果蠅胰島素樣肽8(Dilp8)的功能及作用機(jī)制

南 楠,閆志鵬,張亞如,秦國(guó)華,桑 楠

(山西大學(xué)環(huán)境與資源學(xué)院,太原 030006)

果蠅DrosophilaDilp8于2012年被Garelli等和Colombani等發(fā)現(xiàn)，Garelli等(2012)通過(guò)建立引起發(fā)育延遲的成蟲盤腫瘤模型，并將其與正常果蠅對(duì)比，篩選出了潛在的可以協(xié)調(diào)發(fā)育時(shí)間的分泌因子CG14059；Colombani等(2012)通過(guò)使用UAS-Gal4系統(tǒng)驅(qū)動(dòng)成蟲盤中Rpl和avl基因的RNAi引起幼蟲發(fā)育延遲，之后再使用大量的RNAi品系篩選出敲低表達(dá)后對(duì)幼蟲發(fā)育延遲有拯救作用的基因。由于被篩選出來(lái)的基因產(chǎn)物具有胰島素-松弛素肽家族保守的6-半胱氨酸(6-cysteine)基序，所以將其蛋白命名為果蠅胰島素樣肽8(Drosophilainsulin-like peptide 8,Dilp8)。他們同時(shí)將這一發(fā)現(xiàn)發(fā)表于《Science》雜志上，由此開啟了人們對(duì)于果蠅中Dilp8的探索。自Dilp8被發(fā)現(xiàn)的10年以來(lái)，有30余篇文獻(xiàn)是關(guān)于其的研究，其中62.16%探索了Dilp8的功能和作用機(jī)制，16.22%是關(guān)于其受體富含亮氨酸重復(fù)序列的G蛋白偶聯(lián)受體3(leucine-rich repeat-containing G protein-coupled receptor 3,Lgr3)的發(fā)現(xiàn)和功能，另外16.22%是綜述類文章，剩余的5.41%在研究其他內(nèi)容時(shí)提到了Dilp8。其中6篇綜述類文章中，Hariharan(2012)闡述了果蠅的生長(zhǎng)過(guò)程，并對(duì)Garelli等(2012)和Colombani等(2012)的研究結(jié)果進(jìn)行了總結(jié)；Hackney和Cherbas(2014)論述了多種類型的損傷會(huì)導(dǎo)致生物生長(zhǎng)延遲，其中提到了蛻皮激素和Dilp8可能參與這一過(guò)程；Gontijo和Garelli(2018)對(duì)Dilp8和Lgr3之間相互作用的方式和功能進(jìn)行了闡述；另外3篇綜述(Juarez-Carreoetal.,2018;Delanoue and Romero,2020;Texadaetal.,2020)在闡釋生物生長(zhǎng)過(guò)程中影響體型大小、對(duì)稱性和生長(zhǎng)發(fā)育的多種因素時(shí)，提到Dilp8在其中的作用。目前還缺乏對(duì)Dilp8功能和作用機(jī)制進(jìn)行系統(tǒng)性論述的文章。本文對(duì)Dilp8的受體Lgr3進(jìn)行了簡(jiǎn)單論述，總結(jié)了研究者們發(fā)現(xiàn)的Dilp8的功能及在分子水平上的作用機(jī)制，補(bǔ)充了對(duì)Dilp8的最新研究結(jié)果。

