飛蝗雌成蟲(chóng)脂肪體G蛋白偶聯(lián)受體鑒定及其在卵發(fā)育中的功能

贠佳琦,楊潔冰,許慧晶,鄭洪遠(yuǎn),周樹(shù)堂

(河南大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,棉花生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,河南開(kāi)封 475004)

G蛋白偶聯(lián)受體(G protein-coupled receptor,GPCR)為含有7次跨膜(transmembrane,TM)結(jié)構(gòu)域的受體蛋白家族，通過(guò)偶聯(lián)的異源三聚體G蛋白(αβγ亞基)激活第二信使及其級(jí)聯(lián)通路，將細(xì)胞外配體信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)入胞內(nèi)，從而調(diào)控特定生理進(jìn)程(Caersetal.,2012;Pietrantonioetal.,2018)。昆蟲(chóng)中，GPCR介導(dǎo)激素、生物胺、神經(jīng)肽等內(nèi)分泌因子的信號(hào)傳遞，在行為、生長(zhǎng)、發(fā)育和生殖等多種過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用(Baietal.,2011;Van Wielendaeleetal.,2013a;Audsley and Down,2015)。根據(jù)氨基酸序列構(gòu)成和功能，昆蟲(chóng)GPCR分為4個(gè)亞家族：A類視紫紅質(zhì)樣受體(rhodopsin-like receptor)、B類分泌素樣受體(secretin-like receptor)、C類代謝型谷氨酸受體(metabotropic glutamate receptor)和D類非典型7次跨膜蛋白(atypical 7TM protein)。利用基因組學(xué)分析，多種模式昆蟲(chóng)的GPCR已得到鑒定，包括黑腹果蠅Drosophilamelanogaster、岡比亞按蚊Anophelesgambiae、家蠶Bombyxmori、赤擬谷盜Triboliumcastaneum和豌豆蚜Acyrthosiphonpisum等(Brody and Cravchik,2000;Hilletal.,2002;Fanetal.,2010;Baietal.,2011;Lietal.,2013)。此外，西方蜜蜂Apismellifera、長(zhǎng)紅獵蝽Rhodniusprolixus、褐飛虱Nilaparvatalugens、飛蝗Locustamigratoria和沙漠蝗Schistocercagregaria中的神經(jīng)激素和神經(jīng)肽受體也已報(bào)道(Hauseretal.,2006;Badiscoetal.,2011;Van Wielendaeleetal.,2013b;Tanakaetal.,2014;Onsetal.,2016;Lenaertsetal.,2019)。雖然許多昆蟲(chóng)種類的GPCR已得到鑒定，但其在昆蟲(chóng)生殖中的功能還有待進(jìn)一步研究。

脂肪體是昆蟲(chóng)體內(nèi)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)儲(chǔ)存的關(guān)鍵組織，為變態(tài)、生殖、飛行和免疫等耗能事件提供基本的能量供應(yīng)(Law and Wells,1989;Smykal and Raikhel,2015)。昆蟲(chóng)的大部分中間代謝過(guò)程都發(fā)生在脂肪體中(Arrese and Soulages,2010)。為了滿足不同生理進(jìn)程中不斷變化的物質(zhì)需求，脂肪體需要整合來(lái)自多個(gè)器官的信號(hào)以發(fā)揮多種代謝功能，其中許多功能受到內(nèi)分泌激素的調(diào)控(G?de,2004)。卵黃發(fā)生是昆蟲(chóng)產(chǎn)卵繁殖的前提。此過(guò)程中脂肪體整合多重內(nèi)分泌調(diào)控信號(hào)大量合成卵黃原蛋白(vitellogenin,Vg)，從而促進(jìn)發(fā)育中的卵母細(xì)胞成熟，為后期的胚胎發(fā)育提供營(yíng)養(yǎng)儲(chǔ)備。生物胺、神經(jīng)肽等小分子是昆蟲(chóng)生殖調(diào)控的重要內(nèi)分泌因子(Simonetetal.,2004;Gruntenko and Rauschenbach,2008;Van Wielendaeleetal.,2013a;Smykal and Raikhel,2015)。這些小分子配體的信號(hào)由GPCR介導(dǎo)，或直接作用于生殖組織而調(diào)控卵的發(fā)育，或通過(guò)調(diào)控其他激素的分泌而間接影響卵的發(fā)育和卵巢生長(zhǎng)。然而，參與調(diào)控昆蟲(chóng)卵發(fā)育調(diào)控的具體GPCR還有待鑒定。

