仙靈骨葆膠囊治療絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥的生物信息學(xué)和網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析和實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證

柴 爽 楊巖冰 馬江濤 郭云鵬 滕軍燕 秦 娜 張 虹

(河南省洛陽正骨醫(yī)院/河南省骨科醫(yī)院，鄭州，450016)

骨質(zhì)疏松癥(Postmenopausal Osteoporosis，PMOP)是一種以骨量低下，骨組織微結(jié)構(gòu)損壞，導(dǎo)致骨脆性增加，易發(fā)生骨折為特征的全身性骨病。PMOP分為原發(fā)性和繼發(fā)性兩大類，其中絕經(jīng)后PMOP占比最大。調(diào)查顯示，我國40～49歲人群PMOP患病率為3.2%，50歲以上人群PMOP患病率為19.2%[1]。世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計(jì)表明絕經(jīng)后PMOP一般發(fā)生在女性絕經(jīng)后5～10年內(nèi)，在世界范圍內(nèi)，年齡超過50歲的女性中，每2名女性就有1名會(huì)受到骨質(zhì)疏松性骨折的影響[2-3]。

PMOP最嚴(yán)重的后果是骨質(zhì)疏松性骨折，至2050年我國的骨質(zhì)疏松性骨折患病數(shù)可能高達(dá)599萬人[4]。因此，重視PMOP的防治具有重大意義。中醫(yī)藥防治PMOP歷史悠久[5]，仙靈骨葆膠囊(Xian-ling-gu-bao Capsule，XLGB，國藥準(zhǔn)字Z20025337)作為PMOP類處方藥品被列入《國家基本藥物目錄》，被推薦用于絕經(jīng)后PMOP[1]和老年P(guān)MOP[6]。XLGB藥物組成包括淫羊藿、續(xù)斷、補(bǔ)骨脂、熟地黃、丹參和知母，具有滋補(bǔ)肝腎，活血通絡(luò)，強(qiáng)筋壯骨之功效。本研究采用生物信息學(xué)和網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析XLGB治療絕經(jīng)后PMOP的可能機(jī)制，并進(jìn)行動(dòng)物實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

1 資料與方法

1.1 一般資料

1.1.1 數(shù)據(jù)庫 高通量基因表達(dá)(Gene Expression Omnibus，GEO)數(shù)據(jù)庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)、中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺(tái)(Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP)(http://tcmspw.com/tcmsp.php)[7]和BATMAN-TCM數(shù)據(jù)庫(http://bionet.ncpsb.org/batman-tcm/)[8]。

1.2 方法

1.2.1 GEO芯片數(shù)據(jù)分析絕經(jīng)后PMOP相關(guān)靶點(diǎn) 首先從GEO數(shù)據(jù)庫中以“osteoporosis”為關(guān)鍵詞，條目類型選擇“Series”、研究類型選擇“Expression profiling by array”,種屬選擇“Homo sapiens”進(jìn)行搜索，得到GSE56815的芯片數(shù)據(jù)及其對(duì)應(yīng)的分析平臺(tái)文件GPL96。該芯片數(shù)據(jù)對(duì)具有高低不同骨密度的80名絕經(jīng)前后女性血液單核細(xì)胞進(jìn)行基因測序。其次利用Perl軟件(V5.30.0)對(duì)芯片數(shù)據(jù)矩陣進(jìn)行注釋及分組，數(shù)據(jù)注釋時(shí)將基因探針名改為相應(yīng)的基因名，數(shù)據(jù)分組時(shí)將絕經(jīng)前后高骨密度樣本視為正常組40例，絕經(jīng)前后低骨密度樣本視為病例組40例。最后運(yùn)用R軟件及l(fā)imma包和pheatmap包，對(duì)數(shù)據(jù)矩陣進(jìn)行矯正及差異分析，得到GEO數(shù)據(jù)庫差異火山圖。其中篩選條件P值<0.05,差異倍數(shù)(Fold Change，F(xiàn)C)>1。

1.2.2 XLGB中活性成分的篩選及靶點(diǎn)預(yù)測 本研究首先檢索可供查詢中藥、中藥活性成分及相應(yīng)靶點(diǎn)等信息的TCMSP和BATMAN-TCM數(shù)據(jù)庫獲得補(bǔ)骨脂、淫羊藿、續(xù)斷、熟地黃、丹參、知母6味中藥的活性成分及相應(yīng)靶點(diǎn)。其中篩選條件為口服生物利用度(Oral Bioavailability，OB)≥30%，藥物類藥性(Drug Likeness,DL)≥0.18[9]。然后采用Perl軟件將中藥活性成分與相應(yīng)靶點(diǎn)進(jìn)行一一映射，并為篩選出的靶點(diǎn)添加基因名。

