叫行為，且毛色枯暗現(xiàn)象表明造模成功。正常對照組在正常條件下持續(xù)光照黑暗各12 h模擬正常睡眠。

1.2.2 給藥方法 各組均于造模成功后開始給藥，BYT參照文獻[7]用生理鹽水配制成0.6、1.2、1.8 mg/mL的溶液，地西泮參照文獻[9]用生理鹽水配制成0.09 mg/mL溶液，均按10 mL/kg的劑量灌胃給藥，正常對照組及模型組等劑量灌胃生理鹽水。連續(xù)給藥21 d，1次/d。

1.2.3 檢測指標與方法

1.2.3.1 小鼠一般行為觀察 各組小鼠給藥期間，每日觀察并記錄包括毛發(fā)、精神、飲食在內的一般狀態(tài)。

1.2.3.2 Morris水迷宮實驗 各組小鼠末次灌胃給藥結束后30 min，參照文獻[10]進行Morris水迷宮實驗。具體操作方法為：設置水迷宮直徑1 m，平臺直徑9 cm，水溫保持23 ℃。訓練階段，把小鼠面朝池壁隨機從4個象限放入水中，讓其自由游泳60 s，找到平臺停留20 s，記錄小鼠找到并爬上平臺的時間即為逃逸潛伏期；如果小鼠在60 s內未找到平臺，則由實驗人員引導其找到平臺，在平臺停留20 s，逃逸潛伏期記為60 s。每次訓練結束后擦干小鼠，送回鼠籠休息60 s后，進行下一次訓練，共訓練12次，取9～12次的平均值進行計算。上述訓練結束后第2 d進行空間探索測試，具體操作方法為：撤掉平臺，從離平臺最遠點將小鼠放入水池，視頻記錄小鼠60 s內穿越平臺次數(shù)。

1.2.3.3 小鼠入睡潛伏期及持續(xù)時間檢測 各組小鼠在1.2.3.2實驗后，經腹腔注射戊巴比妥鈉50 mg/kg，以翻正反射消失和重新出現(xiàn)為標準，記錄小鼠入睡潛伏期及持續(xù)時間。

1.2.3.4 標本采集 各組小鼠在1.2.3.3檢測后，經尾靜脈取血3 mL，于3 000 r/min條件下離心5 min(離心半徑為5 cm)后取血清，置于-20 ℃條件下保存?zhèn)溆?。立即斷頭處死小鼠，解剖取小鼠海馬組織，剪取0.5 g海馬組織置于-80 ℃冰箱保存，剩余海馬組織迅速置于4%多聚甲醛溶液中固定24 h備用。

1.2.3.5 TUNEL染色觀察海馬組織神經細胞凋亡情況 取1.2.3.4項下4%多聚甲醛溶液中固定24 h的海馬組織，經脫水、透明、石蠟包埋后切成4 μm切片，并經脫蠟、脫水、3%H2O2滅活，胃蛋白酶K孵育后添加TUNEL工作液37 ℃下濕盒中孵育1 h，隨后封閉滴加轉化劑-POD 50 μL/片，置37 ℃下濕盒中孵育10 min，0.01MPBS洗滌后滴加二氨基聯(lián)苯胺(3,3′-diaminobenzidine，DAB)底物孵育15 min后蘇木精復染50 s后常規(guī)脫水、透明、封片。在共聚焦顯微鏡下觀察切片中神經細胞凋亡情況(細胞核染成棕褐色顆粒者為凋亡細胞)，細胞凋亡率=凋亡細胞數(shù)/細胞總數(shù)×100%。

1.2.3.6 血清5-HT及Glu水平檢測 取1.2.3.4項下-20 ℃冰箱保存的血清標本，4 ℃條件下解凍后，按ELISA試劑盒說明書方法檢測血清5-HT及Glu水平。

