健脾益氣攝血方對(duì)原發(fā)免疫性血小板減少癥模型小鼠凝血功能的影響

嚴(yán) 香 趙 倩 陳信義 張雅月

(北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門醫(yī)院，北京，100700)

原發(fā)免疫性血小板減少癥(Primary Immune Thrombocytopenia，ITP)是一種自身免疫性疾病，發(fā)病機(jī)制尚未明確，目前認(rèn)為ITP的發(fā)病是由于體液免疫和細(xì)胞免疫介導(dǎo)的血小板過(guò)度破壞，以及巨核細(xì)胞數(shù)量和質(zhì)量異常，導(dǎo)致血小板清除增強(qiáng)和生成受損而導(dǎo)致血小板計(jì)數(shù)降低[1]。基于中醫(yī)基礎(chǔ)理論及辨證論治原則，脾臟能統(tǒng)攝血液在經(jīng)脈之中而不逸出脈外，因此ITP病因病機(jī)與脾氣虧虛、脾不統(tǒng)血關(guān)系密切，從而確定“從脾論治”ITP基本原則[2-3]，以健脾益氣攝血為治法，擬定健脾益氣攝血方。在前期研究中，我團(tuán)隊(duì)實(shí)驗(yàn)表明健脾益氣攝血方在升高ITP患者及動(dòng)物血小板數(shù)值、改善出血癥狀方面療效尚佳[4-5]，其效應(yīng)機(jī)制可能與調(diào)控凝血過(guò)程有關(guān)[6-7]。止血生理過(guò)程包括血管內(nèi)皮、血小板聚集黏附和凝血功能之間的復(fù)雜相互作用[8]。因此本研究從凝血角度出發(fā)，以出血程度、凝血酶原時(shí)間(Prothrombin Time,PT)、活化部分凝血活酶時(shí)間(Activated Partial Thromboplastin Time,APTT)、纖維蛋白原(Fibrinogen,FIB)為觀察指標(biāo)，探討健脾益氣攝血方對(duì)ITP模型小鼠凝血功能的影響，為ITP的中醫(yī)藥治療提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物 豚鼠100只，雌雄各半，體質(zhì)量250 g，許可證號(hào)：SCXK(陜)2012-001，購(gòu)于陜西省興平市天瑞實(shí)驗(yàn)動(dòng)物養(yǎng)殖場(chǎng)，普通環(huán)境飼養(yǎng)，室溫20～25 ℃，相對(duì)濕度50%～60%；BALB/c小鼠260只，雌雄各半，體質(zhì)量18～22 g，許可證號(hào):SCXK(陜)2014-002，購(gòu)于中國(guó)人民解放軍第四軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，無(wú)特定病原體(Specific Pathogen Free,SPF)級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)，室溫20～25 ℃，相對(duì)濕度50%～60%。本研究經(jīng)陜西省西安醫(yī)學(xué)院動(dòng)物倫理委員會(huì)審批(倫理審批號(hào)：XYLS2019069)。

1.1.2 藥物 潑尼松(上海晶純生化科技股份有限公司，貨號(hào)：P116562)。實(shí)驗(yàn)用中藥浸膏由西安星華藥物研究所按照中藥新藥藥學(xué)標(biāo)準(zhǔn)制備并提供，包括:非從脾論治浸膏(穿山龍、三七)。健脾益氣攝血浸膏(黃芪、黨參、茯苓、白術(shù)、阿膠、茜草、炙甘草)。

1.1.3 試劑與儀器 完全弗氏佐劑(Sigma-Aldrich，美國(guó)，批號(hào):SLBF2619V)，不完全弗氏佐劑(Sigma-Aldrich，美國(guó)，批號(hào):SLBH7317V)，生理鹽水(雙鶴藥業(yè)，批號(hào)：Y201407154W)，乙醚(Merck,美國(guó),批號(hào)：100930)；CA-1500型全自動(dòng)血液凝固分析儀(Sysmex，日本，型號(hào)：CA-1500型)，全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀(賽默飛科技公司，美國(guó)，型號(hào):Multiskan GO no.51119300)。

