基于液質(zhì)聯(lián)用法測定烏頭堿類生物堿在大鼠體內(nèi)藥代動力學(xué)研究

黃 鶴 陳騰飛 李 晗 李 林 高云航 宋 玲 侯紅平 張廣平 楊 紅 葉祖光

(1 遼寧師范大學(xué)，大連，116000； 2 中國中醫(yī)科學(xué)院，北京，100700)

草烏為毛茛科植物北烏頭(AconitumkusnezoffiiReichb.)的干燥塊根。草烏具有祛風(fēng)除濕、溫經(jīng)止痛的功效，可用于風(fēng)寒濕痹、關(guān)節(jié)疼痛、心腹冷痛、寒疝作痛及麻醉止痛，有大毒[1]。草烏中烏頭堿是其主要毒性成分。制草烏為草烏的炮制加工品，由于其毒性沒有生品大，常在臨床中與其他藥物配伍使用[2]。有研究表明，其具有鎮(zhèn)痛、抗炎、強(qiáng)心、抗心律失常、抗腫瘤、降血糖、免疫調(diào)節(jié)等多種藥理作用[3-7]，臨床應(yīng)用廣泛。由于烏頭類生物堿治療劑量和中毒劑量接近，用量過多可能很容易引起中毒[8-12]。

中醫(yī)藥和蒙醫(yī)藥理論認(rèn)為草烏經(jīng)炮制為制草烏后可使其毒性主要成分減少，用于臨床治療[13-14]。這就需要建立更靈敏的方法測出其主要毒性成分的濃度變化?；谏鲜鲈?，本實驗建立了一個靈敏度較高的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(Liquid Chromatography-mass Spectrometry/Mass Spectrometry,LC-MS/MS)方法，同時測定草烏炮制后制草烏中的烏頭堿、次烏頭堿、苯甲酰烏頭原堿3種主要毒性成分的濃度，此方法簡單方便，靈敏度高，能夠用于血漿中極低濃度的烏頭堿、次烏頭堿、苯甲酰烏頭原堿的檢測。

1 材料

1.1 動物 選取無特定病原體(Specific Pathogen Free,SPF)級雄性SD大鼠，體質(zhì)量180～200 g，購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，動物許可證號SCXK(京)2016-0006。大鼠于動物房常規(guī)飼養(yǎng)，動物房通風(fēng)良好，定期消毒。本實驗所進(jìn)行的所有相關(guān)操作均在中國中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所動物倫理委員會的批準(zhǔn)下進(jìn)行(倫理審批號：20172001)。大鼠飼養(yǎng)條件為12 h明暗交替，溫度為(23±1)℃，濕度為(50±15)%，自主飲水及進(jìn)食。

1.2 儀器 液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀，帶有自動進(jìn)樣器和柱溫箱(SCIEX公司，美國，型號：ExionLC-Qtrap 5500)；離心機(jī)(Eppendorf公司，德國，型號：Centrifuge 5254R)；電子天平(Mettler-Toledo公司，德國，型號：MS105DU)；漩渦儀(SCIENTIFIC INDUSTRIES公司，美國，型號：Vortex-genie2 G560E)；真空濃縮儀(Christ公司，德國，型號：RVC 2-18 CDplus)。

1.3 試藥 烏頭堿對照品(Sigma-Aldrich Co.公司，美國，含量：95.0%，批號：073M4401V)；次烏頭堿(成都普菲德生物技術(shù)有限公司，含量：98.0%，批號：19070507)；苯甲酰烏頭原堿(成都普菲德生物技術(shù)有限公司，含量：98.7%，批號：19101603)；內(nèi)標(biāo)小檗堿(上海麥克林生化科技有限公司，含量：99.0%，批號：C11079944)；甲醇(Merck，德國，色譜純，批號：I0944807813)；乙腈(Merck，德國，色譜純，批號：JA066030)；甲酸(ROE SCIENTIFIC，美國，色譜純，批號：17M8207)；異丙醇(Honeywell，德國，色譜純，批號：SAJG1H)；純凈水(中國杭州娃哈哈集團(tuán)有限公司，批號：202006121119GQ)；制草烏購于內(nèi)蒙古蒙藥股份公司，由遼寧中醫(yī)藥大學(xué)康延國教授鑒定。

