熒光成像技術(shù)用于獨(dú)活根中香豆素類成分積累規(guī)律研究

姬黨通 陳玉瑩 李 欠

(1 甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，蘭州，730070； 2 省部共建干旱生境作物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，蘭州，730070)

獨(dú)活是傘形科植物重齒毛當(dāng)歸的干燥根[1]，作為一種傳統(tǒng)中藥材，有著悠久的歷史，最早在《神農(nóng)本草經(jīng)》中就有記錄。獨(dú)活性溫和，味辛辣、苦澀，由于其有效的藥用價(jià)值，已被列入《中華人民共和國藥典》和《歐洲藥典》等藥典中。具有祛風(fēng)除濕、散寒止痛的功效，通常主要進(jìn)入腎經(jīng)和膀胱經(jīng)來發(fā)揮治療作用[2-3]。此外，獨(dú)活還用于保健領(lǐng)域和美容化妝領(lǐng)域。

獨(dú)活中化學(xué)成分復(fù)雜。迄今為止，已從獨(dú)活中分離鑒定出87種化合物，包括香豆素、多烯炔烴、酚酸和甾體等。此外，氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀分析了近100種揮發(fā)油化合物。相關(guān)研究報(bào)道，香豆素是獨(dú)活中含量最豐富的化合物，并且是獨(dú)活中最主要的生物活性成分[4-6]。香豆素類物質(zhì)最初被用作香料，但在后期的相關(guān)研究中發(fā)現(xiàn)香豆素類化合物具有抗炎、抗氧化、抗菌以及鎮(zhèn)痛等活性作用。其中蛇床子素、二氫歐山芹醇當(dāng)歸酸酯和異歐前胡素已被作為獨(dú)活質(zhì)量控制的指標(biāo)性成分。

藥用植物有效成分的積累和形成與其組織器官和部位有著密切的關(guān)系。組織化學(xué)是在形態(tài)學(xué)的基礎(chǔ)上來研究組織和細(xì)胞中的化學(xué)組成、分布規(guī)律與相對含量變化[7]，利用理化反應(yīng)來顯示植物組織切片中的某種化學(xué)成分。組織化學(xué)的發(fā)展在藥用植物有效成分的產(chǎn)生、分布規(guī)律及動態(tài)變化研究方面具有重要的作用，如對香豆素、揮發(fā)油、黃酮以及生物堿等的研究[8-11]。植物組織制片是組織化學(xué)研究中重要的環(huán)節(jié)，制片效果的好壞直接影響組織化學(xué)成分定位的準(zhǔn)確性，植物組織制片過程常用的技術(shù)手段主要有半薄切片、石蠟切片、冰凍切片等。其中冰凍切片技術(shù)是在低溫條件下將生物組織進(jìn)行速凍以達(dá)到一定硬度并進(jìn)行切片的一種技術(shù)，與其他常規(guī)的切片方法相比，具有簡便、快速、易操作、對樣品破壞小等優(yōu)點(diǎn)[12-14]。本研究通過優(yōu)化獨(dú)活冰凍切片條件，得出藥材獨(dú)活的最佳制片方法。

熒光成像技術(shù)是指以特定波長的入射光激發(fā)照射物質(zhì)，通過計(jì)算機(jī)熒光成像系統(tǒng)獲取熒光圖像數(shù)據(jù)[15]，熒光成像技術(shù)可以不經(jīng)過染色處理，就能直接地觀察植物組織中自發(fā)熒光性成分[16-17]，同時(shí)利用熒光強(qiáng)度對植物組織中的有效成分含量進(jìn)行相對定量分析。有研究者用激光掃描共焦顯微鏡術(shù)(Laser Scanning Confocal Microscopy，LSCM)研究了不同生長年限、不同部位球花石斛中香豆素類成分的含量及分布特征[18-19]。蘭志瓊等[20-21]對白芷中香豆素類成分進(jìn)行組織化學(xué)定位研究，確定了香豆素的分布部位。辛華和丁雨龍[22]利用冷凍切片技術(shù)和常規(guī)石蠟制片技術(shù)，采用熒光顯微技術(shù)對珊瑚菜的根、葉片、葉柄等部位中的香豆素進(jìn)行了組織化學(xué)定位。目前，中藥活性成分組織化學(xué)研究大多集中在糖類、脂類、蛋白質(zhì)、揮發(fā)油、分泌物等方面，但在藥材活性成分的定性與定量研究方面較少。藥用植物中有效成分多且復(fù)雜，活性成分作為藥材中的指標(biāo)性成分，其產(chǎn)生、分布規(guī)律及含量的多少對藥材質(zhì)量品質(zhì)的評價(jià)具有重要意義。因此，本研究運(yùn)用組織化學(xué)的設(shè)計(jì)思路，采用熒光成像技術(shù)對不同生長時(shí)期獨(dú)活根中的香豆素類成分進(jìn)行定位、定量分析，以此建立獨(dú)活根中香豆素成分組織化學(xué)定位分析方法，為研究獨(dú)活活性成分的產(chǎn)生、分布、積累規(guī)律提供有效的理論依據(jù)，為拓寬中藥的研究提供一定參考。