1.2 方法

1.2.1 分組與模型制備 取160只BALB/c小鼠，乙醚麻醉后，從小鼠心臟取全血，以乙二胺四乙酸二鈉(EDTA-Na2)抗凝，分離血小板并洗滌，用生理鹽水稀釋。取已分離的血小板分別與等量完全福氏佐劑和不完全福氏佐劑混合成油包水狀作抗原，以含完全福氏佐劑抗原于0周注射100只豚鼠足掌、背及皮下，至少4點(diǎn)；以含不完全福氏佐劑抗原分別于1、2、4周按上述相同部位與點(diǎn)數(shù)注射。第5周從豚鼠心臟取不抗凝全血，560×g，離心10 min后取上清液，即得血小板糖蛋白血清(Glycoprotein-antiplatelet Serum,GP-APS)，并貯存于-20 ℃冰箱待用。將APS從-20 ℃中取出，置56 ℃水浴30 min，用等量BALB/c小鼠紅細(xì)胞吸附至少2次，用生理鹽水稀釋成1∶4濃度APS備用[9]。從100只BALB/c小鼠尾靜脈取血，用全自動(dòng)血液分析儀檢測(cè)血小板計(jì)數(shù)，并隨機(jī)分為正常組、模型組、潑尼松組、非從脾論治組、健脾益氣攝血組5組，每組20只。除正常組按100 μL/20 g生理鹽水腹腔注射外，實(shí)驗(yàn)各組按100 μL/20 g劑量注射APS，1次/d至實(shí)驗(yàn)結(jié)束。用酶標(biāo)儀在450 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度(OD值)，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算相應(yīng)樣品濃度。依據(jù)病證結(jié)合模型辨識(shí)標(biāo)準(zhǔn)判定造模是否成功[10]。APS血清組OD值平均為0.300，空白孔OD值平均為0.163，相差約2倍(P<0.01)，造模成功。

1.2.2 給藥方法 造模成功后第8天，正常組、模型組小鼠給予生理鹽水0.1 mL/10 g體積灌胃，潑尼松組給予濃度為2 mg/mL潑尼松溶液0.1 mL/10 g灌胃，中藥組均按照0.1 mL/10 g體積灌胃給藥。

1.2.3 檢測(cè)指標(biāo)與方法

1.2.3.1 出血程度分級(jí) 參照中華醫(yī)學(xué)會(huì)血液病分會(huì)2020年頒布的指南中出血評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)，結(jié)合動(dòng)物實(shí)驗(yàn)特點(diǎn)，擬定出血程度分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)并進(jìn)行動(dòng)態(tài)觀察[11]。出血程度分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)：0級(jí)為無(wú)出血現(xiàn)象；Ⅰ級(jí)為注射部位輕度出血，其他部位有散在出血點(diǎn)；Ⅱ級(jí)為注射部位明顯出血，并見(jiàn)有其他部位瘀斑、瘀點(diǎn)；Ⅲ級(jí)為注射部位嚴(yán)重出血，皮膚大量瘀斑、瘀點(diǎn)，或皮膚發(fā)黑或破潰。注意在觀察出血程度時(shí)，要以出血面積與出血點(diǎn)密集程度描述，并關(guān)注出血部位、出血開(kāi)始時(shí)間、止血時(shí)間、出血色澤、形狀等。觀察時(shí)間點(diǎn)為第8天(用藥前)、第10天(用藥第2天)、第12天(用藥第4天)、第14天(用藥第6天)、第16天(用藥第8天)共5個(gè)時(shí)間點(diǎn)，從實(shí)驗(yàn)各組中隨機(jī)選擇10只小鼠動(dòng)態(tài)觀察出血程度變化情況。

1.2.3.2 全自動(dòng)血液分析儀檢測(cè)凝血功能 實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，各組隨機(jī)選取6只小鼠尾靜脈取血。用全自動(dòng)血液凝固分析儀檢測(cè)PT、APTT、FIB。