1 Dilp8的受體Lgr3

Dilp8的受體是Lgr3，是高度保守的松弛素家族肽受體(relaxin family peptide receptors,RXFPs)家族的成員。在果蠅幼蟲，Lgr3主要在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中腹側(cè)神經(jīng)索(ventral nerve cord,VNC)的4個(gè)神經(jīng)元內(nèi)表達(dá)，它通過(guò)作用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)元中的一個(gè)新亞群，在Dilp8依賴的發(fā)育穩(wěn)定性通路中發(fā)揮關(guān)鍵作用(Colombanietal.,2015;Garellietal.,2015;Jaszczaketal.,2016)。在果蠅成蟲中，Lgr3在大腦和VNC的大量神經(jīng)元，腹位心的部分外周神經(jīng)元以及輸卵管附近的一組卵泡細(xì)胞中均有表達(dá)，與Dilp8一起調(diào)節(jié)雌果蠅的排卵(Liao and N?ssel,2020)。此外，有研究表明Lgr3與果蠅的性別特異性調(diào)控有關(guān):果蠅的性別調(diào)控基因DsxF和FruM調(diào)節(jié)Lgr3的表達(dá)，F(xiàn)ru的B亞型抑制雄果蠅中束中Lgr3的表達(dá)，DsxF抑制VNC中Lgr3的表達(dá)(Meissneretal.,2016)。

2 Dilp8的功能及作用機(jī)制

Dilp8的基因和蛋白結(jié)構(gòu)如圖1所示，其蛋白功能結(jié)構(gòu)域還未完全清楚，需要進(jìn)一步探索。圖2為Dilp8與其他7種果蠅胰島素的蛋白氨基酸序列對(duì)比圖。雖然Dilp8屬于果蠅胰島素樣肽，但其功能與其他7種Dilps相比具有很大的差異。Dilp1,2,3和5主要在幼蟲腦中樞神經(jīng)細(xì)胞(median neurosecretory cells,MNCs)中表達(dá)，而成蠅MNCs中不表達(dá)Dilp1(Gr?nkeetal.,2010)。Dilp1的主要功能是促進(jìn)機(jī)體生長(zhǎng)發(fā)育；Dilp2也在成蟲盤和唾液腺中表達(dá)，主要調(diào)節(jié)果蠅體內(nèi)海藻糖的濃度，也是調(diào)控果蠅壽命的關(guān)鍵信號(hào)；在果蠅幼蟲和成蟲的腸道肌細(xì)胞中也有Dilp3的表達(dá)，Dilp3負(fù)責(zé)調(diào)節(jié)腸道干細(xì)胞的生長(zhǎng)增殖，同時(shí)也是循環(huán)海藻糖的主要調(diào)節(jié)劑；Dilp4在果蠅胚胎中腸和中胚層中表達(dá)，Dilp5在雌果蠅卵泡細(xì)胞中也有表達(dá)，Dilp4和Dilp5低表達(dá)時(shí)抑制果蠅生長(zhǎng)，過(guò)表達(dá)時(shí)促進(jìn)生長(zhǎng)發(fā)育，Dilp5對(duì)脂質(zhì)和碳水化合物的代謝至關(guān)重要；Dilp6在果蠅脂肪體和幼蟲腸道中表達(dá)，促進(jìn)果蠅從幼蟲向蛹的轉(zhuǎn)變，過(guò)表達(dá)時(shí)可以使果蠅壽命延長(zhǎng)；Dilp7主要在胸腹神經(jīng)節(jié)中表達(dá)，與雌果蠅排卵相關(guān)(Broughtonetal.,2008;Gr?nkeetal.,2010;Biglouetal.,2021;Semaniuketal.,2021)。此外，與Dilp8不同的是，Dilp1-7只有1種已知受體dInR(Drosophilainsulin receptor)(N?sseletal.,2013)。Dilp8的功能如下所述。

圖1 Dilp8的基因(A)和蛋白(B)結(jié)構(gòu)Fig.1 Gene (A) and protein (B) structure of Dilp8UTR:非翻譯區(qū)Untranslated region;CDS:編碼序列Coding sequence.蛋白結(jié)構(gòu)示意圖來(lái)源于UniProt(https:∥www.uniprot.org/)。不同顏色代表AlphaFold預(yù)測(cè)，用每殘基置信度分?jǐn)?shù)(pLDDT)表示結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)的準(zhǔn)確度，數(shù)值越高表明置信度越高。The schematic diagram of the protein structure is derived from UniProt (https:∥www.uniprot.org/).Different colors represent the AlphaFold prediction,and the accuracy of structural prediction is expressed by the per-residue confidence score (pLDDT),with higher values indicating higher confidence.