1.2.3.7 蛋白質免疫印跡法檢測海馬組織PKA-Cβ、P-CREB、CREB、Trk B、Wnt、β-連環(huán)素、β-gal蛋白相對表達水平 取1.2.3.3中-80 ℃保存的海馬組織，勻漿后取上清液，用蛋白提取試劑盒提取蛋白，二喹啉甲酸(Bicinchoninic Acid，BCA)試劑盒檢測蛋白總濃度。取50 μg蛋白上樣，進行電泳和轉膜反應，洗滌緩沖液(Tris Buffered Saline Tween,TBST)溶液清洗后，加入5%脫脂牛奶室溫下封閉1 h，TBST溶液清洗3次后，加入一抗[PKA-Cβ、P-CREB、CREB、Trk B、Wnt、β-連環(huán)素、β-gal、β-肌動蛋白(內參)]抗體，稀釋倍數(shù)除內參抗體為1∶2 000外，其余均為1∶1 000，4 ℃搖床室溫孵育過夜，TBST振洗后加入辣根過氧化物酶(Horseradish Peroxidase，HRP)羊抗兔二抗(稀釋倍數(shù)1∶2 000)，37 ℃搖床室溫孵育1 h，TBST清洗3次后，采用增強化學發(fā)光法顯色，以化學發(fā)光儀觀察條帶并拍照，并以Image-J軟件分析各組蛋白相對表達水平。

2 結果

2.1 各組小鼠一般狀態(tài) 正常對照組小鼠行為活動正常，毛色光澤柔順；與正常對照組比較，模型組小鼠攝食量減少，毛發(fā)臟亂無光澤，精神萎靡，活動減少，反應遲鈍，抓取時出現(xiàn)尖叫、狂躁行為；與模型組比較，BYT各劑量組飲食正常，活動增多，抓取時尖叫、狂躁行為減少。

2.2 各組小鼠Morris水迷宮實驗逃逸潛伏期、穿越平臺次數(shù)比較 與正常對照組比較，模型組小鼠逃逸潛伏期增加，穿越平臺次數(shù)減少，學習記憶能力降低(P<0.05)；與模型組比較，BYT低劑量組、BYT中劑量組、BYT高劑量組及陽性對照組小鼠學習記憶能力升高(P<0.05)，BYT中劑量組、BYT高劑量組及陽性對照組比較學習記憶能力差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表1。

表1 各組小鼠Morris水迷宮實驗逃逸潛伏期、穿越平臺次數(shù)比較

2.3 各組小鼠入睡潛伏期及持續(xù)時間比較 與正常對照組比較，模型組小鼠入睡潛伏期增加，睡眠持續(xù)時間減少，睡眠質量降低(P<0.05)；與模型組比較，BYT低劑量組、BYT中劑量組、BYT高劑量組及陽性對照組睡眠質量升高(P<0.05)，BYT中劑量組、BYT高劑量組及陽性對照組比較睡眠質量差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表2。

表2 各組小鼠入睡潛伏期及持續(xù)時間比較

2.4 各組小鼠血清5-HT及Glu等神經遞質水平比較 與正常對照組比較，模型組小鼠血清Glu水平增加，5-HT水平減少，神經遞質水平異常(P<0.05)；與模型組比較，BYT低劑量組、BYT中劑量組、BYT高劑量組及陽性對照組小鼠神經遞質水平趨于正常(P<0.05)，BYT中劑量組、BYT高劑量組及陽性對照組神經遞質水平差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表3。

表3 各組小鼠血清5-HT及Glu等神經遞質水平比較

2.5 各組小鼠海馬神經細胞凋亡率比較 海馬神經細胞被染成棕褐色的為凋亡細胞，正常對照組小鼠海馬神經細胞染色正常。與正常對照組比較，模型組小鼠海馬神經細胞核固縮且染色較深，神經細胞凋亡率增高(P<0.05)，與模型組比較，BYT低劑量組、BYT中劑量組、BYT高劑量組及陽性對照組小鼠細胞核染色較淺，神經細胞凋亡率降低(P<0.05)，BYT中劑量組、BYT高劑量組及陽性對照組比較海馬神經細胞凋亡率差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見圖1，表4。

