洋蔥黃酮醇合成酶基因的克隆與表達(dá)分析

王振寶，楊妍妍，劉冰江，霍雨猛，李艷偉，孫亞玲，吳雄

(山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所，山東 濟(jì)南 250100)

洋蔥(Allium cepaL.)又名圓蔥、蔥頭、球蔥等，為百合科蔥屬二年生草本植物。洋蔥于二十世紀(jì)初期引入我國(guó)，具有適種性廣、易栽培的特點(diǎn)，我國(guó)南北方均有栽培，目前我國(guó)洋蔥的生產(chǎn)面積和產(chǎn)量均居全球第一，約占世界洋蔥生產(chǎn)總面積的30%左右，是重要的出口創(chuàng)匯蔬菜[1]。洋蔥以肉質(zhì)鱗莖為主要食用器官，是黃酮醇類化合物的重要食物來(lái)源。黃酮醇類化合物一般具有較強(qiáng)的抗氧化性[2]，起到抑菌抗炎、抗過敏、保護(hù)心血管、防癌等作用[3]。

黃酮類化合物作為重要的次生代謝物廣泛存在于植物中，可以保護(hù)植物免受生物和非生物脅迫的危害[4，5]。因其分子中含有酮基而呈現(xiàn)黃色，從而賦予植物花、果實(shí)、種子等組織器官不同的顏色。黃酮醇類化合物是最為常見的黃酮類化合物，占黃酮類化合物總數(shù)的1/3左右，是洋蔥鱗莖產(chǎn)生黃色的主要因素。黃酮醇合成酶(flavonol synthase，F(xiàn)LS)是黃酮醇生物合成的直接調(diào)控酶，也是連接類黃酮類合成途徑和兒茶素合成途徑的橋梁，它以二氫黃酮醇為底物，催化黃酮結(jié)構(gòu)中的C3位發(fā)生羥基化形成各種黃酮醇類物質(zhì)[6，7]。黃酮醇合成酶在植物中非常保守[8]，汪慶昊等[9]根據(jù)FLS基因保守區(qū)域的序列設(shè)計(jì)引物，成功克隆了杜鵑FLS基因的全長(zhǎng)序列。目前已經(jīng)從葡萄風(fēng)信子[10]、青天葵[11]、日本蛇根草[12]等植物中分離、克隆了FLS基因。

關(guān)于洋蔥花青素合成途徑相關(guān)基因的研究已經(jīng)較為成熟，目前已經(jīng)克隆了CHI、DFR、ANS、UFGT等基因并做了詳細(xì)研究[13－17]，但是關(guān)于洋蔥FLS基因的研究相對(duì)較少。Park等[18]克隆了洋蔥的FLS基因，并對(duì)3個(gè)月苗期紅皮和黃皮洋蔥中FLS基因?qū)Φ孜锏拇呋省LS基因及花青素生物合成途徑基因的表達(dá)水平做了研究。本研究克隆了洋蔥FLS基因的編碼序列，并進(jìn)行了生物信息學(xué)分析，同時(shí)對(duì)其在不同皮色洋蔥的不同組織及鱗莖膨大期的表達(dá)情況進(jìn)行了研究，以期為揭示洋蔥鱗莖顏色的形成機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

以黃皮洋蔥DH17－1未開放花蕾為試材，克隆FLS基因。取樣后立即用液氮速凍，于－80℃冰箱中凍存?zhèn)溆谩?/p>

以紫皮洋蔥175F和黃皮洋蔥DH17－1為試材，選取鱗莖膨大前的根、葉鞘和葉片以及鱗莖膨大初期、盛期、末期和收獲期的外層肉質(zhì)鱗片用于FLS基因的表達(dá)分析。蒸餾水沖洗干凈后，分別用錫箔紙包好，立即用液氮速凍，于－80℃冰箱中凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 洋蔥總RNA的提取及cDNA的制備

洋蔥總RNA采用Trizol(Invirtrogen公司)法提取，具體方法參照說(shuō)明書。參照反轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScriptTMRT reagent kit with gDNA Eraser[寶生物工程(大連)有限公司]說(shuō)明書反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈。

1.3 PCR擴(kuò)增

克隆洋蔥FLS基因的正向引物為FLS－F:5′－CATCAGAGTTCATCAGATCGGACCA－3′，反向引物為FLS－R:5′－GCATAATCTTTGTATTTTTTGGTCT－3′，由青島蔚來(lái)生物科技有限公司合成。

