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    小卷蛾斯氏線蟲侵染對(duì)草地貪夜蛾幼蟲天然免疫反應(yīng)的影響

    2022-02-08 02:04:08李而濤魯祺晗張丹鳳孔維捷安春菊
    昆蟲學(xué)報(bào) 2022年12期
    關(guān)鍵詞:卷蛾斯氏夜蛾

    李而濤,魯祺晗,張丹鳳,孔維捷,安春菊

    (中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院昆蟲系,北京 100193)

    草地貪夜蛾Spodopterafrugiperda屬鱗翅目(Lepidoptera)夜蛾科(Noctuidae)灰翅夜蛾屬Spodoptera,具有遷飛能力強(qiáng)、寄主范圍廣、增殖潛能強(qiáng)等特點(diǎn),現(xiàn)已成為我國(guó)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上的一種常發(fā)性重大害蟲(石旺鵬,2020;吳孔明,2020;Sunetal.,2021)。目前主要依賴于菊酯類、有機(jī)磷類、氨基甲酸鹽類等化學(xué)藥劑對(duì)其進(jìn)行防治,但草地貪夜蛾已對(duì)部分化學(xué)農(nóng)藥產(chǎn)生了不同程度的耐性或抗性(Bolzanetal.,2019;趙勝園等,2019;Liraetal.,2020)。為減少化學(xué)藥劑使用劑量以及降低抗藥性風(fēng)險(xiǎn),急需尋找、制訂和實(shí)施草地貪夜蛾綠色防控技術(shù)(吳孔明,2020)。

    昆蟲病原線蟲(entomopathogenic nematode,EPN)具有專性寄生、殺蟲速度快、易于大量擴(kuò)繁、對(duì)環(huán)境及非靶標(biāo)生物無副作用等優(yōu)點(diǎn),在草地貪夜蛾的綠色防控中應(yīng)用潛力巨大(顏珣等,2019)。國(guó)內(nèi)外多項(xiàng)研究均表明包括小卷蛾斯氏線蟲SteinernemacarpocapsaeAll和NBAIRS59,長(zhǎng)尾斯氏線蟲SteinernemalongicaudumX-7,夜蛾斯氏線蟲Steinernemafeltiae0663PG以及印度異小桿線蟲Heterorhabditisindica1 NBAIIH38等在內(nèi)的昆蟲病原線蟲可以致死草地貪夜蛾(Acharyaetal.,2020;梁銘榮等,2020;楊淋凱等,2021;Patiletal.,2022)。昆蟲病原線蟲一方面通過運(yùn)動(dòng)和取食造成昆蟲組織機(jī)械損傷;另一方面向寄主體內(nèi)釋放攜帶的共生細(xì)菌,細(xì)菌迅速大量繁殖并分泌毒素蛋白,最終導(dǎo)致寄主昆蟲患敗血癥死亡(楊秀芬和楊秀文,1998;Dillmanetal.,2012)。但昆蟲病原線蟲在成功定殖之前需要有效對(duì)抗寄主昆蟲強(qiáng)大的天然免疫系統(tǒng),進(jìn)而建立感染(Castilloetal.,2011;Bangetal.,2015)。

    昆蟲天然免疫反應(yīng)分為細(xì)胞免疫(cellular immunity)和體液免疫(humoral immunity),二者互相協(xié)作完成對(duì)病原物的清除或殺滅(Xiaetal.,2018)。細(xì)胞免疫主要由功能多樣的血細(xì)胞介導(dǎo),昆蟲血細(xì)胞會(huì)通過改變其形態(tài)和數(shù)目對(duì)細(xì)菌、真菌、線蟲等外源物進(jìn)行吞噬(phagocytosis)、結(jié)節(jié)(nodulation)和包囊(encapsulation)等免疫反應(yīng)(Shenetal.,2016;Arteaga Blancoetal.,2017;Garrigaetal.,2020)。研究表明亞洲玉米螟Ostriniafurnacalis血細(xì)胞可以吞噬侵入體內(nèi)的球孢白僵菌Beauveriabassiana或形成結(jié)節(jié)(Shenetal.,2016);草地貪夜蛾血細(xì)胞會(huì)對(duì)侵入的大腸桿菌Escherichiacoli發(fā)生明顯的結(jié)節(jié)反應(yīng)(白耀宇和孫佳琦,2020);大蠟螟Galleriamellonella血細(xì)胞可以包囊剛硬全凹線蟲Panagrolaimusrigidus(Brivio and Mastore,2018)等。但另一方面,昆蟲病原線蟲通常會(huì)采用免疫逃避或免疫抑制的策略來應(yīng)對(duì)寄主昆蟲的免疫反應(yīng)(Castilloetal.,2011)。在夜蛾斯氏線蟲侵染大蠟螟的早期階段,線蟲表皮外膜的脂蛋白可以與大蠟螟血淋巴因子結(jié)合并在線蟲體表形成一層薄膜,這種薄膜可以逃避寄主血細(xì)胞的識(shí)別并抑制血細(xì)胞的包囊反應(yīng)(Brivioetal.,2002;Mastore and Brivio,2008)。另外,小卷蛾斯氏線蟲也可以抑制大蠟螟血細(xì)胞的吞噬活性(Brivioetal.,2018)。

    昆蟲體液免疫反應(yīng)主要由脂肪體和分泌的體液蛋白介導(dǎo),包括由酚氧化酶(phenoloxidase,PO)參與的黑化反應(yīng)以及由Toll通路(Toll pathway)和Imd通路(immune deficiency pathway)調(diào)控的抗菌肽(antibacterial peptide,AMP)生成(初源等,2013;Yangetal.,2021)。例如,喂食家蠶Bombyxmori大腸桿菌6,12和24 h后,酚氧化酶原(prophenoloxidase,PPO)基因PPO1和PPO2的表達(dá)顯著上調(diào),血淋巴的PO活性也顯著升高(楊偉克等,2019);美國(guó)白蛾Hyphantriacunea被粘質(zhì)沙雷氏菌Serratiamarcescens侵染后體內(nèi)抗菌肽基因Attacin-B,Cecropin-A,Gloverin,Lebocin和Diapausin等的轉(zhuǎn)錄水平會(huì)顯著升高(Wangetal.,2021)。而昆蟲病原線蟲則能抑制或降低寄主昆蟲的體液免疫反應(yīng)。如夜蛾斯氏線蟲表皮外膜中的脂類物質(zhì)能夠結(jié)合大蠟螟體內(nèi)的寄主互作蛋白,導(dǎo)致血淋巴中酚氧化酶原激活系統(tǒng)的必需因子濃度降低,從而抑制大蠟螟血淋巴的PO活性(Brivioetal.,2006)。小卷蛾斯氏線蟲則是利用自身的分泌物來調(diào)節(jié)寄主的體液免疫,其分泌物中有一種蛋白酶trypsin-like protease可以顯著抑制大蠟螟血淋巴的PO活性(Balasubramanianetal.,2010)。Eliá?等(2020)從嗜菌異小桿線蟲Heterorhabditisbacteriophora的分泌物中分離得到一個(gè)38 kD的肽段,該肽段可顯著抑制大蠟螟血淋巴的PO活性。