1.2.3 XLGB調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建 將絕經(jīng)后PMOP疾病靶點(diǎn)和XLGB活性成分靶點(diǎn)利用Perl軟件進(jìn)行一一映射，得到中藥活性成分與疾病的共同靶點(diǎn)，然后利用Cytoscape軟件(V3.7.1)進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)可視化，得到活性成分-靶蛋白調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。其中節(jié)點(diǎn)的類型有活性成分、靶點(diǎn)。

1.2.4 蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建和關(guān)鍵靶點(diǎn)篩選 蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用(Protein-protein Interaction，PPI)網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建主要利用Cytoscape軟件的Bisogenet插件，關(guān)鍵靶點(diǎn)篩選利用Cytoscape軟件的CytoNCA插件。將1.2.3得到的活性成分與疾病的交集靶點(diǎn)利用Cytoscape軟件的Bisogenet插件繪制PPI網(wǎng)絡(luò)。由于所得PPI網(wǎng)絡(luò)龐大，因此利用Cytoscape軟件的CytoNCA插件進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治?，以便篩選關(guān)鍵靶點(diǎn)。其中篩選條件為自由度(Degree，DC)>61，中心中介性(Betweenness，BC)>600[9]。“節(jié)點(diǎn)”(Node)表示基因，“邊”(Edge)表示基因之間的相互關(guān)系，連接邊越多的節(jié)點(diǎn)，表明這個(gè)節(jié)點(diǎn)在網(wǎng)絡(luò)中越重要。

1.2.5 XLGB活性成分和疾病共同靶點(diǎn)的富集分析 利用R語言計(jì)算1.3得到的XLGB活性成分與絕經(jīng)后PMOP的共同靶點(diǎn)，得到基因本體(Gene Ontology，GO)生物過程富集分析和京都基因與基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG)通路富集分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。然后利用Cytoscape軟件將共同靶點(diǎn)和顯著富集的KEGG通路進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)可視化分析。GO功能富集分析主要包括生物過程(Biological Process,BP)，細(xì)胞組分(Cellular Component，CC)和分子功能(Molecular Function，MF)3部分。

1.3 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證

1.3.1 動(dòng)物 無特定病原體(Specific Pathogen Free,SPF)級(jí)12周齡雌性SD大鼠32只，購自河南省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，合格證號(hào)SCXK(豫)2017-0001。所有實(shí)驗(yàn)方案均經(jīng)河南省洛陽正骨醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.3.2 藥物 XLGB(國藥集團(tuán)同濟(jì)堂制藥有限公司，國藥準(zhǔn)字Z20025337)，戊酸雌二醇片(拜耳醫(yī)藥保健有限公司，國藥準(zhǔn)字J20171038)

1.3.3 試劑與儀器 BCA蛋白濃度測定試劑盒、Western及免疫沉淀裂解液(上海碧云天生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：P0010、P0013B)，大鼠血清活性氧檢測試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：S003S)，TUNEL試劑盒(Roche，瑞士，批號(hào)：11684817910)，B細(xì)胞淋巴瘤-2(B-cell-2,Bcl-2)和Bcl-2對(duì)抗殺手蛋白(Bcl-2-antagonist/killer Protein，Bak)抗體(CST，美國，批號(hào)：2870和12105)，β-actin抗體、羊抗兔二抗和羊抗鼠二抗(武漢三鷹生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：20536-1-AP、SA00001-2-500和SA00001-1-500)。

1.3.4 分組與模型制備 將32只大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組，模型組，XLGB組，戊酸雌二醇組4組，每組8只，采用去卵巢法造模。

1.3.5 給藥方法 造模術(shù)后1個(gè)月灌胃給藥，給藥劑量按照人與大鼠體表面積折算，戊酸雌二醇組給藥劑量為0.104 mg/kg，XLGB組給藥劑量為0.25 g/kg，假手術(shù)組和模型組給予等體積生理鹽水，灌胃3個(gè)月后收集標(biāo)本。

1.3.6 檢測指標(biāo)與方法 檢測大鼠腰椎骨密度，取大鼠血清檢測活性氧水平，取右側(cè)股骨遠(yuǎn)端進(jìn)行TUNEL染色，左側(cè)股骨遠(yuǎn)端提取總蛋白，采用蛋白質(zhì)免疫印跡法檢測Bcl-2、Bax表達(dá)。