2 結(jié)果

2.1 出血程度觀察 在注射APS后第3天ITP模型小鼠皮下可見(jiàn)密集的鮮紅出血點(diǎn)，如腹部、四肢、耳緣處，部分瘀斑融合成片，持續(xù)時(shí)間3～4 d。見(jiàn)圖1。

圖1 模型小鼠出血情況

2.2 出血程度比較 給藥前，與正常組比較，各組出血程度顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；模型組、潑尼松組、非從脾論治組、健脾益氣攝血組組間比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，說(shuō)明注射GP-APS后各組小鼠均有相似程度的出血傾向，組間具有可比性。

藥物干預(yù)第2天，與正常組比較，模型組小鼠出血程度差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；模型組及潑尼松組、非從脾論治組、健脾益氣攝血組組間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

藥物干預(yù)第4天，與正常組比較，模型組小鼠出血程度差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與模型組比較，潑尼松組、非從脾論治組、健脾益氣攝血組小鼠出血程度開(kāi)始降低，表現(xiàn)出向0級(jí)與1級(jí)趨勢(shì)，但組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

藥物干預(yù)第6天，各組出血程度比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與模型組比較，潑尼松組、健脾益氣攝血組出血程度明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；與非從脾論治組比較，健脾益氣攝血組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

藥物干預(yù)第8天，各組小鼠出血程度組間比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；與模型組比較，潑尼松組、健脾益氣攝血組出血程度改善，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；與非從脾論治組比較，健脾益氣攝血組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表1。

表1 各組小鼠不同時(shí)間點(diǎn)出血程度比較(n=10)

2.3 各組PT、APTT和FIB比較 與正常組比較，模型組小鼠PT、APTT顯著升高，F(xiàn)IB水平下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。與模型組比較，潑尼松組與健脾益氣攝血組PT、APTT明顯下降，F(xiàn)IB上升，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)，非從脾論治組PT、APTT下降，F(xiàn)IB上升，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。3)與潑尼松組比較，健脾益氣攝血組PT、APTT、FIB差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。與非從脾論治組比較，健脾益氣攝血組PT、APTT表達(dá)明顯下降，F(xiàn)IB水平上升，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)。見(jiàn)表2。

表2 各組小鼠PT、APTT和FIB比較

3 討論

ITP是一種自身免疫性疾病，其特征是由于血小，清除增強(qiáng)和生成受損而導(dǎo)致血小板計(jì)數(shù)降低。ITP的臨床表現(xiàn)因患者而異，出血是最常見(jiàn)的表現(xiàn)，如皮膚、口腔、胃腸道出血或顱內(nèi)出血等[12-13]。在中醫(yī)學(xué)中，ITP屬“血證”“虛勞”“紫斑”等范疇，現(xiàn)統(tǒng)一命名為“紫癜病”[14]。明代御醫(yī)薛立齋是最早提出“脾統(tǒng)血”思想的醫(yī)家，他指出：“心主血，肝藏血，亦能統(tǒng)攝于脾，補(bǔ)脾與胃，血自生矣?！盵15]“脾主統(tǒng)血”是指脾有統(tǒng)領(lǐng)與固攝血液在脈道中常態(tài)運(yùn)行，不逸出脈外的生理功能，其內(nèi)涵實(shí)質(zhì)是“脾氣健旺，運(yùn)化有?！薄７粗词恰捌⒉唤y(tǒng)血”的病理現(xiàn)象，其發(fā)病機(jī)制是脾氣虛弱進(jìn)一步加重或惡化的病理過(guò)程或結(jié)局，外在表象是“慢性出血”伴隨脾氣虛弱癥狀。中醫(yī)學(xué)中“血”是營(yíng)養(yǎng)人體臟器組織，維持生命活動(dòng)的紅色精微物質(zhì)，而通過(guò)現(xiàn)代醫(yī)學(xué)手段觀測(cè)，血是指人或動(dòng)物體內(nèi)循環(huán)系統(tǒng)的不透明液體，主要包括血漿、血細(xì)胞、凝血因子等成分。團(tuán)隊(duì)前期研究表明健脾益氣攝血方能夠改善ITP患者出血癥狀，提高血小板計(jì)數(shù)，調(diào)控血管活性因子[6-7]，提示上述血液成分可能是脾統(tǒng)血功能發(fā)揮的對(duì)象。因此擬定健脾益氣攝血方，驗(yàn)證“從脾論治”ITP的基本治法。