    昆蟲響應(yīng)細(xì)菌、真菌、病毒等病原物的免疫反應(yīng)及免疫機(jī)制已多有研究,但昆蟲與昆蟲病原線蟲之間的免疫互作還鮮有報(bào)道,尤其是昆蟲病原線蟲如何影響草地貪夜蛾的免疫反應(yīng)更是甚少研究。本研究分離和鑒定了草地貪夜蛾幼蟲的血細(xì)胞類型;觀察了小卷蛾斯氏線蟲S.carpocapsaeAll侵染草地貪夜蛾幼蟲后草地貪夜蛾幼蟲體內(nèi)血細(xì)胞總數(shù)目變化和血細(xì)胞對(duì)線蟲的包囊反應(yīng);還明確了小卷蛾斯氏線蟲侵染對(duì)草地貪夜蛾血細(xì)胞吞噬活性、淋巴液PO活性、抗菌肽基因表達(dá)以及抗菌活性的影響。本研究所得結(jié)果為揭示昆蟲病原線蟲與草地貪夜蛾免疫互作的內(nèi)在機(jī)理,改善昆蟲病原線蟲對(duì)草地貪夜蛾的防治效果提供了理論依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    1.1.1供試?yán)ハx:2020年8月,從云南省德宏傣族景波族自治州芒市田間采集草地貪夜蛾成蟲,并在中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)昆蟲免疫與生化實(shí)驗(yàn)室內(nèi)建立實(shí)驗(yàn)種群。之后長(zhǎng)期飼養(yǎng)在溫度27℃、相對(duì)濕度70%和光周期16L∶8D的人工氣候培養(yǎng)箱內(nèi)。成蟲在產(chǎn)卵期間補(bǔ)充5%的蜂蜜水,孵化的幼蟲喂食人工飼料Ⅱ(李子園等,2019)。將生長(zhǎng)至3齡的幼蟲單頭飼養(yǎng)在十二孔板內(nèi)并置于培養(yǎng)箱中,取生長(zhǎng)至6齡第1天的幼蟲用于實(shí)驗(yàn)。

    1.1.2供試?yán)ハx病原線蟲:小卷蛾斯氏線蟲S.carpocapsaeAll由四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所饋贈(zèng)。定期用5齡大蠟螟幼蟲擴(kuò)繁線蟲,并參考White(1927)方法收集侵染期線蟲(infective juveniles,IJs)。用雙蒸水清洗侵染期線蟲3次后,以淺水層法于(7±1)℃保存線蟲(Malanetal.,2011)。

    1.1.3供試試劑:Nuclease-free H2O,磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline,PBS),氯化鈉(NaCl),三異丙基乙磺酰(Tris),苯硫脲(phenylthiourea,PTU)和鹽酸多巴胺,購(gòu)自索萊寶生物科技有限公司;反轉(zhuǎn)錄試劑FastKing RT Kit(with gDNase)購(gòu)自天根生化科技(北京)有限公司;熒光定量PCR所用試劑SYBR FAST Universal qPCR Kit購(gòu)自北京啟迪利泰科技有限公司;Lonza無血清培養(yǎng)基(美國(guó)LONZA);pHrodoTMRed金黃色葡萄球菌StaphylococcusaureusBioparticlesTM偶聯(lián)物,蛋白胨和酵母提取物均購(gòu)自賽默飛世爾科技(中國(guó))有限公司。

    1.1.4主要儀器:OLYMPUS倒置顯微鏡,日本Olympus;Nikon倒置熒光顯微鏡,日本Nikon;96孔酶標(biāo)板,美國(guó)Corning;96孔細(xì)胞培養(yǎng)板,南通健格實(shí)驗(yàn)器材有限公司;熒光定量PCR儀,賽默飛世爾科技(中國(guó))有限公司;微量注射器Hamilton,漢密爾頓(天津)工業(yè)技術(shù)有限公司;酶標(biāo)儀Elx808,美國(guó)BioTek。

    1.2 血細(xì)胞的分離與鑒定

    首先用75%乙醇對(duì)草地貪夜蛾6齡第1天的幼蟲體表進(jìn)行消毒,接著用無菌昆蟲針從第2與第3腹足之間戳破小口,收集20 μL血淋巴于預(yù)冷的1.5 mL無菌離心管中。再用預(yù)冷的PBS(含1%飽和PTU)稀釋10倍,最后用移液槍吸取30 μL稀釋后的血淋巴置于雙凹載玻片上,用蓋玻片封片后在倒置顯微鏡下進(jìn)行觀察并拍照。

    1.3 血細(xì)胞總數(shù)目測(cè)定

    對(duì)同一批次的草地貪夜蛾6齡第1天幼蟲體表進(jìn)行消毒,然后用微量注射器從幼蟲第2與第3腹足之間注入1 μL侵染期線蟲懸浮液(用PBS緩沖液稀釋至3 IJs/μL)。將注射后的幼蟲放入培養(yǎng)箱正常飼養(yǎng),分別于注射后0,3,6,9,12,15,18,21和24 h收集20 μL血淋巴,再按照1.2節(jié)所述的方法取10 μL稀釋后的血淋巴轉(zhuǎn)移至血球計(jì)數(shù)板上,在顯微鏡下對(duì)所有血細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)。每個(gè)處理時(shí)間點(diǎn)均設(shè)置4個(gè)生物學(xué)重復(fù),同時(shí)以注射1 μL PBS的草地貪夜蛾幼蟲作為對(duì)照。

