家蠶Wnt信號通路下游關(guān)鍵基因Pangolin轉(zhuǎn)錄剪接體X3的克隆和分析

王葉菁,付秋杰,殷子晴,何華偉,*

(1.西南大學(xué),家蠶基因組生物學(xué)國家重點實驗室,生物學(xué)研究中心,西部(重慶)科學(xué)城種質(zhì)創(chuàng)制大科學(xué)中心,重慶400715;2.西南大學(xué)西塔學(xué)院,重慶400715)

Wnt(wingless-related integration site,Wnt)是一類高度保守的富含半胱氨酸的蛋白，參與胚胎細胞命運決定、細胞遷移、細胞極性、神經(jīng)模式、器官發(fā)生、細胞增殖分化、組織穩(wěn)態(tài)和再生等過程(Nusse,1992;Logan and Nusse,2004;Komiya and Habas,2008)。目前已經(jīng)鑒定了3種Wnt信號通路：經(jīng)典Wnt通路(canonical Wnt pathway)、非經(jīng)典Wnt/平面細胞極化通路(noncanonical Wnt/planar cell polarity pathway,Wnt/PCP)和非經(jīng)典Wnt/鈣通路(noncanonical Wnt/calcium pathway)。Wnt/PCP通路通過調(diào)控細胞骨架控制細胞形狀，Wnt/鈣通路調(diào)控細胞內(nèi)鈣離子的濃度(Miller,2001;Komiya and Habas,2008)。經(jīng)典Wnt通路是指Wnt蛋白與細胞表面Frizzled受體家族結(jié)合后，抑制下游Axin/GSK-3/APC復(fù)合物，從而提高了胞漿內(nèi)β-catenin的穩(wěn)定性。部分β-catenin進入細胞核，與TCF/LEF轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合，促進特定基因的表達(Jandaetal.,2012;Stamosetal.,2014;Jandaetal.,2017;Nusse and Clevers,2017)。

研究發(fā)現(xiàn)，黑腹果蠅Drosophilamelanogaster基因組中包含1個Wnt/β-catenin通路的核內(nèi)效應(yīng)轉(zhuǎn)錄因子dTCF/Pangolin(Brunneretal.,1997)。當(dāng)Wnt不存在時，β-catenin在細胞內(nèi)被泛素化降解，Pangolin與下游靶標基因啟動子上游的順式調(diào)控元件結(jié)合，抑制靶標基因的表達；當(dāng)Wnt信號被激活時，β-catenin在細胞內(nèi)穩(wěn)定，逐漸累積進入細胞核，與Pangolin結(jié)合，激活下游靶標基因的表達(Nusse and Clevers,2017)，從而調(diào)控了果蠅的胚胎分化、組織生長、細胞凋亡和翅發(fā)育等過程(Oberhoferetal.,2014;Steinhart and Angers,2018;Songetal.,2019)。因此，Pangolin在Wnt/β-catenin信號通路傳導(dǎo)過程中發(fā)揮了不可替代的關(guān)鍵作用。

家蠶Bombyxmori是鱗翅目昆蟲研究的模式生物(Xiaetal.,2014)，其基因組中包含多個Wnt基因(Dingetal.,2019)。研究發(fā)現(xiàn)，Wnt信號通路參與了家蠶體色塑造(Yamaguchietal.,2013)和胚胎發(fā)育(Zhangetal.,2015)。然而，關(guān)于家蠶Wnt/β-catenin通路下游關(guān)鍵基因Pangolin仍然知之甚少。本研究以家蠶為研究對象，從幼蟲中腸和血淋巴克隆了Pangolin isoforms A/H/I/S基因轉(zhuǎn)錄剪接本(transcript variant)X3(PangolinX3)，并對其進行了分析，為深入研究家蠶Pangolin的功能提供了支持。

1 材料與方法

1.1 實驗昆蟲

家蠶品種大造(Dazao)由西南大學(xué)生物學(xué)研究中心、家蠶基因組生物學(xué)國家重點實驗室保存并提供。在溫度25℃、相對濕度75%和光周期12L∶12D下，利用新鮮適齡桑葉飼喂家蠶，保證幼蟲的自然生長發(fā)育。