2 方法

2.1 色譜與質(zhì)譜條件 色譜條件：色譜柱為島津Shim-pack Velox SP-C18 LC Column(100 mm×2.1 mm，2.7 μm)；柱溫40 ℃；自動進(jìn)樣器溫度為6 ℃；進(jìn)樣體積10 μL；洗針液為甲醇∶乙腈∶異丙醇=1∶1∶1；流動相A∶水(0.05%甲酸)；流動相B∶甲醇∶乙腈=1∶1(0.05%甲酸)；流速0.3 mL/min；分析時間6 min。洗脫梯度見表1。

表1 梯度洗脫

質(zhì)譜條件：離子源為ESI，正離子模式，氣簾氣40 psi，碰撞氣6 psi，噴霧電壓5 500 V，輔助氣加熱溫度500 ℃，輔助氣1為50 psi，輔助氣2為50 psi(Pounds Per Square Inch，145 psi=1 MPa)，掃描方式為選擇反應(yīng)監(jiān)測(MRM)方式。用于定量分析的離子對分別為m/z 646.3/586.2(烏頭堿)，m/z 616.3/556.3(次烏頭堿)，m/z 604.3/554.1(苯甲酰烏頭原堿)和m/z 337.2/321.0(小檗堿，內(nèi)標(biāo))。

2.2 溶液配制

2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線工作溶液與質(zhì)控工作溶液 分別精密稱取烏頭堿、次烏頭堿、苯甲酰烏頭原堿標(biāo)準(zhǔn)品約10 mg，各置10 mL量瓶中，加甲醇超聲溶解后定容至刻度，得濃度為1 mg/mL的烏頭堿、次烏頭堿、苯甲酰烏頭原堿儲備液。依次取儲備液100、100、200 μL，加甲醇混合后，再用甲醇稀釋，得烏頭堿、次烏頭堿、苯甲酰烏頭原堿濃度分別為1、1、2 μg/mL混合工作溶液MIX0。用甲醇將其逐級稀釋成烏頭堿、次烏頭堿濃度分別為500、200、50、20、5、1、0.5 ng/mL，苯甲酰烏頭原堿濃度為1 000、400、100、40、10、2、1 ng/mL的系列標(biāo)準(zhǔn)曲線工作溶液，以及烏頭堿、次烏頭堿濃度分別為375、50、1 ng/mL，苯甲酰烏頭原堿濃度為750、100、2 ng/mL的質(zhì)量控制(Quality Control，QC)工作溶液，-80 ℃冰箱保存。

2.2.2 含內(nèi)標(biāo)復(fù)溶液 精密稱取小檗堿標(biāo)準(zhǔn)品約10 mg，置10 mL量瓶中，加甲醇超聲溶解后定容至刻度，配制成濃度為1 mg/mL的小檗堿儲備液。然后將儲備液用50%甲醇(水)稀釋成小檗堿濃度為0.5 ng/mL的含內(nèi)標(biāo)復(fù)溶液。

2.3 給藥方法與血漿樣品采集 取SD雄性大鼠6只，給藥前禁食12 h，自由飲水。以1.016 9 g/kg的劑量經(jīng)口給與制草烏混懸液，給藥體積1 mL每100 g體質(zhì)量，給藥前采集空白血，給藥后于5、15、30、45 min、1、2、4、6、8、24 h眼眶采血約0.25 mL，收集于肝素化處理的離心管中，采集的血液于4 ℃、9 391×g，離心10 min，分離血漿，-80 ℃冰箱保存。