    1.4 血細(xì)胞包囊反應(yīng)測(cè)定

    體內(nèi)實(shí)驗(yàn):取部分新收集的侵染期小卷蛾斯氏線蟲置于含有20%甘油的PBS中,并在-20℃冰箱中放置6 h處死線蟲(記為“冷處死”),同時(shí)將部分侵染期小卷蛾斯氏線蟲置于沸水中加熱2 min進(jìn)行處死(記為“熱處死”),然后將未處理和處理后的線蟲用PBS洗滌后均重懸至10 IJs/μL備用。按照1.3節(jié)所述的方法分別向草地貪夜蛾幼蟲體內(nèi)注入1 μL未處理、冷處死或熱處死的線蟲懸浮液,然后置于培養(yǎng)箱正常飼養(yǎng)。分別于注射后0.5和2 h,逐頭解剖蟲體收集線蟲,在倒置顯微鏡下觀察血細(xì)胞對(duì)線蟲的包囊現(xiàn)象并拍照。每個(gè)處理設(shè)置3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。

    體外實(shí)驗(yàn):用75%乙醇對(duì)5頭草地貪夜蛾幼蟲體表進(jìn)行消毒,按照1.2節(jié)所述的方法共收集約100 μL血淋巴于預(yù)冷的1.5 mL無菌離心管,然后用Lonza無血清培養(yǎng)基(含50 ng/μL四環(huán)素)懸浮至3×105cells/mL。取100 μL細(xì)胞懸浮液加入到96孔細(xì)胞培養(yǎng)板內(nèi),25℃靜置孵育10 min,然后加入1 μL未處理、冷處死或熱處死的小卷蛾斯氏線蟲懸浮液(10 IJs/μL)繼續(xù)孵育,2 h后在倒置顯微鏡下觀察包囊現(xiàn)象并拍照。每個(gè)處理設(shè)置3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。

    1.5 血細(xì)胞吞噬活性測(cè)定

    按照1.4節(jié)體內(nèi)實(shí)驗(yàn)所述的方法對(duì)新收集的侵染期小卷蛾斯氏線蟲進(jìn)行處理并重懸至10 IJs/μL,然后取1 μL未處理、冷處死或熱處死的線蟲懸浮液注入草地貪夜蛾幼蟲體內(nèi)。1 h后注入5 μL pHrodoTMRed金黃色葡萄球菌BioparticlesTM偶聯(lián)物(2 mg/mL)。再過2 h,從每頭草地貪夜蛾幼蟲體內(nèi)收集20 μL血淋巴并用含1%飽和PTU的Lonza無血清培養(yǎng)基懸浮至3×105cells/mL,然后取100 μL血淋巴細(xì)胞懸浮液加入到96孔細(xì)胞培養(yǎng)板內(nèi),25℃黑暗條件下靜置孵育45 min。孵育結(jié)束后在倒置熒光顯微鏡下(TRITC檢測(cè)通道)觀察貼壁血細(xì)胞吞噬金黃色葡萄球菌的情況。吞噬率(%)=吞噬細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)×100,以每個(gè)載玻片中3個(gè)視野的平均吞噬率表示細(xì)胞的吞噬活性。每個(gè)處理設(shè)置3個(gè)生物學(xué)重復(fù),以PBS代替線蟲懸浮液作為對(duì)照。

    1.6 血淋巴PO活性測(cè)定

    體外實(shí)驗(yàn):按照1.2節(jié)所述的方法從每頭草地貪夜蛾幼蟲體內(nèi)收集20 μL血淋巴,并用緩沖液(20 mmol/L Tris,150 mmol/L NaCl,pH 8.0)稀釋5倍。然后取30 μL稀釋后的血淋巴與1 μL小卷蛾斯氏線蟲懸浮液(3 IJs/μL)在25℃孵育30 min。取1 μL孵育后的上清加至預(yù)先放入9 μL上述緩沖液的96孔酶標(biāo)板中,25℃孵育10 min,然后迅速加入200 μL多巴胺底物(2 mmol/L,溶解于50 mmol/L,pH 6.5的磷酸鈉鹽緩沖液),在酶標(biāo)儀中測(cè)量490 nm處的吸光值。以每分鐘OD490增加0.001作為一個(gè)酶活力單位。每個(gè)時(shí)間點(diǎn)設(shè)置3個(gè)生物學(xué)重復(fù)和2個(gè)技術(shù)重復(fù),同時(shí)以1 μL PBS代替線蟲懸浮液作為對(duì)照。

    體內(nèi)實(shí)驗(yàn):按照1.3節(jié)所述的方法向草地貪夜蛾幼蟲體內(nèi)注射1 μL侵染期小卷蛾斯氏線蟲(3 IJs/μL),分別于注射后0.5,3,6,9,12,15,18和24 h收集10 μL血淋巴于預(yù)冷的200 μL無菌離心管中,并用上述緩沖液稀釋5倍。然后取1 μL稀釋后的血淋巴,按照上述方法測(cè)定PO活性。每個(gè)處理時(shí)間點(diǎn)設(shè)置3個(gè)生物學(xué)重復(fù)和2個(gè)技術(shù)重復(fù),同時(shí)以注射1 μL PBS的草地貪夜蛾幼蟲作為對(duì)照。

    1.7 抗菌肽基因表達(dá)水平qRT-PCR測(cè)定

    按照1.3節(jié)所述的方法向草地貪夜蛾幼蟲體內(nèi)注射1 μL侵染期小卷蛾斯氏線蟲(3 IJs/μL),注射后12和24 h分別收集草地貪夜蛾幼蟲,并參考孫莉等(2019)的方法逐頭提取蟲體總RNA。用1.2%瓊脂糖凝膠和Nanodrop ND-2000分光光度計(jì)檢測(cè)總RNA的質(zhì)量和濃度后,取2 μg總RNA按照FastKing RT Kit(with gDNase)反轉(zhuǎn)錄試劑盒操作說明書合成cDNA第1鏈。取5 μL合成的cDNA用Nuclease-free H2O稀釋10倍后用作qRT-PCR的模板。所用抗菌肽基因特異性引物借助Primer Premier 6.0軟件設(shè)計(jì)(表1),草地貪夜蛾核糖體蛋白L32基因rpL-32被用作內(nèi)參基因。根據(jù)制造商的說明,使用SYBR FAST Universal qPCR Mix在QuantStudio 1實(shí)時(shí)熒光定量PCR系統(tǒng)上進(jìn)行qRT-PCR。反應(yīng)體系及操作參考Ji等(2022),采用2-ΔΔCt方法計(jì)算基因的相對(duì)表達(dá)量(Livak and Schmittgen,2001)。每個(gè)處理設(shè)置3個(gè)生物學(xué)重復(fù)和3個(gè)技術(shù)重復(fù),同時(shí)以注射1 μL PBS作為對(duì)照。