圖2 Dilp1-8蛋白氨基酸序列Fig.2 Amino acid sequences of Dilp1-8 proteins蛋白序列來(lái)源于NCBI(https:∥www.ncbi.nlm.nih.gov/)。紅色字體表示蛋白序列中的相同氨基酸。The protein sequence is derived from NCBI (https:∥www.ncbi.nlm.nih.gov/).Red font indicates identical amino acids in the protein sequence.

2.1 協(xié)調(diào)果蠅組織生長(zhǎng)和發(fā)育時(shí)間

在動(dòng)物發(fā)育過(guò)程中，器官組織需協(xié)調(diào)生長(zhǎng)才能生成具有固定比例和一定對(duì)稱性的健康個(gè)體，而Dilp8在這一功能中起核心作用。Boone等(2016)研究表明，Dilp8突變體果蠅會(huì)表現(xiàn)出不對(duì)稱性，且Hippo通路的轉(zhuǎn)錄共激活子Yorkie及其DNA偶聯(lián)因子Scalloped通過(guò)Dilp8啟動(dòng)子中的Hippo響應(yīng)元件直接調(diào)節(jié)Dilp8的表達(dá)。Pacman是一種高度保守的細(xì)胞質(zhì)核糖核酸酶，從5′-3′方向上降解RNA，Jones等(2015)研究表明，Pacman會(huì)抑制Dilp8的表達(dá)。Heredia等(2021)發(fā)現(xiàn)Dilp8-Lgr3通過(guò)抑制幼蟲角質(zhì)層硬化和控制幼蟲唾液腺分泌“膠”的擴(kuò)散參與果蠅蛹化過(guò)程，并且作用于20-羥基蛻皮激素(20-hydroxyecdysone,20HE)信號(hào)的下游，同時(shí)他們認(rèn)為Dilp8可能屬于蛹固定化因子/前縮因子(puparium immobilization factor/anterior retraction factor,PIF/ARF)。DaCrema等(2021)研究發(fā)現(xiàn)果蠅翼盤上皮屏障通過(guò)將Dilp8與血淋巴物理隔離來(lái)限制Dilp8的作用，從而進(jìn)一步抑制大腦和前胸腺的信號(hào)傳導(dǎo)，這一過(guò)程決定了再生檢查點(diǎn)的持續(xù)時(shí)間；他們還證明了Dilp8通過(guò)Lgr3抑制蛻皮素的產(chǎn)生。以上是在果蠅正常發(fā)育過(guò)程中Dilp8的已知作用，其中的具體調(diào)控機(jī)制還不完善，需要進(jìn)一步的研究。