飛蝗是昆蟲(chóng)神經(jīng)生理和內(nèi)分泌研究的重要模式生物，并且生殖力強(qiáng)大，單次產(chǎn)卵60～80粒，單次卵量總重可達(dá)500 mg，一生產(chǎn)卵5～6次。飛蝗的卵黃發(fā)生主要由保幼激素(juvenile hormone,JH)調(diào)控(Lietal.,2019;Song and Zhou,2020)。JH通過(guò)其核受體復(fù)合體Met/Tai(Methoprene-tolerant/Taiman)、早期響應(yīng)因子Kr-h1以及細(xì)胞周期相關(guān)基因Mcm4,Mcm7,Cdc6,Cdk6和E2f1誘導(dǎo)脂肪體大量合成Vg，從而促進(jìn)卵母細(xì)胞快速成熟(Guoetal.,2014;Songetal.,2014;Wuetal.,2016;Wangetal.,2017)。JH還通過(guò)PKCα介導(dǎo)的膜信號(hào)誘導(dǎo)Kr-h1磷酸化進(jìn)而募集CREB結(jié)合蛋白(CREB-binding protein)最終增強(qiáng)核糖體蛋白L36(ribosomal protein L36)和Vg的合成(Wuetal.,2021)。此外，JH誘激亮氨酸羧基甲基轉(zhuǎn)移酶1(leucine carboxyl methyltransferase 1)-PP2A信號(hào)通路進(jìn)而誘導(dǎo)FoxO去磷酸化最終促進(jìn)Vg大量合成。本研究通過(guò)轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析，從飛蝗雌成蟲(chóng)脂肪體中共鑒定43個(gè)GPCR基因，其中29個(gè)為首次報(bào)道；qRT-PCR分析顯示，29個(gè)基因在腦、胸腹神經(jīng)節(jié)、脂肪體、卵巢和中腸中具有多樣的表達(dá)模式；通過(guò)RNAi篩選，發(fā)現(xiàn)5個(gè)GPCR基因在飛蝗卵發(fā)育和卵巢生長(zhǎng)過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。本研究為深入探究GPCR在JH依賴的卵黃發(fā)生和卵發(fā)育中的分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)提供了新的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試?yán)ハx(chóng)

本研究所用飛蝗為實(shí)驗(yàn)室連續(xù)多代穩(wěn)定繁殖種群。每日新鮮麥苗和麥麩混勻飼喂。飛蝗飼養(yǎng)于長(zhǎng)×寬×高=35 cm×35 cm×35 cm的金屬籠內(nèi)，飼養(yǎng)密度為200頭/籠左右，飼養(yǎng)籠定期清理保持整潔。環(huán)境溫度為30±2℃，光周期為14L∶10D。

1.2 序列比對(duì)與聚類分析

前期研究已經(jīng)獲得第1個(gè)促性腺周期內(nèi)飛蝗雌成蟲(chóng)脂肪體轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)，共獲得72 643個(gè)unigenes (Zhengetal.,2021)。根據(jù)黑腹果蠅、岡比亞按蚊、家蠶、赤擬谷盜等昆蟲(chóng)中已鑒定的GPCR蛋白序列，在飛蝗雌成蟲(chóng)脂肪體轉(zhuǎn)錄組中進(jìn)行TBLASTN比對(duì)篩選GPCR基因。利用ClustalW對(duì)同源序列進(jìn)行成對(duì)比對(duì)和多重序列比對(duì)，并使用MEGA 6基于鄰接法進(jìn)行聚類分析。自NCBI GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)(https:∥www.ncbi.nlm.nih.gov)獲得昆蟲(chóng)同源GPCR蛋白序列。

1.3 qRT-PCR檢測(cè)基因表達(dá)量

分別取羽化后6 d(卵黃發(fā)生期)飛蝗雌成蟲(chóng)的腦、胸腹神經(jīng)節(jié)、脂肪體、卵巢以及中腸，使用TRNzol法提取各個(gè)組織總RNA。使用FastKing cDNA第1鏈合成試劑盒(天根)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，按SuperReal Premix Plus試劑盒(天根)步驟，配制PCR反應(yīng)體系，以Light Cycler 96 (Roche)進(jìn)行qRT-PCR檢測(cè)。PCR反應(yīng)程序:95℃預(yù)變性15 min;95℃變性15 s,60℃退火15 s,72℃延伸20 s,40個(gè)循環(huán)。根據(jù)溶解曲線分析引物擴(kuò)增的特異性。利用2-ΔΔCt法，以核糖體蛋白基因rp49為內(nèi)參基因，計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)水平；每個(gè)組織包括8～10個(gè)生物學(xué)重復(fù)，每生物學(xué)重復(fù)取自1～2頭試蟲(chóng)。qRT-PCR所用引物見(jiàn)表1。