PCR反應(yīng)體系(25 μL):模板(cDNA)1 μL，dNTPs(2.5 mmol/L)4 μL，10×LATaqbuffer 2.5 μL，引物各1 μL，TaKaRa LATaq0.25 μL，滅菌ddH2O補(bǔ)齊至25 μL；擴(kuò)增程序:94℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，63℃退火30 s，72℃延伸1 min，35個(gè)循環(huán)；最后72℃保溫10 min，4℃保存。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳分離，然后在凝膠成像系統(tǒng)上檢測(cè)并拍照記錄。

將目的片段切膠回收，送青島蔚來(lái)生物科技有限公司測(cè)序。

1.4 數(shù)據(jù)分析

利用NCBI在線進(jìn)行開放閱讀框的查找和結(jié)構(gòu)域分析；分別利用ProtParam、NetPhos－3.1、ProtScale、SOPMA、SWISS－MODEL和ProtComp 9.0進(jìn)行蛋白質(zhì)理化性質(zhì)分析、磷酸化位點(diǎn)預(yù)測(cè)分析、親疏水性分析、二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)、三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)和亞細(xì)胞定位；分別利用Blastp、DNAMAN進(jìn)行氨基酸同源序列檢索和氨基酸序列比對(duì)。

1.5 基因表達(dá)模式分析

利用Primer 5.0設(shè)計(jì)AcFLS基因的實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物，正向引物AcFLS－F:5′－CCTGGGTTGATTACTTGTTTC－3′，反向引物AcFLSR:5′－CTTGTTTACCGTTGTTCTGTG－3′，分析儀器為Bio－Rad CFX96 Touch熒光定量PCR儀。PCR擴(kuò)增體系:2×SYBR Green qPCR Master Mix 10.0 μL，正、反向引物各1.0 μL，cDNA模板1.0 μL，滅菌ddH2O補(bǔ)齊至20 μL。PCR反應(yīng)程序采用三步法:95℃預(yù)變性3 min；95℃變性10 s，58℃退火30 s，72℃延伸30 s，40個(gè)循環(huán)；熔解曲線制備溫度為65.0～95.0℃。

每個(gè)樣品進(jìn)行3次生物學(xué)重復(fù)，以β－Actin基因?yàn)閮?nèi)參，正向引物Actin－F:5′－ACACGGCCTGGATAGCAACAT－3′，反向引物Actin－R:5′－AGAGCAGTATTCCCAAGCATT－3′。目的基因相對(duì)轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平參照Livak等[19]的方法，采用2－ΔΔCt公式進(jìn)行計(jì)算。

2 結(jié)果與分析

2.1 洋蔥FLS基因的克隆及生物信息學(xué)分析

以洋蔥未開放花蕾cDNA為模板，通過RTPCR方法克隆得到了洋蔥FLS基因的cDNA序列，片段大小約950 bp(圖1)，命名為AcFLS。NCBI在線網(wǎng)站(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/)預(yù)測(cè)AcFLS共有11條開放閱讀框，其中最大的一條為927 bp，編碼309個(gè)氨基酸。利用ProtParam對(duì)AcFLS基因編碼的蛋白質(zhì)進(jìn)行理化性質(zhì)分析，AcFLS編碼蛋白質(zhì)的分子式為C1605H2467N419O462S7，總原子數(shù)為4 960，分子量為35 249.19 Da，理論等電點(diǎn)(pI)為6.20，負(fù)電荷殘基(Asp＋Glu)總數(shù)為40，正電荷殘基(Arg＋Lys)總數(shù)為35，脂肪系數(shù)84.47，不穩(wěn)定指數(shù)42.35，為不穩(wěn)定蛋白，平均親水性(GRAVY)為－0.515，預(yù)測(cè)為親水性蛋白。

圖1 洋蔥FLS基因RT－PCR電泳圖

2.2 AcFLS蛋白磷酸化位點(diǎn)及親疏水性分析

蛋白質(zhì)磷酸化是蛋白活力和功能的重要調(diào)節(jié)方式，在細(xì)胞信號(hào)的傳遞過程中起到極其重要的作用。利用NetPhos－3.1(https://services.healthtech.dtu.dk/service.php?NetPhos－3.1)進(jìn)行Ac-FLS蛋白磷酸化位點(diǎn)預(yù)測(cè)，結(jié)果顯示，AcFLS蛋白共有12個(gè)Ser磷酸化位點(diǎn)、7個(gè)Thr磷酸化位點(diǎn)、8個(gè)Tyr磷酸化位點(diǎn)(圖2)。

圖2 AcFLS蛋白氨基酸序列及磷酸化位點(diǎn)