果蠅在生長(zhǎng)過(guò)程中受到損傷時(shí)，Dilp8會(huì)通過(guò)延長(zhǎng)發(fā)育時(shí)間來(lái)緩解損傷，以確保果蠅生長(zhǎng)為體型正常和具有對(duì)稱性的個(gè)體。研究表明，Dilp8表達(dá)會(huì)導(dǎo)致果蠅幼蟲蛹化時(shí)間延長(zhǎng)，體型差異變小，不對(duì)稱性減小(Garellietal.,2012)。當(dāng)損傷發(fā)生時(shí)，會(huì)有一系列通路被激活來(lái)調(diào)控Dilp8的表達(dá)。在凋亡細(xì)胞中，PERK/ATF4通過(guò)激活Rac1和Slpr來(lái)激活JNK通路，進(jìn)而導(dǎo)致Dilp8的表達(dá)(Demayetal.,2014)。當(dāng)幼蟲受到損傷時(shí)會(huì)激活JNK信號(hào)，進(jìn)一步激活Upd/JAK/STAT信號(hào)通路，從而導(dǎo)致Dilp8的表達(dá)(Katsuyamaetal.,2015)。Skinner等(2015)研究表明，染色質(zhì)修飾基因trithorax負(fù)調(diào)控puckered(JNK信號(hào)的靶基因)的表達(dá)，從而調(diào)控JNK通路和Dilp8的表達(dá)。Boulan等(2019)發(fā)現(xiàn)，核糖體小亞基蛋白R(shí)pS12會(huì)觸發(fā)應(yīng)激反應(yīng)轉(zhuǎn)錄因子Xrp1的表達(dá)，從而起到調(diào)控Dilp8的作用。Sanchez等(2019)研究表明，果蠅生長(zhǎng)異常會(huì)激活Dmp53下游的Eiger-JNK信號(hào)通路，進(jìn)而激活Dilp8的表達(dá)。Ray和Lakhotia(2019)的研究表明，在果蠅蛹早期發(fā)育階段激活Ras/JNK驅(qū)動(dòng)的Dilp8會(huì)對(duì)機(jī)體內(nèi)穩(wěn)態(tài)產(chǎn)生不利影響。Dilp8被激活后，通過(guò)激活雙側(cè)腦間Lgr3-陽(yáng)性神經(jīng)元的cAMP信號(hào)來(lái)激活Lgr3受體(Garellietal.,2015)。這導(dǎo)致腦間部Lgr3陽(yáng)性(pars intercerebralis Lgr3-positive,PIL)神經(jīng)元和生長(zhǎng)協(xié)調(diào)Lgr3(growth coordinating Lgr3,GCL3)神經(jīng)元功能的增加，PIL/GCL神經(jīng)元將信號(hào)傳遞到前胸腺(Gontijo and Garelli,2018)。隨后，disembodied和phantom的表達(dá)會(huì)降低，從而抑制蛻皮素的合成來(lái)延緩果蠅發(fā)育(Vallejoetal.,2015)。Karanja等(2022)證明了受損成蟲盤中的蛻皮素信號(hào)對(duì)于Dilp8的上調(diào)是必要的。同時(shí)，Dilp8/Lgr3通過(guò)抑制大腦胰島素產(chǎn)生細(xì)胞中Dilp3和Dilp5的產(chǎn)生，并將信息傳遞給促前胸腺激素(prothoracicotropic hormone,PTTH)神經(jīng)元，進(jìn)一步抑制保幼激素的合成，來(lái)平衡果蠅的生長(zhǎng)和生長(zhǎng)周期，若Dilp8/Lgr3失衡，果蠅體型會(huì)出現(xiàn)不對(duì)稱性(Garellietal.,2012;Hackney and Cherbas,2014)。此外，Jaszczak等(2015)研究表明，Dilp8通過(guò)激活前胸腺中的一氧化氮合酶(NOS)來(lái)抑制蛻皮激素的產(chǎn)生，隨后他們發(fā)現(xiàn)Lgr3位于NOS的上游(Jaszczaketal.,2016)。

2.2 調(diào)節(jié)雌果蠅的排卵

Liao和N?ssel(2020)的研究表明，在成年果蠅中，Dilp8主要在雌果蠅卵巢中成熟卵子周圍的卵泡細(xì)胞中表達(dá)，其受體Lgr3在中樞神經(jīng)系統(tǒng)和輸卵管附近的卵泡細(xì)胞中表達(dá)。Dilp8既可以作用于輸卵管肌神經(jīng)元，使輸卵管收縮，也可以通過(guò)旁分泌效應(yīng)直接作用于卵泡細(xì)胞，誘導(dǎo)卵泡破裂和隨后的排卵。Dilp8表達(dá)降低時(shí)，果蠅產(chǎn)卵量減少，而卵巢中保留的卵子數(shù)量增多，說(shuō)明卵巢中的Dilp8表達(dá)降低對(duì)雌果蠅的排卵有抑制作用。

2.3 腫瘤源性Dilp8與厭食癥有關(guān)