1.4 RNAi實(shí)驗(yàn)

為了研究GPCR在飛蝗卵發(fā)育和卵巢生長(zhǎng)中的功能，利用RNAi技術(shù)對(duì)本研究新鑒定的29個(gè)GPCR基因分別進(jìn)行表達(dá)干擾，并在卵黃發(fā)生末期觀察卵母細(xì)胞發(fā)育和卵巢生長(zhǎng)表型。以1.3節(jié)所得cDNA為模板，利用PCR擴(kuò)增新鑒定的29個(gè)GPCR基因和GFP片段，并將其重組入pGEM-T載體，通過(guò)測(cè)序驗(yàn)證擴(kuò)增片段的正確性。以測(cè)序驗(yàn)證正確的pGEM-T重組載體為模板，PCR擴(kuò)增獲得含有T7位點(diǎn)的DNA模板。dsRNA的合成采用T7 RiboMAX Express System試劑盒(Promega)。根據(jù)此前報(bào)道的方法(Wuetal.,2018)，在雌成蟲(chóng)羽化當(dāng)天注射dsRNA，并在羽化后第5天加強(qiáng)注射。注射劑量為每頭雌成蟲(chóng)每次15 μg。以注射等量dsGFP的雌成蟲(chóng)作為對(duì)照。于羽化后第8天取樣，使用佳能EOS550D相機(jī)拍攝卵巢。初級(jí)卵母細(xì)胞解剖后置于載玻片上，以M205A體式顯微鏡(Leica)拍照并測(cè)量，觀察測(cè)定飛蝗初級(jí)卵母細(xì)胞以及卵巢發(fā)育狀況，并通過(guò)qRT-PCR檢測(cè)目的基因在脂肪體和卵巢中的表達(dá)水平(方法同1.3節(jié))。RNAi所用引物見(jiàn)表1。

表1 引物信息Table 1 Primer information

續(xù)表1 Table 1 continued

1.5 數(shù)據(jù)分析

利用STATISTICA 12.0軟件對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行T檢驗(yàn)或方差分析。利用GraphPad Prism 8.0計(jì)算平均值和標(biāo)準(zhǔn)誤，并制作圖片。

2 結(jié)果

2.1 飛蝗雌成蟲(chóng)脂肪體轉(zhuǎn)錄組GPCR基因鑒定

利用BLAST比對(duì)和聚類分析在飛蝗雌成蟲(chóng)脂肪體轉(zhuǎn)錄組中共鑒定得到43個(gè)GPCR基因，其中14個(gè)GPCR基因(GenBank登錄號(hào):ON807135-ON807148)在前期研究中已有報(bào)道(Zhengetal.,2021)，29個(gè)GPCR基因?yàn)楸狙芯渴状舞b定，分別編碼13個(gè)A類受體(視紫紅質(zhì)樣受體)、13個(gè)B類受體(分泌素樣受體)、2個(gè)C類受體(代謝型谷氨酸受體)和1個(gè)D類受體(非典型7次跨膜蛋白)。其中，A類受體包括5個(gè)神經(jīng)肽受體，分別為心動(dòng)加速肽受體(cardioacceleratory peptide receptor,CCAPR)、黑化誘導(dǎo)肽受體(corazonin receptor,CrzR)、Moody2、抑肌肽受體(myosuppressin receptor,MSR)和短神經(jīng)肽F受體(short neuropeptide F receptor,sNPFR) (圖1:A)；2個(gè)生物胺類受體，分別為章魚(yú)胺受體β1R受體(octopamine receptor beta 1R,Octβ1R)和酪胺受體(tyramine receptor,TyrR)(圖1:B)；6個(gè)孤兒受體，分別為GPR119L(GPCR119L)，LGR1(leucine-rich repeats-containing GPCR 1),LGR2,OR-A3(orphan receptor-A3)，OR-A4和OR-A5 (圖1:C)。13個(gè)B類受體包括7個(gè)Mth/Mthl(Mthl4,Mthl6,Mthl7,Mthl8,Mthl9,Mthll0和Mthl15)(圖2:A)、3個(gè)甲狀旁腺激素/甲狀旁腺相關(guān)多肽受體(parathyroid hormone/parathyroid hormone-related peptide receptor,PTH/PTHrPR)、2個(gè)ADGR (adhesion GPCR)和1個(gè)利尿激素受體(diuretic hormone receptor,DHR) (圖2:B)。C類GPCR為代謝型GABA-B受體(metabotropic γ-aminobutyric acid receptor,GABABR)和代謝型谷氨酸受體(metabotropic glutamate receptor,mGluR) (圖2:C)。1個(gè)D類GPCR為Fz2 (圖2:D)。

圖1 基于氨基酸序列的飛蝗雌成蟲(chóng)脂肪體和其他昆蟲(chóng)中A類GPCRs聚類分析Fig.1 Cluater analysis of class A GPCRs identified in the fat body of female adults of Locusta migratoria and other insects based on amino acid sequenceA:神經(jīng)肽受體Neuropeptide receptor;B:生物胺受體Bioammine receptor;C:孤兒受體Orphan receptor.本研究中新鑒定GPCR以灰色背景標(biāo)記。GPCRs newly identified in the current study are marked by gray background.