    表1 本研究所用引物Table 1 Primers used in this study

    1.8 血漿抗菌活性測(cè)定

    按照1.3節(jié)所述的方法向草地貪夜蛾幼蟲體內(nèi)注射1 μL侵染期小卷蛾斯氏線蟲(3 IJs/μL),注射后12和24 h,分別從5頭草地貪夜蛾幼蟲中收集到約100 μL血淋巴(1個(gè)生物學(xué)重復(fù)),迅速加入1 μL飽和PTU溶液,接著于4℃ 400 r/min離心5 min。然后將上清(即血漿)轉(zhuǎn)移至1.5 mL無菌離心管中,并在90℃水浴加熱10 min,再于10 000 r/min離心10 min,收集離心后的上清并用PBS緩沖液將總蛋白濃度定量至3 mg/mL(該樣品稱為“抗菌肽粗提液”)。每個(gè)處理設(shè)置4個(gè)生物學(xué)重復(fù),同時(shí)以注射1 μL PBS作為對(duì)照。

    上述所得的“抗菌肽粗提液”被用于檢測(cè)對(duì)大腸桿菌和藤黃微球菌Micrococcusluteus的抗菌活性。具體做法如下:分別挑取大腸桿菌和藤黃微球菌單菌落,置于10 mL LB液體培養(yǎng)基中,在37℃搖床中培養(yǎng)至終濃度為1×106個(gè)/mL。然后將20 μL上述所得的抗菌肽粗提液分別與80 μL的大腸桿菌或藤黃微球菌混合,再于37℃振蕩孵育3 h。孵育結(jié)束后用PBS連續(xù)稀釋至適宜濃度,將稀釋后的樣品均勻涂布在LB固體培養(yǎng)基上,37℃培養(yǎng)24 h后進(jìn)行菌落計(jì)數(shù),并以菌落形成單位(colony-forming unit,CFU)表示血漿的抗菌活性。每個(gè)處理設(shè)置3個(gè)技術(shù)重復(fù)。

    1.9 數(shù)據(jù)分析

    草地貪夜蛾幼蟲血細(xì)胞總數(shù)目、PO活性、抗菌肽基因表達(dá)水平以及抗菌活性水平在線蟲侵染前后之間的差異顯著性均采用SPSS 17.0軟件(SPSS Inc.,美國(guó))中t檢驗(yàn)(t-test)進(jìn)行分析。細(xì)胞吞噬率經(jīng)反正弦轉(zhuǎn)換后,采用SPSS 17.0中One-way ANOVA進(jìn)行方差分析,并通過Duncan氏新復(fù)極差法進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)。利用Microsoft Excel 2003進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì),通過Adobe Illustrator 2019進(jìn)行繪圖處理。

    2 結(jié)果

    2.1 草地貪夜蛾幼蟲血細(xì)胞類型

    本研究從草地貪夜蛾幼蟲的血淋巴中分離得到血細(xì)胞,并根據(jù)它們?cè)陲@微鏡下的大小和形態(tài)進(jìn)行了分類鑒定。結(jié)果如圖1所示,幼蟲血淋巴中共有5種不同類型的血細(xì)胞,被分別命名為原血細(xì)胞、粒細(xì)胞、類絳色細(xì)胞、珠血細(xì)胞和漿血細(xì)胞。其中,原血細(xì)胞在所有觀察到的血細(xì)胞中體積最小,呈球形,質(zhì)膜無突起(圖1:A)。粒細(xì)胞為卵形或橢圓形,質(zhì)膜粗糙呈顆粒狀(圖1:B)。類絳色細(xì)胞體積較大,近圓形,質(zhì)膜無外突(圖1:C)。珠血細(xì)胞為卵形或圓形,含有大型膜泡,質(zhì)膜呈波浪形或梅花形隆起(圖1:D)。漿血細(xì)胞的形態(tài)多樣,觀察到有紡錘形(圖1:E)、圓形(圖1:F)和葉形(圖1:G) 3種形態(tài),其中圓形的漿血細(xì)胞質(zhì)膜突起呈散射狀(圖1:F)。

    圖1 草地貪夜蛾幼蟲的血細(xì)胞類型Fig.1 Types of hemocytes in Spodoptera frugiperda larvaeA:原血細(xì)胞Prohemocyte;B:粒細(xì)胞Granulocyte;C:類絳色細(xì)胞Oenocytoide;D:珠血細(xì)胞Spherulocyte;E,F,G:分別為紡錘形、圓形和葉形漿血細(xì)胞Spindle-shaped,round and foliate plasmatocytes,respectively.

    2.2 小卷蛾斯氏線蟲侵染對(duì)草地貪夜蛾幼蟲血細(xì)胞總數(shù)目的影響

    外源物入侵后,昆蟲血細(xì)胞會(huì)被招募直接對(duì)外源物進(jìn)行吞噬、集結(jié)和包囊等,所以昆蟲體內(nèi)游離的血細(xì)胞總數(shù)目可能會(huì)發(fā)生變化(Garrigaetal.,2020)。本研究向草地貪夜蛾幼蟲體內(nèi)注射小卷蛾斯氏侵染期線蟲后,在不同時(shí)間點(diǎn)對(duì)血細(xì)胞的總數(shù)目進(jìn)行了計(jì)數(shù)。從圖2可以看出,在注射后0-24 h內(nèi),注射PBS的草地貪夜蛾對(duì)照組幼蟲體內(nèi)血細(xì)胞總數(shù)目基本維持在6×106cells/mL左右,但注射小卷蛾斯氏線蟲的處理組幼蟲體內(nèi)血細(xì)胞總數(shù)目隨處理時(shí)間增加呈“下降-升高-下降”的變化趨勢(shì)。注射線蟲6 h內(nèi),草地貪夜蛾幼蟲體內(nèi)的血細(xì)胞總數(shù)目從6.5×106cells/mL降至4.2×106cells/mL,但與對(duì)照相比差異不顯著(t6=1.32,P>0.05)。此后血細(xì)胞數(shù)目開始增加,在注射線蟲后9 h達(dá)到9.7×106cells/mL;然后又開始下降,注射后12 h血細(xì)胞濃度為8.0×106cells/mL,這兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)的處理組血細(xì)胞總數(shù)目都顯著高于對(duì)照組(9 h:t6=3.96,P<0.01;12 h:t6=2.67,P<0.05)。注射線蟲12 h以后直到停止取樣的24 h,注射了線蟲的草地貪夜蛾幼蟲體內(nèi)的血細(xì)胞總數(shù)目呈下降趨勢(shì),但與對(duì)照相比無顯著差異(t6<1.17,P>0.05)。