圖1 各組小鼠海馬組織(TUNEL染色，×400)

表4 各組小鼠海馬神經細胞凋亡率比較

2.6 各組小鼠海馬組織PKA-Cβ、P-CREB/CREB、Trk B蛋白表達比較 與正常對照組比較，模型組小鼠海馬組織PKA-Cβ、P-CREB/CREB、Trk B蛋白表達減少(P<0.05)；與模型組比較，BYT低劑量組、BYT中劑量組、BYT高劑量組及陽性對照組小鼠海馬組織PKA-Cβ、P-CREB/CREB、Trk B蛋白表達升高(P<0.05)，BYT中劑量組、BYT高劑量組及陽性對照組比較PKA-Cβ、P-CREB/CREB、Trk B蛋白表達差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見圖2，表5。

圖2 各組小鼠海馬組織PKA-Cβ、P-CREB/CREB、TrkB蛋白表達免疫印跡圖

表5 各組小鼠海馬組織PKA-Cβ、P-CREB/CREB、Trk B蛋白表達比較

2.7 各組小鼠海馬組織Wnt、β-連環(huán)素、β-gal蛋白表達比較 與正常對照組比較，模型組小鼠海馬組織Wnt、β-連環(huán)素、β-gal蛋白表達減少(P<0.05)；與模型組比較，BYT低劑量組、BYT中劑量組、BYT高劑量組及陽性對照組小鼠海馬組織Wnt、β-連環(huán)素、β-gal蛋白表達升高(P<0.05)，BYT中劑量組、BYT高劑量組及陽性對照組比較Wnt、β-連環(huán)素、β-gal蛋白表達差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見圖3，表6。

圖3 各組小鼠海馬組織Wnt、β-連環(huán)素、β-gal蛋白表達免疫印跡圖

表6 各組小鼠海馬組織Wnt、β-連環(huán)素、β-gal蛋白表達比較

3 討論

睡眠可緩解疲勞、鞏固和改善學習記憶、提高機體免疫力[11]。劉陶等[8]發(fā)現(xiàn)，SD 3周可造成小鼠學習過程減慢及空間記憶能力受損。為模擬人類長期睡眠不足模型，本研究用SD箱給予小鼠3周SD，發(fā)現(xiàn)模型組小鼠活動減少、反應遲鈍且狂躁，學習記憶能力下降，提示SD3周后，小鼠學習過程減慢及空間記憶能力受損，表明造模成功。海馬與學習記憶有關，對睡眠喪失特別敏感，若海馬體受到大范圍損傷，會引起記憶喪失[12]。本研究發(fā)現(xiàn)SD模型小鼠海馬組織神經細胞凋亡率高于正常對照組，可能與學習記憶功能下降關系密切。另外，學習記憶功能維持離不開中樞神經系統(tǒng)遞質的參與。興奮性神經遞質Glu不僅參與學習記憶傳導過程[13]，還參與睡眠覺醒、總睡眠時間與慢波睡眠的維持過程[14]；5-HT水平增高或降低均會損害學習記憶活動[15]，且5-HT參與非快速眼動睡眠的維持過程[16]。本研究發(fā)現(xiàn)SD小鼠血清Glu水平及入睡潛伏期升高，5-HT水平及睡眠維持時間降低，預示SD小鼠神經遞質釋放異常、睡眠質量較差可能與學習記憶力下降關系密切。