方中黃芪性溫味甘，歸脾、肺經(jīng)，功效健脾益氣固表，此外臨床所見(jiàn)患者多表現(xiàn)為身體下部出血，故亦取其益氣升提之長(zhǎng)，為君藥。黨參、茯苓、白術(shù)3藥為臣，取四君子湯之意，加強(qiáng)組方健脾益氣之力。茜草味苦性寒，歸肝經(jīng)，可祛瘀通經(jīng)、涼血止血，阿膠味甘平，歸肺、肝、腎經(jīng)，具有補(bǔ)血止血、滋陰潤(rùn)燥的功效；二者共為佐藥，既增加止血作用，又可防止君臣補(bǔ)益太過(guò)而致血脈瘀阻或血熱妄行，有攝血不留瘀、補(bǔ)血不動(dòng)血之效。再加一味炙甘草為使藥，益氣和中、調(diào)和諸藥[16-17]。陽(yáng)性對(duì)照方面，潑尼松作為治療ITP的一線用藥，具有抗炎、調(diào)節(jié)免疫的作用[18]；非從脾論治組選用具有化瘀止血、活血通絡(luò)功效的穿山龍、三七[19-20]。本研究中除正常組外，各組小鼠造模后出現(xiàn)相似程度的出血，藥物干預(yù)第6天及第8天，與模型組比較，潑尼松組、健脾益氣攝血組出血程度明顯下降，提示潑尼松及健脾益氣攝血方具有一定優(yōu)勢(shì)。

凝血過(guò)程是一種復(fù)雜的級(jí)聯(lián)反應(yīng)[21]。血管內(nèi)皮細(xì)胞受損后，表達(dá)并釋放組織因子(Tissue Factor,TF)，啟動(dòng)外源性凝血途徑；基底膠原暴露，激活凝血因子Ⅻ(FⅫ)，啟動(dòng)內(nèi)源性凝血途徑。2種途徑激活后，凝血過(guò)程進(jìn)入共同途徑，生成凝血酶。在凝血酶的作用下，纖維蛋白原形成穩(wěn)定交聯(lián)的纖維蛋白，以完成凝血過(guò)程。在研究中選取能夠代表凝血功能的PT、APTT、FIB3個(gè)關(guān)鍵指標(biāo)，其中，PT主要反映外源性凝血系統(tǒng)狀態(tài)；APTT反映內(nèi)源性凝血系統(tǒng)狀態(tài)；FIB又稱凝血因子I(FI)，是凝血過(guò)程的中心蛋白質(zhì)[22]。本研究中，模型組小鼠PT、APTT顯著升高，F(xiàn)IB水平下降，提示ITP模型小鼠可能存在凝血功能異常。經(jīng)潑尼松及健脾益氣攝血方干預(yù)后，小鼠PT、APTT明顯下降，F(xiàn)IB上升，非從脾論治組無(wú)明顯差異，提示潑尼松及健脾益氣攝血方能改善ITP小鼠凝血功能，從脾論治ITP具有一定優(yōu)勢(shì)。

綜上所述，健脾益氣攝血方能明顯改善ITP小鼠出血程度及凝血功能，充分說(shuō)明“從脾論治的”有效性，提示凝血因子可能是脾主統(tǒng)血生理功能的物質(zhì)基礎(chǔ)。但本研究樣本量較少，今后將通過(guò)擴(kuò)大樣本量進(jìn)行驗(yàn)證；另外目前只初步探索了健脾益氣攝血方對(duì)ITP模型小鼠凝血功能的影響，其具體調(diào)控機(jī)制有待進(jìn)一步研究。