花生果腐病致病真菌的分離及抗性種質(zhì)資源鑒定

朱立飛，張初署，唐月異，韋瀟，王冕，于強，宋福榮，張建成

(1.山東省花生研究所/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部花生生物學(xué)與遺傳育種重點實驗室，山東 青島 266100；2.遼寧工程技術(shù)大學(xué)，遼寧 阜新 123000；3.青島天祥食品集團有限公司，山東 青島 266100)

花生(Arachis hypogaeaL.)是一種地上開花、地下結(jié)果的喜溫豆科作物，富含蛋白和油脂，是世界范圍內(nèi)廣泛種植的油料和經(jīng)濟作物。我國是花生生產(chǎn)和消費大國，花生總產(chǎn)量和出口量均占世界第一[1]?；ㄉm宜種植在疏松的沙土地上，適應(yīng)性較強，但其生長過程中土傳病害種類較多。已報道的花生土壤侵染性病害有多種，包括真菌性病害、細菌性病害和線蟲病害等。其中真菌病害主要有莖腐病、根腐病、果腐病等。

花生果腐病又稱“爛果病”。發(fā)病時，花生莢果果皮先出現(xiàn)深褐色的病斑，隨后病斑逐漸擴展到整個莢果，最終變黑、腐爛，不同發(fā)育階段的莢果均可受害。此外，果柄與莢果的結(jié)合部容易染病，發(fā)病后果柄與莢果結(jié)合不牢固，收獲時極易落果[2]，花生籽仁也會發(fā)黑霉爛，嚴重影響花生的產(chǎn)量和品質(zhì)。該病2009年在河北新樂、定州、行唐和河南濮陽及山東部分地區(qū)造成大幅減產(chǎn)[3]。近年來此病在我國北方產(chǎn)區(qū)呈連年加重之勢，已成為花生生產(chǎn)上的主要病害，對花生產(chǎn)量和品質(zhì)構(gòu)成嚴重威脅。

花生果腐病的病原是復(fù)合病原(peanut pod rot complex)，包括病原真菌、植物寄生線蟲和土壤螨類等[4]。Frank[5]在1968年首次鑒定了花生爛果病的病原菌是群結(jié)腐霉(Pythium myriotylum)，而后分離出多種病原真菌。Garcia[6]在1975年證實，花生果莢埋在含有腐霉菌、鐮刀菌和根結(jié)線蟲的土壤中爛果更為嚴重。Shew等[7]在1979年證實，超過50%的花生莢果與伯氏嗜木螨屬(Caloglyphus)螨蟲有關(guān)，土傳螨顯著增加花生果腐病的發(fā)病率。Hollowell等[8]通過田間調(diào)查分離出絲核菌(Rhizoctonia)、腐霉菌(Pythium)和花生黑腐病菌(Cylindrocladium paraasiticum)等5種真菌。Cilliers[9]發(fā)現(xiàn)，南非花生果腐病病原是Chalara elegans。利比亞果腐病病原為腐皮鐮刀菌(Fusarium solani)及該屬其它種[10]。此外，Crous等[11]發(fā)現(xiàn)枝雙孢霉屬(Cylindrocladium)是導(dǎo)致花生果腐病的病原菌，Lombard等[12]在2009年分離得到該病菌，并于2010年對由Cylindrocladium引起的植物各種病害進行了統(tǒng)計分析[13]。

花生果腐病的病原復(fù)雜致使防控困難[14]。殺菌劑是農(nóng)業(yè)防控果腐病的手段之一，但是這些殺菌劑都是針對腐霉菌和絲核菌等引起的花生果腐病，而對于其他真菌，例如鐮孢菌、糞殼菌等的防效未見報道?？共∮N是最經(jīng)濟、安全有效的花生果腐病防控手段。已有研究表明，普通型花生更易感染花生果腐病，而珍珠豆型花生品種“Toalson”對于腐霉菌(Pythium)和立枯絲核菌(Rhizoctonia solani)具有顯著抗性，花生品系Georgia Browne對立枯絲核菌也有一定抗性[15]，但是這種抗性花生種質(zhì)資源較少。因此花生果腐病病原真菌的篩選、培養(yǎng)和致病性研究尤為重要。

本研究以花育917為試驗材料，從發(fā)生花生果腐病的籽仁中分離和鑒定出一株真菌(PPRF－05)，結(jié)合形態(tài)學(xué)觀察及ITS序列分析對菌種進行鑒定，并對本課題組保存的花生資源和突變體材料進行抗病鑒定，以期為開展花生果腐病抗病機理研究和育種提供理論基礎(chǔ)和種質(zhì)材料。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試花生品種均為本實驗室育成并保存。花生離體組織取自花育917。