    圖2 小卷蛾斯氏線蟲侵染后草地貪夜蛾幼蟲血細(xì)胞總數(shù)目變化Fig.2 Changes in the total number of hemocytes in Spodoptera frugiperda larvae after infection by Steinernema carpocapsae All圖中數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤;星號(hào)和雙星號(hào)分別表示相同注射時(shí)間下兩組間存在顯著差異(P<0.05)和極顯著差異(P<0.01),未作任何標(biāo)注表示該時(shí)間點(diǎn)兩組間不存在顯著差異(P>0.05)(t檢驗(yàn))。Data in the figure are presented as mean±SE.The asterisk and double asterisk indicate significant difference (P<0.05) and extremely significant difference (P<0.01),respectively,between two groups at the same injection time,while no labeling means no significant difference between two groups at this time point (P>0.05)(t-test).圖5-7同。The same for Figs.5-7.

    2.3 草地貪夜蛾幼蟲血細(xì)胞對(duì)小卷蛾斯氏線蟲的包囊反應(yīng)

    為明確草地貪夜蛾幼蟲能否對(duì)小卷蛾斯氏線蟲進(jìn)行包囊,本研究首先對(duì)小卷蛾斯氏線蟲進(jìn)行了不同處理:將一部分侵染期線蟲冷凍處死,此時(shí)線蟲不能再在草地貪夜蛾幼蟲體內(nèi)繁殖;將另一部分線蟲加熱處死,此時(shí)線蟲不僅不能在草地貪夜蛾幼蟲體內(nèi)繁殖,其體表蛋白也因加熱而變性。當(dāng)不同處理的小卷蛾斯氏線蟲被注入草地貪夜蛾體內(nèi)后,0.5 h內(nèi)均未觀察到被血細(xì)胞包囊的線蟲。注入未處理和冷處死的小卷蛾斯氏線蟲后2 h,血細(xì)胞依舊均勻分布,沒有對(duì)線蟲進(jìn)行包囊;但注入熱處死致死的線蟲后2 h,觀察到血細(xì)胞成團(tuán)聚集在線蟲表面,對(duì)其進(jìn)行了明顯的包囊(圖3)。另外,我們還將不同處理的小卷蛾斯氏線蟲與分離的草地貪夜蛾血細(xì)胞在體外進(jìn)行了孵育。結(jié)果顯示,孵育2 h后,未處理線蟲和冷處死線蟲均未被血細(xì)胞包囊,但熱處死后的線蟲體表出現(xiàn)了明顯的血細(xì)胞聚集,幾乎包裹住了整條線蟲(圖3)。

    圖3 草地貪夜蛾幼蟲血細(xì)胞對(duì)小卷蛾斯氏線蟲的包囊Fig.3 Encapsulation of Steinernema carpocapsae All by hemocytes of Spodoptera frugiperda larvae冷處死組中,將侵染期小卷蛾斯氏線蟲置于含有20%甘油的PBS中,并在-20℃冰箱中放置6 h處死線蟲;熱處死組中,將侵染期小卷蛾斯氏線蟲置于沸水中加熱2 min進(jìn)行處死。圖4同。In the cold-killed group,the nematodes of S.carpocapsae All at the infective stage were placed in PBS containing 20% glycerol,and then in refrigerator at -20℃ for 6 h,and in the heat-killed group,the nematodes of S.carpocapsae All at the infective stage were heated to kill in boiling water for 2 min.The same for Fig.4.紅色箭頭表示聚集的血細(xì)胞。Red arrows indicate the clustered hemocytes.

    2.4 小卷蛾斯氏線蟲侵染對(duì)草地貪夜蛾幼蟲血細(xì)胞吞噬活性的影響

    為了檢測(cè)小卷蛾斯氏線蟲侵染對(duì)草地貪夜蛾幼蟲血細(xì)胞吞噬活性的影響,本研究將不同處理的小卷蛾斯氏線蟲注入草地貪夜蛾幼蟲體內(nèi)后,再注入熒光探針標(biāo)記的金黃色葡萄球菌,最后觀察幼蟲血細(xì)胞吞噬金黃色葡萄球菌的情況。熒光偶聯(lián)物標(biāo)記的金黃色葡萄球菌游離在血淋巴(其pH值接近中性)時(shí)不會(huì)發(fā)出熒光,但被血細(xì)胞吞噬后會(huì)因?yàn)樗诃h(huán)境的pH值從中性變?yōu)榱怂嵝詴?huì)發(fā)出紅色熒光。因此,視野中紅色熒光比例越高意味著血細(xì)胞對(duì)金黃色葡萄球菌的吞噬活性越強(qiáng)。結(jié)果顯示,注入PBS的對(duì)照組中約有75%的血細(xì)胞吞噬了熒光標(biāo)記的金黃色葡萄球菌(圖4:E)。然而,當(dāng)注入未處理的小卷蛾斯氏線蟲后,觀察到僅約21%的血細(xì)胞對(duì)金黃色葡萄球菌進(jìn)行了吞噬,吞噬率顯著低于對(duì)照組(P<0.05),紅色熒光信號(hào)也相應(yīng)地明顯減弱(圖4:F和K)。當(dāng)注入冷處死和熱處死的小卷蛾斯氏線蟲后,血細(xì)胞對(duì)金黃色葡萄球菌的吞噬效果與對(duì)照組相比無顯著差異(P>0.05)(圖4)。