1 材料與方法

1.1 儀器與試藥 電熱恒溫真空干燥箱(上海躍進(jìn)醫(yī)療器械有限公司，型號：DZF-1B)，冷凍切片機(jī)(Leica公司，德國，型號：CM1950)，激光掃描共聚焦顯微鏡(Carl Zeiss公司，德國，型號：LSCM 800)，正倒置一體熒光顯微鏡(ECHO公司，美國，型號：BX61+DP70，RVL100-G)；丙三醇(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號：20201116)，最優(yōu)切削溫度(Optimal Cutting Temperature Compound，OCT)包埋劑(Leica公司，德國，批號：14020108926)；獨(dú)活新鮮根取自甘肅省華亭市(165°65′E，35°22′N)，經(jīng)甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)中草藥栽培與鑒定系陳垣教授鑒定并確認(rèn)為傘形科植物獨(dú)活，試驗(yàn)取材以不同生長期(4、6、8、10、12月)的獨(dú)活中部新鮮根作為材料。

1.2 獨(dú)活根冰凍切片的制作

1.2.1 不同保護(hù)劑的考察 植物組織冰凍切片過程中，保護(hù)劑的使用對植物組織中活性成分的穩(wěn)定性以及切片的完整性具有重要的作用。目前常用的冷凍切片保護(hù)劑有甘油和蔗糖等，保護(hù)劑可以和植物組織中的自由水結(jié)合，可以降低冰晶對細(xì)胞的損傷[23]。同時(shí)，部分凝固點(diǎn)較低的固定液也可以起到保護(hù)植物組織的作用。實(shí)驗(yàn)對不同濃度的甘油和蔗糖溶液作為不同的保護(hù)劑進(jìn)行考察，以篩選出獨(dú)活根最佳切片條件。見表1。

表1 不同濃度保護(hù)劑對獨(dú)活根冰凍切片質(zhì)量的影響

1.2.2 不同切片厚度的考察 藥材切片厚度直接影響切片質(zhì)量、切片的難易程度以及觀察的清晰度，所以在切片厚度的設(shè)置上綜合考慮了以上3種因素。通常越薄切片質(zhì)量越好，但植物組織破碎程度嚴(yán)重，切片過厚影響熒光顯微觀察的透明度及清晰度。為此，分別對以下3個(gè)等級厚度切片進(jìn)行試驗(yàn)考察。見表2。

表2 不同切片厚度對獨(dú)活根冰凍切片質(zhì)量的影響

1.3 香豆素類成分自發(fā)熒光組織化學(xué)定位研究

1.3.1 香豆素對照試驗(yàn) 取蛇床子素作為對照，配制成10 mg/mL的蛇床子素標(biāo)準(zhǔn)品溶液，置于載玻片上，滴加15%甘油進(jìn)行封片，制成臨時(shí)對照品。依據(jù)香豆素成分易溶于甲醇、乙醇等有機(jī)溶劑的性質(zhì)，將切片組織依次通過70%、80%、90%、100%的乙醇溶液中分別處理30 min，以去除組織中的香豆素類成分。