ProtScale(https://web.expasy.org/protscale/)親疏水性分析結(jié)果表明(圖3)，AcFLS蛋白存在6個(gè)低分值峰(Score＜－2)，分別分布于0～50、100～150、250～300和300～309氨基酸之間，這些區(qū)域?qū)儆谟H水性區(qū)域；2個(gè)高分值峰(Score＞1.5)，分布于200～250氨基酸之間，屬于高疏水性區(qū)域。從整條肽鏈的氨基酸預(yù)測(cè)值來(lái)看，AcFLS蛋白處于親水性區(qū)域明顯多于疏水性區(qū)域，所以該蛋白為親水性蛋白質(zhì)，這與ProtParam的預(yù)測(cè)結(jié)果一致。

圖3 AcFLS蛋白親疏水性分析

2.3 AcFLS蛋白結(jié)構(gòu)域分析

通過NCBI Conserved Domains(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)進(jìn)行結(jié)構(gòu)域分析，AcFLS蛋白的保守功能域預(yù)測(cè)如圖4所示，該蛋白包含3個(gè)功能域，其中1～309氨基酸為PLN02704超級(jí)家族結(jié)構(gòu)域，該功能域?yàn)辄S酮醇合成酶功能域，說(shuō)明其具有黃酮醇合成酶的功能。此外，184～282氨基酸為一個(gè)2OG－Fe(Ⅱ)－Oxy功能域，屬于2OG－Fe(Ⅱ)加氧酶家族，27～301氨基酸為一個(gè)PcbC超級(jí)家族功能域，表明AcFLS蛋白屬于α－同戊二酸依賴性雙加氧酶超家族。

圖4 AcFLS蛋白保守結(jié)構(gòu)域分析

2.4 AcFLS蛋白同源性分析

利用Blastp對(duì)AcFLS氨基酸序列進(jìn)行同源檢索，發(fā)現(xiàn)AcFLS蛋白氨基酸序列與已報(bào)道洋蔥FLS蛋白(登錄號(hào):AQR58516.1)同源性最高，為91.34%，與同為百合科的虎眼萬(wàn)年青FLS蛋白(登錄號(hào):QBQ58059.1)的同源性為76.42%，與石刁柏FLS蛋白(登錄號(hào):XP＿020241901.1)的同源性為74.63%。進(jìn)一步說(shuō)明克隆得到的為洋蔥FLS基因。

通過DNAMAN將AcFLS基因完整開放閱讀框編碼的氨基酸序列與其它植物FLS氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果表明AcFLS蛋白氨基酸序列與其它植物FLS氨基酸序列同源性平均值為82.16%，并且具有相似的保守域，特別是紅色方框標(biāo)注的2OG－Fe(Ⅱ)加氧酶結(jié)構(gòu)域，在不同植物中具有高度同源的氨基酸序列，該功能域含有3個(gè)高度保守的氨基酸序列，分別為與亞鐵離子結(jié)合的H－X－D、H－X序列以及與2－酮戊二酸結(jié)合的R－X－S序列(X代表任意氨基酸，圖5)。

圖5 不同植物FLS蛋白氨基酸序列比對(duì)分析

2.5 AcFLS蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)及亞細(xì)胞定位

SOPMA(http://npsa－pbil.ibcp.fr/cgi－bin/npsa＿automat.pl?page＝npsa＿sopma.html)在線預(yù)測(cè)分析結(jié)果顯示(圖6)，AcFLS蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)主要為無(wú)規(guī)則卷曲、α－螺旋、延伸鏈和β－折疊結(jié)構(gòu)，占比分別為46.28%、28.16%、20.06%和5.50%，說(shuō)明AcFLS蛋白是由多種元件組成的混合結(jié)構(gòu)型蛋白質(zhì)。利用在線工具SWISS－MODEL得到AcFLS蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)，一致度為45.45%，GMQE值為0.84，可信度接近1，表明所建模型的可靠度較高(圖7)。

圖6 AcFLS蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)圖

圖7 AcFLS蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)模擬圖

利用ProtComp 9.0在線預(yù)測(cè)AcFLS蛋白的亞細(xì)胞定位，分析結(jié)果表明該蛋白位于細(xì)胞質(zhì)的積分值高達(dá)8.67(圖8)，推斷AcFLS蛋白極大可能定位于細(xì)胞質(zhì)中。