1.2 Pangolin X3的克隆和序列分析

以Pangolin(GenBank登錄號:101742450)同源異構(gòu)體PangolinX3 (GenBank登錄號:XM_038020921)為主要研究對象，從NCBI數(shù)據(jù)庫檢索其編碼序列(coding sequence,CDS)，利用Oligo 7.0軟件(DBA Oligo,Colorado,美國)設(shè)計正向引物5′-GGATCCATGCCGCATGCTCACTCGAGTTCGG-3′和反向引物5′-GGGCCCCTACGAGACGGAGATGACCT CGTGC-3′，以家蠶5齡第3天中腸和血淋巴cDNA為模板，利用PCR進行克隆，反應(yīng)體系(50 μL):正反向引物(10 μmol/L)各2 μL,模板2 μL,Q5聚合酶1 μL,Q5 Master Mix (2×) 25 μL,MiliQ H2O 18 μL。PCR反應(yīng)程序:98℃ 30 s;98℃ 9 s,68℃ 30 s,72℃ 90 s,30個循環(huán);最后72℃ 2 min。收集PCR產(chǎn)物，利用 Blunt-Zero試劑盒(Vazyme,南京)進行連接，然后轉(zhuǎn)化大腸桿菌EscherichiacoliTrans1-T1感受態(tài)細胞(全式金，北京)，經(jīng)菌液PCR驗證后送華大基因公司測序驗證。利用SilkDB 3.0 (https:∥silkdb.bioinfotoolkits.net/main/ species-info/-1)分析PangolinX3 CDS、基因序列和染色體定位，SMART (http:∥smart.embl-heidelberg.de/)分析其結(jié)構(gòu)域特征。

利用NCBI數(shù)據(jù)庫在線工具檢索不同昆蟲的Pangolin蛋白序列。對于具有多個異構(gòu)體形式的Pangolin，選擇Pangolin isoform X3或與家蠶Pangolin X3序列高度相似的異構(gòu)體。將家蠶B.mori的Pangolin X3與黑腹果蠅D.melanogaster、野蠶B.mandarina、棉鈴蟲Helicoverpaarmigera、斜紋夜蛾Spodopteralitura、小菜蛾P(guān)ierisrapae、大樺斑蝶Danausplexippus、偏瞳蔽眼蝶Bicyclusanynana、斑點木蝶Parargeaegeria和柑橘鳳蝶Papilioxuthus的Pangolin異構(gòu)體進行蛋白質(zhì)多序列比對，然后利用ESPript 3.0 (https:∥espript.ibcp.fr/ESPript/cgi-bin/ ESPript.cgi)對結(jié)果進行渲染，最后利用MEGA X的鄰接(neighbor-joining)法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，分析這些昆蟲進化過程中的親緣關(guān)系。

1.3 Pangolin X3基因表達的qRT-PCR分析

為研究PangolinX3在家蠶中的生物學(xué)功能，利用qRT-PCR分析家蠶5齡第3天幼蟲不同組織中PangolinX3的表達。利用無RNA酶工具解剖5齡第3天家蠶，收集同一頭幼蟲的不同組織(頭、血淋巴、體壁、性腺、中腸、前部絲腺、中部絲腺、后部絲腺、脂肪體和馬氏管)樣品，分別用PBS緩沖液清洗后置于1.5 mL無RNA酶離心管中，然后加入液氮研磨，利用RNAeasy動物RNA抽提試劑盒(碧云天，北京)分別提取不同組織的RNA。以提取的RNA為模板，利用碧云天BeyoRT Ⅱ cDNA第1鏈合成試劑盒合成cDNA。RNA提取和cDNA合成分別進行了3次生物學(xué)重復(fù)實驗。以家蠶轉(zhuǎn)錄起始因子4A基因(SilkDB探針號sw22934)為內(nèi)參基因，利用Oligo 7.0設(shè)計PangolinX3的引物(正向:5′-GGTTGTCGCCGAATGTA-3′；反向:5′-TTTGGAACC GTAACCGTAG-3′)和轉(zhuǎn)錄起始因子4A基因的引物(正向:5′-TTTGGAACCGTAACCGTAG-3′；反向:5′-CAAAGTTGATAGCAATTCCCT-3′)。由于Pangolin X3基因不同剪接體的堿基序列高度相似，我們設(shè)計的引物可以檢測大部分的Pangolin轉(zhuǎn)錄剪接體(X1,X3,X4和X5)，基本可以反映Pangolin在家蠶不同組織中的表達。PCR反應(yīng)體系:正反向引物(10 μmol/L)各1 μL,不同組織cDNA模板2 μL,2×SYBR qPCR SuperMix Plus 10 μL (NovoStart) (Novoprotein,上海)，RNase-Free H2O 6 μL。反應(yīng)程序:95℃ 40 s;95℃ 10 s,60℃ 20 s,40個循環(huán)。每個反應(yīng)重復(fù)3次，采用2-ΔΔCt相對定量法對數(shù)據(jù)進行分析。