2 結(jié)果

2.1 PMOP靶點(diǎn)的篩選 利用GEO芯片數(shù)據(jù)，進(jìn)行絕經(jīng)前后高骨密度樣本組和絕經(jīng)前后低骨密度樣本組基因的差異表達(dá)分析，共發(fā)現(xiàn)883個(gè)基因存在組間差異表達(dá)，其中表達(dá)上調(diào)基因424個(gè)，表達(dá)下調(diào)基因459個(gè)。見圖1。

圖1 差異表達(dá)基因的火山圖

2.2 XLGB活性成分的篩選及靶蛋白預(yù)測 共獲得119種活性成分，其中淫羊藿活性成分23種、續(xù)斷活性成分8種、補(bǔ)骨脂活性成分6種、熟地黃活性成分2種、丹參活性成分65種、知母活性成分15種。共收集活性成分所對(duì)應(yīng)的靶蛋白1 734種。

2.3 XLGB活性成分-共同靶點(diǎn)調(diào)控網(wǎng)絡(luò) 將PMOP靶點(diǎn)與XLGB活性成分對(duì)應(yīng)的靶蛋白取交集后得到26個(gè)共同靶點(diǎn)，所對(duì)應(yīng)的XLGB中活性成分共61種。其中，淫羊藿活性成分7種、續(xù)斷活性成分1種、補(bǔ)骨脂活性成分3種、丹參活性成分43種、知母活性成分3種，多味中藥(2味及以上)共有的活性成分4種。見圖2。

圖2 XLGB活性成分-靶蛋白調(diào)控網(wǎng)絡(luò)

2.4 共同靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建和關(guān)鍵靶點(diǎn)篩選 共得到3 916個(gè)節(jié)點(diǎn)和69 974個(gè)邊，這表明XLGB可能影響3 916個(gè)與PMOP相關(guān)的基因，而這3 916個(gè)基因之間可以產(chǎn)生69 974種直接或間接的相互作用。設(shè)置DC>61，BC>600，得到152個(gè)節(jié)點(diǎn)和3 832個(gè)邊。表明XLGB可能影響與PMOP相關(guān)的152個(gè)基因。見圖3。

圖3 XLGB調(diào)控PMOP的關(guān)鍵靶點(diǎn)

2.5 XLGB活性成分和疾病共同靶點(diǎn)的富集分析 如圖4所示，顯著富集到BP的GO條目有調(diào)控結(jié)合與負(fù)調(diào)控結(jié)合，細(xì)胞氧化應(yīng)激反應(yīng)，對(duì)營養(yǎng)水平的反應(yīng)，調(diào)控膜電位，巨噬細(xì)胞源性泡沫細(xì)胞分化，泡沫細(xì)胞分化，興奮性突觸后電位，神經(jīng)元死亡等。

圖4 XLGB活性成分和疾病共同靶標(biāo)的基因本體論

顯著富集到CC的GO條目有分泌性顆粒、胞質(zhì)囊腔、囊腔、肽酶復(fù)合物、膜筏、膜微結(jié)構(gòu)域、膜區(qū)、紡錘體、特殊顆粒等。顯著富集到MF的GO條目有蛋白激酶C結(jié)合、輔因子結(jié)合、BH域結(jié)合、死亡域結(jié)合、酰胺結(jié)合、硫化物結(jié)合、脂肪酰輔酶A結(jié)合、脂肪酸衍生物結(jié)合、膽固醇結(jié)合等。如圖5所示，顯著富集的信號(hào)通路包括細(xì)胞凋亡信號(hào)通路，破骨細(xì)胞分化信號(hào)通路，cAMP信號(hào)通路，MAPK信號(hào)通路，細(xì)胞衰老信號(hào)通路，cGMP-PKG信號(hào)通路，VEGF信號(hào)通路，壽命調(diào)節(jié)信號(hào)通路，內(nèi)分泌抵抗信號(hào)通路，HIF-1信號(hào)通路等。然后，利用，共有15個(gè)共同靶點(diǎn)通過調(diào)控13個(gè)信號(hào)通路來影響PMOP的發(fā)生。其中，AKT1、JUN、NFKB1，NFKBIA、PPP3CA、BAX等靶點(diǎn)的作用較大。見圖6。

圖5 XLGB活性成分和疾病共同靶點(diǎn)的KEGG通路富集分析

圖6 XLGB活性成分-信號(hào)通路網(wǎng)絡(luò)