2.4 血漿樣品處理 精密吸取50 μL大鼠血漿樣品，加入200 μL甲醇-乙腈混合溶液(1∶1，v/v)，渦旋5 min，超聲1 min，4 ℃、13 523×g，離心5 min，取上清200 μL，48 ℃、271×g減壓濃縮至干燥，加入100 μL含內(nèi)標(biāo)復(fù)溶液，渦旋5 min，超聲1 min，4 ℃、13 523×g，離心5 min，取上清進(jìn)樣。

2.5 方法學(xué)評價

2.5.1 專屬性 取大鼠空白血漿，復(fù)溶液為50%甲醇(水)，其他按“2.4 血漿樣品處理”方法處理，得空白色譜；取低濃度QC樣品，按“2.4 血漿樣品處理”方法處理，得含藥血漿色譜圖；取給藥后大鼠血漿樣品，同上操作，得色譜圖。

2.5.2 線性范圍和定量下限 取系列濃度標(biāo)曲工作溶液5 μL，分別加入45 μL空白血漿稀釋10倍，得烏頭堿、次烏頭堿血漿濃度分別為50、20、5、2、0.5、0.1、0.05 ng/mL，苯甲酰烏頭原堿血漿濃度為100、40、10、4、1、0.2、0.1 ng/mL的標(biāo)曲樣品溶液，按“2.4 血漿樣品處理”方法處理，以待測化合物峰面積與內(nèi)標(biāo)峰面積之比為縱坐標(biāo)(Y)，以待測化合物濃度為橫坐標(biāo)(X)，用加權(quán)最小二乘法計算回歸方程，回歸方程及線性范圍。

2.5.3 殘留 運(yùn)行完標(biāo)曲樣品溶液中最高的濃度樣品后，進(jìn)樣1個空白樣品，至少考察3次。比較空白樣品在分析物和內(nèi)標(biāo)相同保留時間處有無干擾峰存在，或者干擾峰峰面積不大于分LLOQ峰面積的20%和內(nèi)標(biāo)峰面積的5%。運(yùn)行完標(biāo)曲樣品溶液中最高的濃度樣品后，進(jìn)樣1個空白樣品，至少考察3次。比較空白樣品在分析物和內(nèi)標(biāo)結(jié)果。

2.5.4 精密度與準(zhǔn)確度 取低、中、高QC工作溶液各5 μL，分別加入45 μL空白血漿稀釋10倍，得烏頭堿、次烏頭堿濃度分別為0.1、5、37.5 ng/mL，苯甲酰烏頭原堿濃度為0.2、10、75 ng/mL的QC樣品溶液，按“2.4 血漿樣品處理”方法處理，在日內(nèi)和日間(3 d)對低、中、高濃度的QC樣品進(jìn)行分析，每個濃度平行6個樣品，考察日內(nèi)、日間精密度和準(zhǔn)確度。

2.5.6 稀釋可靠性 在基質(zhì)中加入高于定量上限濃度分析物，并用空白基質(zhì)稀釋樣品，按“2.4 血漿樣品處理”方法處理，并進(jìn)行測定。

2.5.7 樣品穩(wěn)定性 取低、高QC工作溶液各5 L，分別加入45 μL空白血漿稀釋10倍，分別于室溫放置2 h、反復(fù)凍融3次、-80 ℃放置30 d后，按“2.4 血漿樣品處理”方法處理，考察穩(wěn)定性情況，同時考察自動進(jìn)樣器放置24 h的穩(wěn)定性。低、高濃度每個考察條件均各平行6個樣品，結(jié)果。

2.6 藥代動力學(xué) 取血漿樣品，按“2.4 血漿樣品處理”方法處理，應(yīng)用上面建立的LC-MS/MS法測定大鼠血漿中烏頭堿、次烏頭堿、苯甲酰烏頭原堿的含量，采用DAS 3.2.8軟件，進(jìn)行藥代動力學(xué)參數(shù)的計算。