腫瘤組織分泌的Dilp8與Lgr3結(jié)合后，通過(guò)上調(diào)大腦中的厭食性核連蛋白1(nucleobinding 1,NUBC1)，下調(diào)促食欲短神經(jīng)肽F(short neuropeptide F,sNPF)和NPF的表達(dá)，使果蠅食欲下降，而抑制Dilp8的表達(dá)可逆轉(zhuǎn)厭食表型(Yeometal.,2021)。Dilp8與人類腫瘤患者體內(nèi)分泌的胰島素樣肽3(insulin-like peptide 3,INSL3)同源(Yeometal.,2021)。在正常情況下，INSL3在男性中主要在睪丸間質(zhì)細(xì)胞表達(dá)，與胎兒的睪丸下降有關(guān)，在孕婦妊娠中期時(shí)，若胎兒為男性，則可在羊水中檢測(cè)到INSL3，若胎兒為女性則檢測(cè)不到(Anand-Ivelletal.,2011)。男性青春期時(shí)INSL3的水平持續(xù)升高，與睪丸體積和生殖能力相關(guān)，此外還與甲狀腺和骨骼等功能有關(guān)(Assisetal.,2016;Ferlinetal.,2018;Minagawaetal.,2018;Esteban-Lopez and Agoulnik,2020)。在女性中，INSL3主要在卵巢的黃體細(xì)胞和卵泡膜細(xì)胞中表達(dá)，與雌激素的分泌和生殖能力有關(guān)(Esteban-Lopez and Agoulnik,2020;Pitiaetal.,2021)。人體腫瘤分泌的INSL3同樣與患者的食欲減退有關(guān)(Yeometal.,2021)。INSL3的受體是RXFP2，后者與果蠅Lgr3同源(Fengetal.,2007;Shokrietal.,2020;Yeometal.,2021)。

3 小結(jié)與展望

綜上，目前對(duì)果蠅Dilp8的研究整體尚處于起步階段，無(wú)論是其基因結(jié)構(gòu)和功能，還是其對(duì)果蠅生長(zhǎng)發(fā)育、受損組織修復(fù)和排卵能力等的調(diào)控機(jī)制和通路還存在著相當(dāng)?shù)闹R(shí)空白。本研究對(duì)自其被發(fā)現(xiàn)到如今10年時(shí)間里的研究進(jìn)行了系統(tǒng)綜述，總結(jié)了前人發(fā)現(xiàn)的Dilp8參與協(xié)調(diào)果蠅組織生長(zhǎng)發(fā)育和調(diào)控雌果蠅排卵代謝等生理過(guò)程。未來(lái)對(duì)Dilp8的研究具有重要意義，生物生長(zhǎng)的對(duì)稱性和協(xié)調(diào)性是一個(gè)尚未解決的科學(xué)問題，隨著對(duì)Dilp8更深入的了解必然會(huì)推動(dòng)該方面研究，同時(shí)也對(duì)避免產(chǎn)生畸形生物以及推動(dòng)人類優(yōu)生優(yōu)育的研究提供了一個(gè)新的思路。此外，INSL3在女性生殖方面的功能尚不清楚，Dilp8可輔助人們對(duì)這一功能的研究。且腫瘤源性Dilp8的發(fā)現(xiàn)對(duì)癌癥患者厭食癥的治療具有重要意義。值得注意的是，Dilp8/Lgr3與人類INSL3/RXFP2高度同源，對(duì)果蠅Dilp8深入全面地探索對(duì)于人類疾病的臨床轉(zhuǎn)化研究具有很大的應(yīng)用前景。盡管目前對(duì)于果蠅Dilp8的研究較為緩慢，但隨著測(cè)序技術(shù)和一些新興分子生物化學(xué)技術(shù)的發(fā)展，對(duì)Dilp8及其受體與調(diào)控機(jī)制的分析會(huì)倍道而進(jìn)，Dilp8的研究正迎來(lái)春天。