    圖4 小卷蛾斯氏線蟲侵染對(duì)草地貪夜蛾幼蟲血細(xì)胞吞噬活性的影響Fig.4 Effects of Steinernema carpocapsae All infection on the phagocytic activity in the hemocytes of Spodoptera frugiperda larvaeA-D,I:血細(xì)胞在明場(chǎng)下的圖片,白色虛線方框示意了血細(xì)胞對(duì)金黃色葡萄球菌的吞噬,其中紅色箭頭指示的是吞噬了金黃色葡萄球菌的血細(xì)胞,綠色箭頭指示的是未吞噬金黃色葡萄球菌的血細(xì)胞Images of hemocytes under bright field,the boxes with white dashed lines indicating the phagocytosis of Staphylococcus aureus by hemocytes,with red arrows indicating the hemocytes containing phagocytosed S. aureus and green arrows showing the hemocytes without phagocytosed S. aureus;E-H,J:血細(xì)胞在620 nm熒光下的照片Images of hemocytes under 620 nm fluorescence field;I,J:分別為圖B和F中白色虛線方框的放大Amplification of boxes with white dashed lines in Figs.B and F,respectively;K:血細(xì)胞吞噬率Rate of hemocyte phagocytosis.圖K數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤;柱上不同字母表示不同處理之間在0.05水平下差異顯著(Duncan氏多重比較)。Data in Fig.K are presented as mean±SE.Different letters above bars indicate significant differences at the 0.05 level (Duncan’s multiple range test).

    2.5 小卷蛾斯氏線蟲侵染對(duì)草地貪夜蛾幼蟲血淋巴PO活性的影響

    檢測(cè)小卷蛾斯氏線蟲侵染對(duì)草地貪夜蛾幼蟲血淋巴PO活性的影響,本研究首先將收集的草地貪夜蛾幼蟲血淋巴與小卷蛾斯氏線蟲在體外進(jìn)行孵育,0.5 h后測(cè)定樣品的PO活性。結(jié)果如圖5所示,與對(duì)照(PBS)比,血淋巴與線蟲體外孵育后,其PO活性顯著降低(t4=2.65,P<0.05)。然后,將小卷蛾斯氏線蟲注入草地貪夜蛾幼蟲體內(nèi),并于不同時(shí)間點(diǎn)直接收集血淋巴測(cè)定其PO活性。結(jié)果顯示,在注射線蟲后的0.5-24 h內(nèi),血淋巴PO活性總體呈現(xiàn)“下降-升高-下降”的變化趨勢(shì)。其中,注射線蟲后0.5 h時(shí)血淋巴PO活性顯著低于對(duì)照(t4=3.01,P<0.05);注射后3和6 h時(shí)血淋巴PO活性恢復(fù)到對(duì)照水平;注射后9和12 h時(shí)血淋巴PO活性又顯著高于對(duì)照(9 h:t4=3.50,P<0.05;12 h:t4=3.31,P<0.05);注射后15 h時(shí)血淋巴PO活性開始降低,但與對(duì)照組之間無顯著差異(t4=2.07,P>0.05)。

    圖5 小卷蛾斯氏線蟲侵染對(duì)草地貪夜蛾幼蟲血淋巴酚氧化酶活性的影響Fig.5 Effects of Steinernema carpocapsae All infection on the phenotoxidase (PO) activity in the hemolymph of Spodoptera frugiperda larvae

    2.6 小卷蛾斯氏線蟲侵染后草地貪夜蛾幼蟲體內(nèi)抗菌肽基因表達(dá)水平的變化

    為了調(diào)查小卷蛾斯氏線蟲侵染對(duì)草地貪夜蛾幼蟲體內(nèi)抗菌肽基因表達(dá)的影響,本研究在向草地貪夜蛾幼蟲體內(nèi)注入小卷蛾斯氏線蟲后12和24 h時(shí),用qRT-PCR檢測(cè)了幾種抗菌肽基因的相對(duì)表達(dá)量。如圖6所示,注射線蟲后12 h時(shí),所檢測(cè)的抗菌肽基因Attacin-A2,Attacin-B1,Cecropin-B3,Cecropin-D,Gallerimycin,Gloverin-3和Lebocin-2的表達(dá)水平均顯著高于對(duì)照組的(Attacin-A2:t4=3.44,P<0.01;Attacin-B1:t4=3.79,P<0.05;Cecropin-B3:t4=2.58,P<0.05;Cecropin-D:t4=7.26,P<0.05;Gallerimycin:t4=10.05,P<0.05;Gloverin-3:t4=4.21,P<0.05;Lebocin-2:t4=4.68,P<0.05)。但注射線蟲后24 h時(shí),Attacin-A2和Gloverin-3的表達(dá)水平反而顯著低于注射PBS的對(duì)照組的(Attacin-A2:t4=3.63,P<0.05;Gloverin-3:t4=3.98,P<0.05),其他抗菌肽基因Attacin-B1,Cecropin-B3,Cecropin-D,Gallerimycin和Lebocin-2的表達(dá)水平則與對(duì)照組相比無顯著差異(Attacin-B1:t4=0.03,P>0.05;Cecropin-B3:t4=0.87,P>0.05;Cecropin-D:t4=2.48,P>0.05;Gallerimycin:t4=2.41,P>0.01;Lebocin-2:t4=2.72,P>0.05)。總體而言,注射小卷蛾斯氏線蟲后12 h,草地貪夜蛾體內(nèi)抗菌肽基因的表達(dá)被顯著誘導(dǎo),但隨著注射時(shí)間的延長(zhǎng),到24 h時(shí)這些抗菌肽基因表達(dá)水平又恢復(fù)到對(duì)照水平,甚至低于對(duì)照水平(圖6)。

    圖6 小卷蛾斯氏線蟲侵染后草地貪夜蛾幼蟲體內(nèi)抗菌肽基因表達(dá)水平變化Fig.6 Changes in the expression levels of antimicrobial peptide genes in Spodoptera frugiperda larvae after infection by Steinernema carpocapsae All

    2.7 小卷蛾斯氏線蟲侵染后草地貪夜蛾幼蟲血漿抗菌活性的變化

    本研究除了檢測(cè)小卷蛾斯氏線蟲侵染后草地貪夜蛾幼蟲體內(nèi)抗菌肽基因的表達(dá)水平,還測(cè)定了草地貪夜蛾幼蟲血漿對(duì)大腸桿菌和藤黃微球菌的抗菌活性。結(jié)果表明,注射小卷蛾斯氏線蟲后12 h時(shí),幼蟲血漿對(duì)大腸桿菌和藤黃微球菌的殺菌活性均顯著高于注射PBS的對(duì)照,存活細(xì)菌數(shù)顯著低于對(duì)照組(大腸桿菌:t6=7.12,P<0.01;藤黃微球菌:t6=10.36,P<0.01)。但時(shí)間延長(zhǎng)至24 h,被線蟲侵染的草地貪夜蛾幼蟲血漿對(duì)大腸桿菌和藤黃微球菌的殺菌活性水平與對(duì)照組之間無顯著差異(大腸桿菌:t6=0.93,P>0.05;藤黃微球菌:t6=0.72,P>0.05)(圖7)。

    圖7 小卷蛾斯氏線蟲侵染后草地貪夜蛾幼蟲血漿抗菌活性的變化Fig.7 Changes in the antibacterial activity of plasma from Spodoptera frugiperda larvae after infection by Steinernema carpocapsae AllCFU:菌落形成單位Colony-forming unit.