1.4 數(shù)據(jù)分析

Pangolin在家蠶5齡第3 天幼蟲不同組織中的相對表達水平以平均值±標準差來表示，利用GraphPad Prism 8.0 (GraphPad,SanDiego,Califormia,美國)軟件繪制PangolinX3的相對表達水平柱狀圖，并采用Dunnett氏檢驗分析不同組織之間表達水平差異的顯著性。

2 結(jié)果

2.1 Pangolin X3 CDS的克隆和序列特征

從家蠶幼蟲中腸和血淋巴中PCR克隆獲得大小約為1 500 bp 的DNA片段，經(jīng)測序驗證與PangolinX3(GenBank登錄號:XM_038020921) CDS序列一致。結(jié)構(gòu)域分析顯示，Pangolin X3含有經(jīng)典Wnt/β-catenin通路成員β-catenin的保守結(jié)合位點和TCF基因家族保守結(jié)構(gòu)域HMG。PangolinX3定位于27號染色體，開放閱讀框大小為1 560 bp，編碼519個氨基酸殘基，預(yù)測分子量為55.86 kD，預(yù)測等電點為7.53。

多序列比對分析顯示，Pangolin X3的蛋白序列在不同的昆蟲中比較保守，特別是與DNA結(jié)合的HMG結(jié)構(gòu)域(家蠶Pangolin X3的第287-358位氨基酸殘基)。此外，與β-catenin結(jié)合的N末端CTNNB1結(jié)構(gòu)域(家蠶Pangolin X3的第13-199位氨基酸殘基)也具有較高的保守性，部分氨基酸殘基發(fā)生了變異(圖1)。

圖1 家蠶和其他昆蟲Pangolin蛋白的多序列比對Fig.1 Multiple sequence alignment of Pangolin proteins of Bombyx mori and other insectsPangolin蛋白來源物種及GenBank登錄號Origin species of Pangolin proteins and their GenBank accession numbers:黑腹果蠅Drosophila melanogaster,AFH06765;家蠶Bombyx mori,XP_037876849;野蠶B. mandarina,XP_028025555;棉鈴蟲Helicoverpa armigera,XP_021185146;斜紋夜蛾Spodoptera litura,XP_022834394;偏瞳蔽眼蝶Bicyclus anynana,XP_023954838;斑點木蝶Pararge aegeria,XP_039761328;大樺斑蝶Danaus plexippus,XP_032525001;小菜蛾P(guān)ieris rapae,XP_022123521;柑橘鳳蝶Papilio xuthus,XP_013174768。紅色陰影部分為Pangolin蛋白保守的氨基酸殘基。The red shaded area highlights the conserved amino acid residues of Pangolin proteins.

系統(tǒng)發(fā)育樹顯示，家蠶與野蠶、棉鈴蟲和斜紋夜蛾、偏瞳蔽眼蝶和斑點木蝶Pangolin分別聚類為一支(圖2)，暗示了它們在進化上具有相似或相近的起源。相對而言，這些昆蟲與黑腹果蠅Pangolin的距離較遠(圖2)，暗示了它們在進化上的親緣關(guān)系較遠。

圖2 鄰接法構(gòu)建的基于氨基酸序列的家蠶和其他昆蟲的Pangolin蛋白的系統(tǒng)發(fā)育樹(1 000次重復(fù))Fig.2 Phylogenetic tree of Pangolin proteins of Bombyx mori and other insects by neighbor-joining method based on amino acid sequence (1 000 replicates)

2.2 Pangolin X3的表達特征

結(jié)果顯示，PangolinX3在5齡第3 天家蠶幼蟲中腸、血淋巴和性腺中的表達水平相對較高，在頭、體壁、前部絲腺、中部絲腺、后部絲腺、脂肪體和馬氏管中的表達水平相對較低(圖3)，暗示了Pangolin X3可能在家蠶中腸、血淋巴和性腺中發(fā)揮比較重要的生物學(xué)功能。