3 結(jié)果

3.1 方法學(xué)評價

3.1.1 專屬性 烏頭堿、次烏頭堿、苯甲酰烏頭原堿、小檗堿(內(nèi)標(biāo))保留時間分別為3.04、3.04、2.75、2.75 min。結(jié)果顯示，血漿總內(nèi)源性物質(zhì)不干擾測定，專屬性良好。見圖1。

圖1 典型LC-MS/MS色譜圖

3.1.2 線性范圍和定量下限 結(jié)果顯示，烏頭堿、次烏頭堿和苯甲酰烏頭原堿在各自線性范圍內(nèi)均呈現(xiàn)良好的線性相關(guān)性，定量下限(LowerLlimit of Quantitation，LLOQ)分別為0.05、0.05、0.1 ng/mL，日內(nèi)精密度相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(Relative Standard Deviation，RSD)分別為3.86%、3.60%、9.04%，準(zhǔn)確度相對誤差(Relative Error，RE)分別為97.00%、95.67%、98.00%。見表2。

表2 大鼠血漿樣品中烏頭堿、次烏頭堿及苯甲酰烏頭原堿回歸曲線方程及線性范圍

3.1.3 殘留 結(jié)果表明該方法的殘留效應(yīng)符合要求。

3.1.4 精密度與準(zhǔn)確度 此方法的精密度和準(zhǔn)確度均符合要求。見表3。

表3 大鼠血漿樣品中烏頭堿、次烏頭堿、苯甲酰烏頭原堿的精確度與準(zhǔn)確度(n=6)

3.1.5 基質(zhì)效應(yīng) 結(jié)果表明，基質(zhì)效應(yīng)對樣品測定的影響較小。見表4。

表4 大鼠血漿樣品中烏頭堿、次烏頭堿、苯甲酰烏頭原堿的相對基質(zhì)效應(yīng)(n=6)

3.1.6 稀釋可靠性 稀釋10倍后，準(zhǔn)確度和準(zhǔn)確度良好，測定結(jié)果均可靠。見表5。

表5 大鼠血漿高濃度樣品中烏頭堿、次烏頭堿、苯甲酰烏頭原堿的稀釋可靠性(n=6)

3.1.7 樣品穩(wěn)定性 結(jié)果顯示，各濃度質(zhì)控樣品的準(zhǔn)確度在87.95%～112.33%范圍內(nèi)，穩(wěn)定性良好。見表6。

表6 大鼠血漿樣品中烏頭堿、次烏頭堿、苯甲酰烏頭原堿穩(wěn)定性考察(n=6)

3.2 藥代動力學(xué) 見表7、見圖2。

表7 給藥制草烏后大鼠血漿中烏頭堿、次烏頭堿、苯甲酰烏頭原堿的藥代動力學(xué)參數(shù)

圖2 給藥制草烏后大鼠血漿中烏頭堿、次烏頭堿、苯甲酰烏頭原堿的藥時曲線

4 討論

烏頭類中藥主要成分為烏頭堿、次烏頭堿等雙酯型生物堿，以及苯甲酰烏頭原堿等單酯型生物堿[15]。這些成分既是抗炎的有效成分，又是主要毒性成分[12]。在蒙醫(yī)藥上研究發(fā)現(xiàn)，生草烏經(jīng)過炮制后會減少其毒性作用，從而發(fā)揮其藥效作用。經(jīng)過炮制后，雙酯型烏頭堿類成分的含量降低，檢測難度增加，需要更加靈敏的方法才能進(jìn)行血漿樣品的檢測，因此，本實驗建立了高靈敏度的LC-MS/MS分析方法，烏頭堿、次烏頭堿的定量下限為0.05 ng/mL，苯甲酰烏頭原堿的定量下限為0.1 ng/mL，能夠滿足血漿中3種成分的測定要求。在此基礎(chǔ)上采用建立的方法，對制草烏給藥后大鼠血漿中微量的烏頭堿、次烏頭堿及苯甲酰烏頭原堿進(jìn)行了測定。