2.6 XLGB對(duì)去卵巢大鼠細(xì)胞凋亡的影響 綜合上述分析，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)重點(diǎn)關(guān)注XLGB對(duì)PMOP細(xì)胞凋亡的影響。如表1所示，腰椎骨密度結(jié)果顯示2種藥物干預(yù)后，均可明顯改善去卵巢引起的骨密度降低(P<0.05)，與假手術(shù)組比較，OVX組活性氧水平顯著升高(P<0.05)，藥物干預(yù)后，戊酸雌二醇組血清雌激素水平有所下降，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，XLGB組活性氧水平明顯降低(P<0.05)。

表1 XLGB對(duì)骨密度、血清活性氧的影響

對(duì)股骨遠(yuǎn)端骨組織進(jìn)行TUNEL染色及凋亡率測定，模型組TUNEL陽性細(xì)胞增多，藥物干預(yù)后各組TUNEL陽性細(xì)胞顯著減少(P<0.05)。模型組Bcl-2水平降低(P<0.05)，Bax升高(P<0.05)。藥物干預(yù)后，與模型組比較，XLGB組和戊酸雌二醇組Bcl-2水平顯著增加，Bak水平顯著降低(P<0.05)。見圖7。

圖7 仙靈骨葆膠囊對(duì)細(xì)胞凋亡的影響

3 討論

中醫(yī)學(xué)將PMOP歸屬為“骨痿”范疇，最新的中醫(yī)藥專家共識(shí)認(rèn)為PMOP主要是由于絕經(jīng)后婦女腎精不足等因素導(dǎo)致骨失滋養(yǎng)的全身性慢性骨骼疾病[1]，是一種與增齡相關(guān)的疾病。女子七七之后，人的體質(zhì)特點(diǎn)以任脈虛，太沖脈衰少，精少，腎臟衰，天癸竭之“虛”象和地道不通，形體皆極之“瘀”象為主，此時(shí)發(fā)為本病多為本虛標(biāo)實(shí)之證，病變臟腑為脾、肝、腎，氣滯血瘀為其表證。醫(yī)家對(duì)本病的中醫(yī)病機(jī)辨證，多從腎虛、脾虛、血瘀進(jìn)行辨證，或以腎虛為主，兼顧脾虛、血瘀，或分而論治。常用辨證分型為脾腎陽虛證、肝腎陰虛證和腎虛血瘀證，對(duì)于脾腎陽虛證，治宜溫補(bǔ)脾腎，強(qiáng)筋壯骨，專家共識(shí)推薦使用XLGB加文獻(xiàn)。臨床實(shí)踐表明XLGB治療PMOP在改善腰椎骨密度、提高臨床有效率及改善疼痛方面療效確切，同時(shí)，XLGB聯(lián)合單一抗骨質(zhì)疏松藥物具有增效作用，而其與2種或以上抗骨質(zhì)疏松藥物聯(lián)用疊加增效作用尚待研究[10]。

近年來，開展了許多XLGB治療PMOP的基礎(chǔ)研究，發(fā)現(xiàn)XLGB可通過調(diào)節(jié)骨形成蛋白-2(Bone Morphogenetic Protein，BMP)-2、BMP-4、蛋白激酶C和轉(zhuǎn)化生長因子β1來提高去卵巢大鼠骨密度[11]，可通過提高去卵巢大鼠股骨骨折周圍軟組織血小板衍生生長因子、轉(zhuǎn)化生長因子β-β和血管內(nèi)皮生長因子進(jìn)骨折愈合[12]，可顯著降低骨周轉(zhuǎn)率、促進(jìn)成骨及抑制脂肪生成、促進(jìn)骨小梁結(jié)構(gòu)改善[13]，可能通過參與去勢(shì)大鼠組蛋白修飾改善PMOP癥狀。但這些研究僅從單一方面關(guān)注XLGB的可能作用機(jī)制，未進(jìn)行其物質(zhì)基礎(chǔ)的探索。本研究采用生物信息學(xué)和網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法，篩選PMOP相關(guān)差異表達(dá)基因，對(duì)XLGB的有效活性成分進(jìn)行篩選，并預(yù)測可能的作用靶點(diǎn)，對(duì)共同靶點(diǎn)進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建和富集分析，以期闡明XLGB治療PMOP的靶點(diǎn)和作用機(jī)制。