1.2 供試菌株的分離

將發(fā)生花生果腐病的莢果去掉外殼，發(fā)黃發(fā)黑籽仁浸泡于50 mL PDA液體培養(yǎng)基中，25℃過夜培養(yǎng)后倒掉籽仁，用脫脂棉過濾培養(yǎng)基。將過濾后的培養(yǎng)基3 000×g離心10 min后棄液體培養(yǎng)基，2 mL PDA培養(yǎng)基重懸菌體，后用涂抹法純化菌體至單菌落。

1.3 菌種鑒定

使用通用引物ITS5:5′－ACCCGCTGAACTTAAGC－3′，ITS4:5′－BTCCTGAGGGAAACTTCG－3′進行ITS序列擴增[16]，選擇單一明亮的條帶送生工生物工程(上海)股份有限公司進行測序，利用BLAST進行序列比對。

1.4 花生各離體組織接菌

種子消毒:75%乙醇浸泡5 min，5%次氯酸鈉浸泡10 min，無菌水沖洗5～6遍，清水浸泡8 h，后置于水培培養(yǎng)箱中，25℃培養(yǎng)至四葉期。

離體組織的獲得:在超凈工作臺中，無菌水沖洗幼苗，滅菌剪刀剪下葉片、莖和根備用。子葉取自二葉期幼苗。將各種離體組織置于培養(yǎng)皿中浸濕的棉花上培養(yǎng)2 d備用。

接種:將花生不同組織置于超凈工作臺中，先用接種針輕輕劃傷花生組織表面，然后將直徑0.5 cm的菌餅置于傷口處，培養(yǎng)20 d，以不接種致病菌作為對照組。每組2個重復(fù)，每個試驗重復(fù)3次。

1.5 花生果腐病感－抗模型的建立

參考王冕等[17]的方法。不同品種均取飽滿、健康、無霉變的鮮種子，平分為兩份，一份直接接種果腐病病原菌，另一份進行培育并在幼苗子葉上接種病原菌。每天記錄鮮種子和幼苗子葉的發(fā)病率、病害嚴重程度以及病斑大小，對種子進行抗病分級。

鮮種子接種5 d出現(xiàn)病斑，發(fā)病率90%以上，接種點腐爛，病斑直徑0.5 cm以上為易感病(HS)品種；接種5 d出現(xiàn)病斑，發(fā)病率在70%～90%，接種點發(fā)黑，病斑直徑0.2～0.5 cm為感病(S)品種；接種7 d無病斑，發(fā)病率在10%～20%，接種發(fā)黃為抗病(R)品種；接種7 d無病斑，發(fā)病率在10%以下，接種點無變化，種子可以正常萌發(fā)為高抗病(HR)品種。

統(tǒng)計不同感抗病品種鮮種子對應(yīng)的花生幼苗子葉發(fā)病情況，將對應(yīng)的幼苗子葉發(fā)病情況作為花生果腐病感－抗模型。

易感病(HS):接種5 d出現(xiàn)病斑，發(fā)病率90%及以上，子葉整體發(fā)黑，接種點腐爛，病斑直徑1.0 cm以上；感病(S):接種5 d出現(xiàn)病斑，發(fā)病率在70%～90%，子葉整體發(fā)黃，接種點發(fā)黑，病斑直徑0.3～1.0 cm；抗病(R):發(fā)病率在10%～20%，接種點發(fā)黃；高抗病(HR):發(fā)病率在10%以下，接種點無變化，莖部正常生長。

1.6 花生抗病種質(zhì)資源的篩選

將花生種子放在無菌水中浸泡8 h后鋪于平皿上培養(yǎng)至露白，水培至4片真葉，幼苗全長10～15 cm。將幼苗用無菌水洗凈，取花生子葉置于濕棉花上，25℃光照培養(yǎng)箱中光照16 h、黑暗8 h培養(yǎng)2 d待用。接菌后培養(yǎng)20 d，以不接種致病菌作為對照組，每天記錄子葉的發(fā)病率、病害嚴重程度以及病斑大小。導(dǎo)入花生果腐病感－抗模型中，篩選抗病品種。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株P(guān)PRF－05的分子生物學(xué)鑒定

從發(fā)生花生果腐病籽仁中分離出一株菌株P(guān)PRF－05，對其ITS區(qū)域進行測序(圖1)，根據(jù)Blastn結(jié)果進行序列注釋，并提交到GenBank上注冊，序列號:MH368499。其ITS序列經(jīng)比對與Fusarium oxysporum相似度為100%，確定該菌為尖孢鐮刀菌，現(xiàn)保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCC No.18130。