圖8 AcFLS蛋白亞細(xì)胞定位

2.6 AcFLS基因表達(dá)分析

以β－Actin基因?yàn)閮?nèi)參，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR對(duì)紫皮、黃皮洋蔥鱗莖膨大前根、葉鞘、葉片及鱗莖膨大各時(shí)期AcFLS基因的表達(dá)情況進(jìn)行分析。結(jié)果顯示，AcFLS基因在洋蔥不同組織部位的表達(dá)存在明顯差異，葉鞘中表達(dá)量最高，葉片次之，根中表達(dá)量極少(圖9)；AcFLS基因在洋蔥鱗莖不同膨大時(shí)期的相對(duì)表達(dá)量呈先升高后降低的趨勢(shì)，在鱗莖膨大盛期達(dá)到最高值(圖10)。但是，無(wú)論不同組織部位還是鱗莖不同膨大時(shí)期，紫皮和黃皮洋蔥中AcFLS基因的表達(dá)水平并無(wú)顯著差異。

圖9 AcFLS基因在不同皮色洋蔥不同組織中的相對(duì)表達(dá)量

圖10 AcFLS基因在不同皮色洋蔥鱗莖膨大各時(shí)期的相對(duì)表達(dá)量

3 討論與結(jié)論

目前在眾多植物中的研究表明，F(xiàn)LS基因與黃酮醇的合成和積累直接相關(guān)，并且能夠影響植物花青素的生物合成和積累，F(xiàn)LS是黃酮類化合物合成代謝下游的關(guān)鍵酶，不同植物的FLS具有較高的保守性，其中比較典型的保守序列是RX－S、H－X和H－X－D序列[20－22]。本研究克隆了洋蔥FLS基因編碼序列，通過分析其編碼蛋白的氨基酸序列，發(fā)現(xiàn)與其它植物FLS蛋白氨基酸序列的同源性為82.16%，AcFLS蛋白還包含F(xiàn)LS家族成員的大部分特征，比如包含2OG－Fe(Ⅱ)加氧酶結(jié)構(gòu)域、PcbC超級(jí)家族功能域以及2OG－Fe(Ⅱ)結(jié)構(gòu)域中與亞鐵離子結(jié)合的H－X－D、H－X序列和與2－酮戊二酸結(jié)合的R－X－S序列。這與在蘋果、紫山藥和羅布麻[23－25]中FLS蛋白的分析結(jié)果一致，說(shuō)明FLS家族蛋白的氨基酸序列保守性較高，特別是一些涉及蛋白功能的位點(diǎn)，保證了FLS基因在不同物種間生物學(xué)功能的穩(wěn)定性。

實(shí)時(shí)定量表達(dá)分析結(jié)果表明，AcFLS基因的表達(dá)具有明顯的組織特異性，表現(xiàn)為葉鞘中表達(dá)量最高，葉片次之，根中表達(dá)量極低；AcFLS基因在洋蔥鱗莖膨大期的表達(dá)量呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)，在鱗莖膨大盛期達(dá)到最高值。這與葡萄風(fēng)信子MaFLS基因的表達(dá)模式相似，MaFLS基因在花中的表達(dá)強(qiáng)度最高，其次是葉，根和莖中表達(dá)量最低[26]。在葉鞘和鱗莖中AcFLS基因表達(dá)量高，推測(cè)這可能是因?yàn)轺[莖(葉鞘)為營(yíng)養(yǎng)儲(chǔ)藏器官，需要積累大量黃酮醇類化合物；同時(shí)在葉片中也檢測(cè)到AcFLS基因的表達(dá)，可能是葉片中合成黃酮醇類化合物以抵御太陽(yáng)輻射等非生物脅迫的危害。本研究還發(fā)現(xiàn)AcFLS基因在紫皮和黃皮洋蔥中的表達(dá)量并無(wú)顯著差異，這與Park等[18]的研究結(jié)果一致。這可能是因?yàn)辄S酮醇類化合物是洋蔥正常生長(zhǎng)發(fā)育的重要物質(zhì)，也是其抗逆、抗脅迫應(yīng)答機(jī)制的重要組成成分，在不同皮色洋蔥中均需要一定數(shù)量黃酮醇類物質(zhì)的存在；而且植物黃酮醇的合成不僅與FLS基因的表達(dá)有關(guān)，同時(shí)還受UV－B、光等多種環(huán)境因素的影響[27]。

FLS基因是影響植物花青素合成和積累的重要基因，本研究克隆了洋蔥FLS基因，并對(duì)其氨基酸序列進(jìn)行了生物信息學(xué)分析，同時(shí)研究了不同皮色洋蔥中FLS基因的表達(dá)情況，為進(jìn)一步研究洋蔥FLS的生物學(xué)功能以及洋蔥鱗莖顏色產(chǎn)生的分子機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。為了進(jìn)一步弄清洋蔥鱗莖顏色產(chǎn)生的機(jī)制，下一步需克隆洋蔥MBW轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子以及顏色抑制基因I和基本顏色基因C，同時(shí)研究花青素合成途徑相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄情況以及類黃酮的種類和含量。