中醫(yī)將睡眠障礙歸屬為“不寐”“不得眠”，認為“寐本乎陰，神其主也，神安則寐，神不安則不寐”[17]，并認為“心藏神，腦為元神之腑”“人之記憶，皆在腦中，小兒善忘者，腦未滿也；老人健忘者，腦漸空也”提示心神與腦神息息相關，“一處神明傷，兩處皆傷”暗示睡眠不足心主血脈功能不調，會累及腦功能及記憶受損[17]?；馃嶂啊⑸蠑_心神為失眠的病因，中醫(yī)驗方BYT中女貞子可去燥火，現(xiàn)代藥理發(fā)現(xiàn)其可用于治療神經炎、神經衰弱等癥[18]；墨旱蓮可滋補肝腎、涼血止血，與女貞子合用其滋陰效果較好，治療肝腎陰虛火旺癥；梔子可清熱瀉火、涼血、除煩而治療火熱上炎虛煩不眠；黃芩清熱燥濕，瀉火解毒，其善清中上焦?jié)駸岢裏┛?，為清熱佳品，甘草除調和藥味外，也可清熱解毒，方中諸藥配伍可清心、肝、肺、腎臟腑之熱，滋陰涼血、降虛火而助眠，且在本科室用于治療頑固性失眠，并取得較好療效。本研究發(fā)現(xiàn)BYT治療后，SD小鼠精神萎靡、反應遲鈍及狂躁等減輕，空間記憶學習能力提高，海馬神經細胞凋亡率、神經遞質釋放趨于正常，睡眠質量提高，提示BYT可能通過減少海馬神經細胞凋亡，調節(jié)神經遞質釋放，來改善SD小鼠學習記憶能力及睡眠質量。這為BYT的開發(fā)應用提供了一定參考，但其具體分子生物學機制還不甚清楚，本研究對此進行繼續(xù)探究。

學習記憶過程中，突觸可塑性及學習、記憶相關的PKA-Cβ入核后可使CREB磷酸化，通過與cAMP反應元件結合，調節(jié)神經營養(yǎng)因子等多種基因轉錄和表達，進而調控神經活動的傳導、神經細胞及突觸的生長、分化、再生及記憶的整合、維持[19]。另外腦源性神經營養(yǎng)因子(Brain Derived Neurotrophic Factor，BDNF)與TrkB結合，可調控突觸聯(lián)系，使獲得的記憶片段得以長期儲存[20]。本研究中SD小鼠海馬組織中PKA-Cβ、P-CREB/CREB、TrkB蛋白表達明顯低于正常對照組，預示PKA-Cβ/CREB/TrkB通路的衰減可能與SD小鼠學習記憶下降關系密切。Wnt可介導中樞神經系統(tǒng)海馬神經的再生，研究證實Wnt激活后，β-連環(huán)素可與轉錄因子復合體結合，驅動β-gal表達，促進海馬新生神經細胞新生并增加其數(shù)量，改善動物的學習記憶障礙[21-22]。本研究發(fā)現(xiàn)模型組小鼠海馬組織中Wnt、β-連環(huán)素及β-gal表達明顯降低，推測Wnt/β-連環(huán)素/β-gal通路抑制可能降低了海馬神經新生，可能為SD小鼠學習記憶功能降低的機制之一。而BYT低劑量組、BYT中劑量組、BYT高劑量組及陽性藥組小鼠海馬組織中學習記憶信號通路PKA-Cβ/CREB/TrkB及海馬神經細胞再生信號通路Wnt/β-連環(huán)素蛋白表達均明顯升高，表明BYT可能通過激活PKA-Cβ/CREB/TrkB信號通路及Wnt/β-連環(huán)素/β-gal信號通路蛋白表達，改善SD小鼠學習記憶功能。

綜上所述，BYT可調節(jié)神經遞質釋放，改善SD小鼠睡眠質量及學習記憶能力，可能通過激活PKA-Cβ/CREB/TrkB信號通路及Wnt/β-連環(huán)素/β-gal信號通路蛋白表達實現(xiàn)。但睡眠不足引起學習記憶損傷機制復雜，可能涉及其他機制共同參與，另外Wnt/β-連環(huán)素/β-gal神經細胞新生與學習記憶相關通路之間的聯(lián)系也需要繼續(xù)研究。