    3 討論

    昆蟲為了能夠維持自身正常的生長(zhǎng)、發(fā)育和繁殖,會(huì)借助體內(nèi)發(fā)達(dá)的天然免疫系統(tǒng)來抵御來自生存環(huán)境中的細(xì)菌、真菌、病毒等病原物的侵染(Lemaitre and Hoffmann,2007;Xiaetal.,2018)。而昆蟲病原線蟲等天敵則會(huì)逃避或破壞宿主昆蟲的天然免疫系統(tǒng)進(jìn)而致死昆蟲(Castilloetal.,2011)。昆蟲病原線蟲作為防治草地貪夜蛾的一種潛在生防資源,二者之間勢(shì)必也存在著此消彼長(zhǎng)的免疫互作關(guān)系。本研究選擇了小卷蛾斯氏線蟲來侵染草地貪夜蛾,調(diào)查了線蟲侵染對(duì)草地貪夜蛾血細(xì)胞總數(shù)目、包囊反應(yīng)、吞噬活性、PO活性以及抗菌肽表達(dá)等方面的影響。

    昆蟲血細(xì)胞來源于中胚層時(shí)期衍生的干細(xì)胞,漂浮于開放式血腔或附著于組織和器官,在昆蟲的新陳代謝、變態(tài)發(fā)育和天然免疫中起著至關(guān)重要的作用(Zhangetal.,2018)。目前在昆蟲中共鑒定到7種血細(xì)胞類型,分別為原血細(xì)胞、漿血細(xì)胞、粒細(xì)胞、類絳色細(xì)胞、珠血細(xì)胞、凝血細(xì)胞和脂肪細(xì)胞(Eleftherianosetal.,2021)。鱗翅目昆蟲的血細(xì)胞主要包括前5種,且漿血細(xì)胞和粒細(xì)胞在血淋巴中占比較高(Majumderetal.,2017)。倪若堯等(2018)在光學(xué)相差顯微鏡下觀察到小金蝠蛾Thitarodesxiaojinensis幼蟲血細(xì)胞由粒細(xì)胞、漿細(xì)胞、珠血細(xì)胞和類絳色細(xì)胞4種組成。孫濤等(2021)采用Wright-Giemsa染色法從阿爾泰蝠蛾Hepialusaltaicola幼蟲中分離鑒定到原血細(xì)胞、漿血細(xì)胞、粒細(xì)胞、類絳色細(xì)胞、珠血細(xì)胞和囊血細(xì)胞6種血細(xì)胞。本研究從草地貪夜蛾幼蟲中共分離鑒定到原血細(xì)胞、粒細(xì)胞、類絳色細(xì)胞、珠血細(xì)胞和漿血細(xì)胞5種血細(xì)胞(圖1),這為進(jìn)一步研究血細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞免疫反應(yīng)奠定了基礎(chǔ)。

    病原物入侵昆蟲后,可能會(huì)引起昆蟲血細(xì)胞總數(shù)目的波動(dòng)變化。已有研究發(fā)現(xiàn)二化螟Chilosuppressalis感染球孢白僵菌BBLN2,BBRR1,BBAL4或BBLN1后,總血細(xì)胞和分化血細(xì)胞數(shù)目在注射后3和6 h迅速增加,12和24 h逐漸減少(Shahriarietal.,2021)。本研究中草地貪夜蛾幼蟲被小卷蛾斯氏線蟲侵染后,體內(nèi)血細(xì)胞總數(shù)目隨處理時(shí)間增加總體呈“下降-升高-下降”的變化趨勢(shì)(圖2)。一個(gè)可能的解釋是:在線蟲侵染早期(例如侵染后6 h內(nèi)),草地貪夜蛾血淋巴中游離的血細(xì)胞向受損的角質(zhì)層或個(gè)別線蟲表面聚集導(dǎo)致數(shù)目下降;中期造血器官或組織補(bǔ)充血細(xì)胞用于提高自身免疫能力,故線蟲侵染后9和12 h血細(xì)胞數(shù)目顯著增加;到后期(例如12 h以后)線蟲及其共生細(xì)菌產(chǎn)生的毒素破壞了血細(xì)胞結(jié)構(gòu)致使數(shù)目再次下降(Satyavathietal.,2014;李蕾等,2020;常豆豆等,2022)。

    昆蟲血細(xì)胞可對(duì)包括昆蟲病原線蟲在內(nèi)的外源物進(jìn)行包囊和吞噬等反應(yīng)(Arteaga Blancoetal.,2017;Garrigaetal.,2020)。對(duì)于個(gè)體較大的昆蟲病原線蟲,血細(xì)胞會(huì)粘附并聚集在其體表形成一個(gè)“鞘”將線蟲緊緊包裹在內(nèi)部,與此同時(shí)黑色素逐漸沉積在“鞘”表面,共同導(dǎo)致線蟲死亡(Dziedziechetal.,2020)。已有研究表明水椰八角鐵甲Octodontanipae血細(xì)胞不能包囊小卷蛾斯氏線蟲,但能包囊熱處死過的小卷蛾斯氏線蟲表皮(Sandaetal.,2018)。日本斑翅果蠅Drosophilasuzukii血細(xì)胞可以包囊用磷脂酶處理過的小卷蛾斯氏線蟲B14(Garrigaetal.,2020)。本研究中體內(nèi)體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果也表明草地貪夜蛾幼蟲血細(xì)胞不能包囊活的以及冷處死的小卷蛾斯氏線蟲,但可以包囊熱處死致死的線蟲(圖3)。推測(cè)其原因可能是:小卷蛾斯氏線蟲表皮的外膜蛋白可以逃避草地貪夜蛾幼蟲血細(xì)胞的識(shí)別并避免被包囊,但當(dāng)高溫破壞表皮外膜蛋白結(jié)構(gòu)后,線蟲表皮的保護(hù)作用失效,所以熱處死的線蟲能被血細(xì)胞識(shí)別并被包囊。但值得注意的是,只有未經(jīng)任何處理的小卷蛾斯氏線蟲可顯著抑制草地貪夜蛾幼蟲血細(xì)胞的吞噬活性,冷或熱處死的線蟲對(duì)草地貪夜蛾血細(xì)胞的吞噬活性均無影響(圖4)。這暗示著小卷蛾斯氏線蟲的表皮蛋白可能會(huì)影響草地貪夜蛾對(duì)線蟲的包囊,但不會(huì)影響草地貪夜蛾血細(xì)胞本身的吞噬活性。究其原因可能是只有活線蟲體表會(huì)產(chǎn)生分泌物,而分泌物中含有某些蛋白酶、蛋白酶抑制劑、毒素相關(guān)蛋白等因子能抑制血細(xì)胞的吞噬活性(Luetal.,2017;Changetal.,2019)。具體原因還需要進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)來驗(yàn)證。