利用生物信息學(xué)方法挖掘GEO芯片數(shù)據(jù)，共發(fā)現(xiàn)883個(gè)與PMOP發(fā)生發(fā)展相關(guān)的靶點(diǎn)。通過檢索TCMSP和BATMAN-TCM數(shù)據(jù)庫，共獲得XLGB的119種活性成分，將疾病相關(guān)靶點(diǎn)與活性成分對(duì)應(yīng)的靶蛋白取交集后得到26個(gè)共同靶點(diǎn)，共對(duì)應(yīng)61種XLGB活性成分，調(diào)控網(wǎng)絡(luò)圖說明XLGB中的61種活性成分可以單獨(dú)或共同作用于影響PMOP發(fā)生的26種基因中的一個(gè)或多個(gè)，對(duì)這些共同靶點(diǎn)進(jìn)行PPI網(wǎng)絡(luò)分析發(fā)現(xiàn)其與PMOP相關(guān)的152個(gè)節(jié)點(diǎn)PPI，表明XLGB可能間接通過影響這些蛋白質(zhì)發(fā)揮抗PMOP的作用，這些可以解釋中草藥的多效性，體現(xiàn)了中藥“多組分、多靶點(diǎn)”的作用機(jī)制[14]。

對(duì)共同靶點(diǎn)的GO富集分析顯示，XLGB調(diào)控PMOP相關(guān)靶蛋白主要富集在細(xì)胞氧化應(yīng)激反應(yīng)，對(duì)營養(yǎng)水平的反應(yīng)，分泌性顆粒，蛋白激酶C結(jié)合，BH域結(jié)合等，其中細(xì)胞氧化應(yīng)激反應(yīng)，BH域結(jié)合與PMOP發(fā)生發(fā)展過程中成骨細(xì)胞凋亡密切相關(guān)。雌激素缺乏等凋亡信號(hào)可激活內(nèi)源性線粒體途徑，促凋亡蛋白BH3-only上調(diào)，從而抑制抗凋亡的Bcl-2家族成員。如果所有可用的抗凋亡蛋白都被BH3-only蛋白隔離，促凋亡蛋白Bax和BCL-2 Antagonist/Killer 1(Bak1)被活化后聚集在線粒體外膜形成同源寡聚體或自發(fā)寡聚化，促進(jìn)1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氫吡啶(1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine，MPTP)開放或直接在線粒體外膜穿孔，破壞線粒體外膜，釋放細(xì)胞色素C到細(xì)胞質(zhì)[15]，激活胱天蛋白酶-9和胱天蛋白酶-3等，切割DNA修復(fù)酶多腺苷二磷酸核糖聚合酶[16]，導(dǎo)致成骨細(xì)胞凋亡的發(fā)生。說明XLGB可以對(duì)該過程進(jìn)行調(diào)控，KEGG通路富集結(jié)果中細(xì)胞凋亡信號(hào)通路富集了7個(gè)基因且顯著性最強(qiáng)，亦佐證了這一結(jié)論。利用Cytoscape軟件將共同靶點(diǎn)和顯著富集的KEGG通路進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)可視化分析，發(fā)現(xiàn)AKT1、NFKB1、BAX等靶點(diǎn)處于中心位置，這些可能是仙靈骨葆膠囊治療PMOP的關(guān)鍵作用靶點(diǎn)。

實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證部分建立去卵巢大鼠模型，通過檢測骨密度、血清活性氧水平、骨組織凋亡率及凋亡相關(guān)鍵蛋白，驗(yàn)證XLGB影響細(xì)胞凋亡治療PMOP。首先骨密度結(jié)果與既往研究結(jié)果一致[11，17]，XLGB可有效改善去卵巢大鼠腰椎骨密度。PMOP的發(fā)生與雌激素水平驟然下降活性氧產(chǎn)生增多密切相關(guān)[18-19]，XLGB干預(yù)后血清活性氧明顯下降。病理染色結(jié)果同樣提示，XLGB干預(yù)后，股骨遠(yuǎn)端骨組織細(xì)胞凋亡率明顯降低，抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)量升高，而促凋亡蛋白Bax表達(dá)量顯著下降，提示XLGB可能通過清除活性氧影響細(xì)胞凋亡發(fā)揮抗PMOP作用。

綜上所述，本研究采用生物信息學(xué)和網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法，分析了XLGB治療PMOP的作用機(jī)制，并進(jìn)行動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，驗(yàn)證XLGB通過影響細(xì)胞凋亡發(fā)揮治療作用，為深入研究藥物作用的分子機(jī)制和藥效物質(zhì)基礎(chǔ)奠定基礎(chǔ)。本研究的局限性在于XLGB具有多通路、多靶點(diǎn)的作用特點(diǎn)，本研究僅進(jìn)行了凋亡信號(hào)通路的驗(yàn)證，未明確其對(duì)上游信號(hào)通路的作用，因此后續(xù)將針對(duì)這方面展開探索。