1.3.2 香豆素自發(fā)熒光顯微成像定位觀察 以優(yōu)化的最佳切片條件切片后將樣品置于熒光顯微鏡下進(jìn)行觀察，根據(jù)香豆素化合物可在最佳激發(fā)波長的激光下發(fā)出藍(lán)色自發(fā)熒光的特性，可在353 nm激發(fā)下，發(fā)射出熒光的特性，觀察獨(dú)活根中香豆素的自發(fā)熒光并拍照。

1.3.3 運(yùn)用激光掃描共聚焦熒光顯微成像技術(shù)對不同時(shí)期獨(dú)活中的香豆素類成分進(jìn)行相對定量分析 試驗(yàn)以采收期的新鮮獨(dú)活為材料進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)，以此篩選得到最佳制片條件。試驗(yàn)選取4、6、8、10、12月等5個(gè)不同生長時(shí)期的新鮮獨(dú)活藥材作為材料，每個(gè)時(shí)期隨機(jī)選取10株，以篩選出的最佳冰凍切片條件分別制備不同時(shí)期獨(dú)活根的組織切片，利用激光掃描共聚焦顯微鏡在4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(4′,6-diamidino2-phenylindole，DAPI)通道下進(jìn)行熒光成像觀察并拍照，每株藥材分別獲取10個(gè)不同視野下的熒光圖像，并記錄熒光算術(shù)平均強(qiáng)度，做統(tǒng)計(jì)學(xué)分析處理。

1.4 獨(dú)活根分泌組織測量統(tǒng)計(jì) 運(yùn)用正置熒光顯微鏡及成像系統(tǒng)觀察組織結(jié)構(gòu)，在相應(yīng)視野倍數(shù)下，利用顯微測量技術(shù)對不同樣品、不同部位處隨機(jī)選取10個(gè)視野統(tǒng)計(jì)其分泌組織的個(gè)數(shù)，并計(jì)算其單位面積的密度。此外，結(jié)合熒光成像對香豆素類成分集中分布部位的熒光強(qiáng)度進(jìn)行測算。

熒光強(qiáng)度(FI)=分泌腔密度(個(gè)/mm2)×S韌皮部×FI總強(qiáng)度

2 結(jié)果

2.1 獨(dú)活根冰凍切片最佳切片結(jié)果

2.1.1 保護(hù)劑的選擇 研究發(fā)現(xiàn)不同種類、不同濃度梯度的保護(hù)劑對于獨(dú)活根冰凍切片的完整性至關(guān)重要。同濃度的甘油和蔗糖溶液，濃度大于15%時(shí)，隨著保護(hù)劑濃度的增大，獨(dú)活根組織難以達(dá)到切片的硬度，導(dǎo)致切片困難。濃度小于15%時(shí)，隨著保護(hù)劑濃度的減小，組織切片破碎嚴(yán)重，影響對組織的熒光顯微觀察。因此，選擇以15%甘油作為保護(hù)劑處理樣品時(shí)，得到的切片效果最佳。見圖1。

2.1.2 切片厚度的選擇 3個(gè)等級切片厚度研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)切片厚度大于25 μm時(shí)，隨切片厚度的增加，雖然組織切片的破碎程度減小，但組織觀察透光率減小。當(dāng)切片厚度≤20 μm，隨切片厚度的逐漸減小，切片組織細(xì)胞容易破碎，切片難度大。因此，試驗(yàn)選擇切片厚度25 μm時(shí)，切片效果最佳。見圖1。

圖1 不同處理方法的獨(dú)活冰凍切片顯微圖(×100)

2.2 獨(dú)活中香豆素成分的分布特征 獨(dú)活組織切片通過激光掃描共聚焦顯微鏡，在DAPI通道下可自發(fā)產(chǎn)生藍(lán)色熒光。木栓層、栓內(nèi)層分泌腔、韌皮部分泌道及木質(zhì)部激發(fā)出藍(lán)色熒光，與陽性對照中蛇床子素對照品發(fā)出的熒光一致。切片經(jīng)過乙醇對照組處理后，分泌腔的藍(lán)色熒光消失，木栓層藍(lán)色熒光減弱，而木質(zhì)部仍有藍(lán)色熒光。表明香豆素成分主要分布在分泌腔、分泌道等分泌組織中。見圖2。

圖2 獨(dú)活根顯微結(jié)構(gòu)熒光成像圖(×100)