    當(dāng)外源物入侵后,昆蟲除了開啟細(xì)胞免疫反應(yīng)外,也會(huì)啟動(dòng)自身的體液免疫系統(tǒng)來試圖進(jìn)行防御。其中,黑化反應(yīng)是一種重要的體液免疫反應(yīng)類型,在黑化反應(yīng)中昆蟲的酚氧化酶原會(huì)被激活導(dǎo)致血淋巴PO活性的增強(qiáng)(Lietal.,2015;Wang QRetal.,2022)。有研究表明在小卷蛾斯氏線蟲侵入紅棕象甲R(shí)hynchophorusferrugineus的0.5 h內(nèi),紅棕象甲血淋巴的PO活性顯著降低(Mastoreetal.,2015)。嗜菌異小桿線蟲H06和小卷蛾斯氏線蟲對(duì)水椰八角鐵甲的酚氧化酶原激活系統(tǒng)均具有很強(qiáng)的抑制作用(Sandaetal.,2022)。在本研究中,小卷蛾斯氏線蟲在侵入的0.5 h內(nèi)也是顯著抑制了草地貪夜蛾幼蟲血淋巴的PO活性,與上述研究結(jié)果一致。但線蟲侵入后9和12 h,血淋巴PO活性又顯著升高,之后開始逐漸下降(圖5)。這可能是因?yàn)?和12 h時(shí)線蟲以及釋放的共生細(xì)菌數(shù)目都還較少,反而能激活草地貪夜蛾的免疫系統(tǒng)引起PO活性升高;隨著線蟲及共生細(xì)菌釋放的各種毒性因子的逐漸積累,草地貪夜蛾的免疫器官或組織受到損傷,導(dǎo)致PO活性逐漸降低。

    除黑化反應(yīng)外,昆蟲體液免疫反應(yīng)的另一個(gè)重要類型是抗菌肽的產(chǎn)生(Yangetal.,2021;Longetal.,2022)。當(dāng)昆蟲感染病原細(xì)菌、真菌等外源物后,抗菌肽基因會(huì)被誘導(dǎo)表達(dá),進(jìn)一步分泌到血淋巴中導(dǎo)致昆蟲血淋巴的殺菌活性大大提高。例如,小卷蛾斯氏線蟲侵入水椰八角鐵甲后8,16和24 h,寄主體內(nèi)抗菌肽基因Attacin-C1,Attacin-C2,Attacin-C3以及Defensin-2B的表達(dá)水平均顯著升高(Sandaetal.,2018)。草地貪夜蛾感染萊氏綠僵菌Metarhiziumrileyi后48 h,其血漿可以顯著抑制大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的生長(zhǎng)(Wang JLetal.,2022)。本研究向草地貪夜蛾幼蟲注射小卷蛾斯氏線蟲后12 h,抗菌肽基因Attacin-A2,Attacin-B1,Cecropin-B3,Cecropin-D,Gallerimycin,Gloverin-3以及Lebocin-2均被顯著誘導(dǎo),但注射線蟲后24 h這些抗菌肽基因的表達(dá)水平又恢復(fù)到對(duì)照甚至低于對(duì)照水平(圖6)。與此同時(shí),草地貪夜蛾幼蟲血漿對(duì)大腸桿菌和藤黃微球菌的殺菌活性也是12 h時(shí)顯著上升,24 h時(shí)與對(duì)照無顯著差異(圖7)。推測(cè)小卷蛾斯氏線蟲侵入后12 h,線蟲以及釋放的少量共生細(xì)菌激活了草地貪夜蛾體內(nèi)可以誘導(dǎo)抗菌肽產(chǎn)生的Toll或Imd信號(hào)通路,進(jìn)而引起了抗菌肽基因的顯著表達(dá)和血漿抗菌活性的升高;線蟲侵入后24 h,線蟲和共生細(xì)菌的數(shù)量已經(jīng)達(dá)到一定規(guī)模,草地貪夜蛾的免疫系統(tǒng)被破壞,導(dǎo)致抗菌肽的轉(zhuǎn)錄和血漿的抗菌活性都出現(xiàn)下降。

    綜上所述,小卷蛾斯氏線蟲在侵入早期,通過抑制草地貪夜蛾幼蟲的包囊和吞噬能力以及血淋巴的PO活性來建立感染;隨后草地貪夜蛾通過提高自身的血淋巴PO活性、抗菌肽基因表達(dá)水平以及抗菌活性水平來試圖抵御線蟲的侵染;后期隨著線蟲的成功定殖,草地貪夜蛾的免疫系統(tǒng)被抑制或破壞,導(dǎo)致免疫活性降低。本研究?jī)H從免疫學(xué)的角度初步解析了小卷蛾斯氏線蟲與草地貪夜蛾互作關(guān)系,為改善昆蟲病原線蟲對(duì)草地貪夜蛾的生防效果提供了理論依據(jù),具體的免疫互作機(jī)制還有待于進(jìn)一步研究。小卷蛾斯氏線蟲攜帶的共生細(xì)菌在線蟲與草地貪夜蛾免疫互作中所扮演的角色也有待于進(jìn)一步明確。

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