圖3 Pangolin X3在家蠶5齡第3 天幼蟲不同組織中的相對表達水平Fig.3 Relative expression levels of Pangolin X3 in different tissues of the day-3 5th instar larvae of Bombyx moriHD:頭部Head;HM:血淋巴Hemolymph;IG：體壁Integument;GD：性腺Gonad;MD：中腸Midgut;AS：前部絲腺Anterior silk gland;MS：中部絲腺Middle silk gland;PS：后部絲腺Posterior silk gland;FB：脂肪體Fat body;MT：馬氏管Malpighian tubules.圖中數(shù)據(jù)為平均值±標準差；柱上不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05,Dunnett氏檢驗)。Data in the figure are presented as mean±SD.Different small letters above bars indicate significant difference (P<0.05,Dunnett’s test).

3 討論

Wnt/β-catenin信號通路在果蠅和哺乳動物中已經(jīng)被廣泛地研究，然而我們對昆蟲Wnt/β-catenin通路關(guān)鍵的核內(nèi)效應(yīng)轉(zhuǎn)錄因子TCF/Pangolin仍然知之甚少。果蠅中只鑒定了1個Pangolin基因 (Brunneretal.,1997)。在本研究中，我們在NCBI數(shù)據(jù)庫中檢索發(fā)現(xiàn)家蠶基因組中包含6個Pangolin基因，然后根據(jù)PangolinX3的序列設(shè)計引物，從家蠶中腸和血淋巴cDNA中克隆了其CDS。蛋白序列比對顯示，不同昆蟲Pangolin蛋白的HMG結(jié)構(gòu)域高度保守(圖1)。HMG結(jié)構(gòu)域主要負責(zé)與下游靶基因上游的順式作用DNA元件結(jié)合。這一結(jié)果暗示了Pangolin調(diào)控的靶基因在不同的昆蟲中可能都比較保守。相對而言，與β-catenin結(jié)合的N末端CTNNB1結(jié)構(gòu)域的氨基酸出現(xiàn)了一定的變異，暗示了昆蟲中β-catenin與Pangolin結(jié)合的多樣性。丁鑫等發(fā)現(xiàn)昆蟲中存在多個Wnt基因，如黑腹果蠅D.melanogaster和西方蜜蜂Apismellifera分別含有7個Wnt基因，家蠶B.mori含有8個Wnt基因，赤擬谷盜Triboliumcastaneum含有9個Wnt基因(Dingetal.,2019)。這一結(jié)果暗示了Wnt信號通路作用方式的多樣性，與Pangolin N末端CTNNB1結(jié)構(gòu)域氨基酸的變異性比較一致。

不同的Wnt基因在家蠶5齡第3天幼蟲大多數(shù)組織中的表達水平相對較低，在頭部、性腺、翅原基和神經(jīng)系統(tǒng)中的表達水平相對較高(Dingetal.,2019)。本研究發(fā)現(xiàn)Pangolin在5齡第3 天幼蟲的中腸、血淋巴和性腺中的表達水平相對較高，而在其他組織中的表達水平相對較低(圖3)。作為Wnt/β-catenin信號通路下游的關(guān)鍵效應(yīng)因子，Pangolin與Wnt基因在家蠶組織中的表達特征較為相似，這與其生物學(xué)功能基本保持一致。Wnt/β-catenin通路調(diào)控了果蠅和哺乳動物腸干細胞的自我更新，Axin上調(diào)表達促進果蠅中腸干細胞的分裂，下調(diào)表達則抑制了干細胞過度增殖(Gultekin and Steller,2019)。因此推測Pangolin在家蠶中腸的高水平表達可能與中腸發(fā)育和內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)相關(guān)。

盡管我們對Pangolin在家蠶胚胎分化和生長發(fā)育等過程中的生物學(xué)功能仍然知之甚少，我們的結(jié)果為深入研究家蠶Pangolin基因的功能提供了基礎(chǔ)。隨著CRISPR-Cas9基因編輯、單細胞時空轉(zhuǎn)錄組等技術(shù)的出現(xiàn)和發(fā)展，未來有可能利用這些技術(shù)深入揭示家蠶Wnt/β-catenin信號通路的作用方式和Pangolin基因的功能。