圖1 菌株P(guān)PRF－05的ITS序列

2.2 菌株P(guān)PRF－05的形態(tài)特征

PPRF－05接種在PDA培養(yǎng)基上，氣生菌絲為白色絮狀，隨著培養(yǎng)時間增加，培養(yǎng)基質(zhì)由紅色轉(zhuǎn)為紫紅色(圖2A)；老熟菌絲上產(chǎn)生許多直徑為1.5 mm的疏松絮狀菌核，及大型鐮刀形分生孢子和小型橢圓形分生孢子(圖2B)。

圖2 菌株P(guān)PRF－05的形態(tài)特征

2.3 花生各離體組織接種PPRF－05后的癥狀

接種3 d后，花生各組織表現(xiàn)出發(fā)黃、發(fā)黑等果腐病癥狀。接種7 d后，花生莖略有發(fā)黃、發(fā)紫，與對照相比沒有明顯變化(圖3A)；子葉接種位置明顯腐爛，并向未接種位置擴散(圖3B)；根系主根明顯發(fā)黑，并向未接種位置擴散，對照根系發(fā)黃(圖3C)；葉片在接種7 d后出現(xiàn)病斑、發(fā)黃并向未接種位置擴散(圖3D)；此外，PPRF－05菌株可以侵染花生種子的任一發(fā)育階段(圖3E)。

圖3 花生各離體組織接種PPRF－05后的癥狀

2.4 花生果腐病感－抗模型的建立

接種5 d后，種子發(fā)病情況如圖4所示。種子抗病分級情況及對應(yīng)幼苗子葉發(fā)病情況如表1、表2所示，以此作為花生果腐病感－抗模型。

表1 鮮種子抗病性分級

表2 幼苗子葉感病統(tǒng)計

圖4 鮮種子發(fā)病情況

表2(續(xù))

2.5 花生種質(zhì)資源鑒定

用上述感－抗模型對種質(zhì)資源進行抗果腐病篩選鑒定，結(jié)果顯示:花育36和花育915為易感品種；花育20和花育24為感病品種；花育916和花育50為抗病品種；T1611和R18－4為高抗品系(表3)。

表3 種質(zhì)資源抗病分級

表3(續(xù))

3 討論與結(jié)論

花生果腐病的病原復(fù)雜多樣，Csinos[18]在1986年分離出Rhizoctonia、Pythium和Cylindrocladium等6種真菌，同時明確不同地域或同一地域不同年份的病原微生物組成存在差異；另外土壤環(huán)境因素的改變也可能加重果腐病的發(fā)生，甚至某些營養(yǎng)元素的改變會導(dǎo)致果腐病的發(fā)生。王傳堂等[3]利用分子克隆技術(shù)，發(fā)現(xiàn)萊西農(nóng)場的果腐病與真菌感染有關(guān)，并且鐮刀菌可能是主要病原。李術(shù)臣等[19]研究發(fā)現(xiàn)，在中國臺灣地區(qū)花生果腐病的主要病原有Fusarium solani、Rhizoctionia solani和Pythium myriotylum及寄生性線蟲等；河北省病原種類與其基本一致，都是多真菌病害共同作用的結(jié)果。本研究分離得到的PPRF－05菌株，ITS區(qū)測序表明其屬于鐮刀菌屬。

感染果腐病的花生植株地上部與正常植株無差異，但莢果發(fā)黑腐爛，不易發(fā)現(xiàn)[20]。病害嚴重的植株莖葉濃綠，收獲期無明顯落葉現(xiàn)象，秧苗不死，根系繁茂但表皮發(fā)黑，但莢果幾乎全部腐爛[21]。本研究將PPRF－05菌株接種花生各離體組織，根、子葉出現(xiàn)明顯的發(fā)黑腐爛現(xiàn)象，莖和葉片出現(xiàn)病斑，但癥狀較輕。與果腐病的發(fā)病癥狀一致，進一步證實PPRF－05菌株是果腐病的主要致病菌。

目前，關(guān)于花生果腐病的研究主要集中在病原菌的分離鑒定及其致病性，在抗果腐病花生種質(zhì)資源篩選鑒定方面相對較少。2018年何美敬等[22]通過田間自然發(fā)病對引進的77份美國資源和39份國內(nèi)資源進行連續(xù)2年的鑒定；于靜等[23]采用自然病圃鑒定法，對萊西試驗站76個花生品種(系)進行了花生果腐病抗性評價。我國對花生果腐病的抗性種質(zhì)資源篩選采用的是Wheeler等[24]的果腐病等級劃分法以及何美敬等[22]建立的田間抗性評價體系。本研究建立的離體接種快速篩選方法，能夠在實驗室內(nèi)簡潔、高效地篩選抗病品種。下一步將對篩選所得花生品種進行田間試驗，結(jié)合何美敬等[22]引入的田間抗性評價體系，進一步驗證離體接種快速篩選方法的可行性，為抗果腐病花生品種快速選育提供新路徑。