2.3 不同時(shí)期獨(dú)活中香豆素成分的熒光成像測定結(jié)果 試驗(yàn)選取的5個(gè)時(shí)期獨(dú)活香豆素成分的熒光強(qiáng)度測量值如表3所示，利用Sigmaplot 14.0作圖軟件對不同時(shí)期獨(dú)活總香豆素含量動態(tài)趨勢變化進(jìn)行分析。由圖3可知，獨(dú)活根中香豆素類成分總體變化趨勢呈“S”形增長模式，不同生長時(shí)期對獨(dú)活香豆素含量變化具有顯著影響。在4—10月生長期時(shí)段內(nèi)，隨生長期的延后獨(dú)活根中香豆素含量呈上升趨勢，10月香豆素含量達(dá)到最大值，熒光強(qiáng)度達(dá)1 952.580 6像素?zé)晒鈴?qiáng)度。4—6月生長期的香豆素含量增幅緩慢，獨(dú)活營養(yǎng)生長前期地上部分處于快速增長階段，消耗大量的能量，藥材營養(yǎng)物質(zhì)積累較慢。進(jìn)入8—10月后香豆素含量增幅較大，獨(dú)活地上部分生長趨于緩慢、莖葉趨于枯萎，利于根中營養(yǎng)物質(zhì)的積累。11月之后香豆素含量變化呈下降趨勢，獨(dú)活地上部分的營養(yǎng)轉(zhuǎn)化結(jié)束，根系為了維持生命代謝，消耗了部分干物質(zhì)，根部干物質(zhì)損耗，不利于獨(dú)活藥材品質(zhì)的提高。

圖3 不同時(shí)期獨(dú)活總香豆素含量變化趨勢圖

表3 不同時(shí)期獨(dú)活香豆素成分的熒光強(qiáng)度值

2.4 獨(dú)活根分泌組織系數(shù)分析 獨(dú)活根的不同部位分泌組織及單位密度的顯微測量結(jié)果如表4～5所示。通過公式計(jì)算得韌皮部分泌腔部位香豆素類成分的相對熒光強(qiáng)度為2 443 701.637 1像素?zé)晒鈴?qiáng)度。

表4 獨(dú)活根分泌組織測量結(jié)果

表5 獨(dú)活根不同組織部位測量結(jié)果(mm)

3 討論

本研究利用冰凍切片和熒光成像技術(shù)對不同時(shí)期獨(dú)活根中的香豆素成分進(jìn)行定位定量分析研究，首次建立了獨(dú)活根冰凍切片及熒光成像新方法，通過對保護(hù)劑、切片厚度等不同切片條件的篩選，得出藥用植物獨(dú)活根組織制片最佳條件。即獨(dú)活根經(jīng)過15%甘油保護(hù)劑的處理，切片厚度為25 μm時(shí)切片效果最佳。這與川白芷、石斛等藥用植物的冰凍切片研究結(jié)果具有相同之處，不同之處在于其他研究沒有按植物不同時(shí)期進(jìn)行開展試驗(yàn)[24-25]。此外，研究利用顯微成像測量技術(shù)對不同部位分泌組織進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)合熒光成像對香豆素成分集中分布部位的熒光強(qiáng)度進(jìn)行測算，發(fā)現(xiàn)香豆素類成分主要分布在分泌腔和分泌道中，韌皮部分泌腔部位香豆素類成分的熒光強(qiáng)度為2 443 701.637 1像素?zé)晒鈴?qiáng)度。本研究建立的方法可在獨(dú)活組織不經(jīng)破壞處理的條件下，能簡捷、快速地對藥用植物中的自發(fā)熒光性成分進(jìn)行原位分析及相對定量研究。

不同時(shí)期獨(dú)活根中香豆素類成分含量變化趨勢明顯，活性成分積累存在明顯差異。本研究同時(shí)兼顧組織化學(xué)結(jié)構(gòu)和有效成分含量，通過組織切片及熒光成像技術(shù)對不同時(shí)期獨(dú)活根中的香豆素類成分進(jìn)行了定位、定量分析，建立的獨(dú)活香豆素類成分組織化學(xué)定位分析方法，可為研究其他植物中活性成分的產(chǎn)生、分布、積累規(guī)律提供有效的理論依據(jù)，為拓寬中藥的研究提供一定參考。