圖2 基于氨基酸序列的飛蝗雌成蟲(chóng)脂肪體和其他昆蟲(chóng)中B (A,B),C (C)和D (D)類GPCRs聚類分析Fig.2 Cluster analysis of Class B (A,B),C (C) and D (D) GPCRs identified in the fat body of female adults of Locusta migratoria and other insects based on amino acid sequenceA:Mth/Mthl蛋白Mth/Mthl protein;B:PTH/PTHrPR,DHR和ADGR蛋白PTH/PTHrPR,DHR and ADGR proteins;C:代謝型GABA-B受體和谷氨酸受體Metabotropic GABA-B receptor and glutamate receptor;D:Fz蛋白Fz protein.本研究中新鑒定GPCR以灰色背景標(biāo)記。GPCRs newly identified in the current study are marked by gray background.

2.2 飛蝗雌成蟲(chóng)GPCR基因的組織表達(dá)模式

利用qRT-PCR檢測(cè)GPCR基因的組織表達(dá)模式，結(jié)果如圖3所示，羽化后6 d(卵黃發(fā)生期)飛蝗雌成蟲(chóng)除脂肪體外，29個(gè)GPCR基因在胸腹神經(jīng)節(jié)中也均有表達(dá)，其中PTH/PTHrPR1和MSR分別在脂肪體和胸腹神經(jīng)節(jié)中顯著高表達(dá)。腦中Octβ1R,CrzR,CCAPR,LGR2,mGluR和GABABR的表達(dá)水平顯著高于其他組織中的(P<0.05)；GPR119L,Mthl6和Mthl4在中腸中的表達(dá)水平最高。此外，腦中未檢測(cè)到Mthl4表達(dá)，卵巢中未檢測(cè)到Octβ1R表達(dá)，中腸中未檢測(cè)到PTH/PTHrPR1表達(dá)(圖3)。

圖3 本研究新鑒定的29個(gè)GPCR基因在飛蝗卵黃發(fā)生期雌成蟲(chóng)不同組織中的表達(dá)模式Fig.3 Tissue expression patterns of 29 GPCR genes newly identified in this study in the vitellogenic female adults of Locusta migratoriaBr:腦Brain;Ov:卵巢Ovary;FB:脂肪體Fat body;Mg:中腸Midgut;Ga:胸腹神經(jīng)節(jié)Thoracic and abdominal ganglia.×:未檢測(cè)到目的基因的表達(dá) Expression of target genes was undetectable.顏色深度表示基因相對(duì)表達(dá)水平的標(biāo)準(zhǔn)化值;星號(hào)表示基因在該組織中的表達(dá)量顯著高于其他組織中的(P<0.05,單因素方差分析)。Shades of color indicate the normalized values of relative gene expression level.The asterisk means significantly higher expression level in this tissue than in the other tissues (P<0.05,ANOVA).n=8-10.

2.3 GPCR對(duì)卵發(fā)育和卵巢生長(zhǎng)的影響

結(jié)果表明，RNA干擾CCAPR,PTH/PTHrPR1,ADGRL3,Mthl15和DHR5個(gè)GPCR基因的表達(dá)會(huì)抑制初級(jí)卵母細(xì)胞發(fā)育和卵巢生長(zhǎng)。CCAPR屬于神經(jīng)肽受體，其心動(dòng)加速多肽配體的主要功能為介導(dǎo)CAPA信號(hào)調(diào)控心率以及馬氏管水分和離子穩(wěn)態(tài)(Leeetal.,2013;Nagata,2016)。注射 dsCCAPR的雌成蟲(chóng)脂肪體和卵巢中，CCAPR表達(dá)水平相對(duì)于注射dsGFP的對(duì)照組分別顯著降低55.5%和71.4%(P<0.05)(圖4:A)。dsCCAPR處理后的雌成蟲(chóng)卵巢和初級(jí)卵母細(xì)胞明顯小于對(duì)照組(圖4:B)；對(duì)照組雌成蟲(chóng)初級(jí)卵母細(xì)胞的平均長(zhǎng)×寬為8.0 mm×8.0 mm，而注射dsCCAPR處理組的為6.8 mm×6.8 mm，二者差異顯著(P<0.05)(圖4:C)。

圖4 CCAPR被RNAi后CCAPR的相對(duì)表達(dá)水平(A)及飛蝗卵巢生長(zhǎng)(B)和初級(jí)卵母細(xì)胞發(fā)育(C)Fig.4 Relative expression level of CCAPR (A) and the ovarian growth (B) and primary oocyte development (C) in Locusta migratoria after RNAi of CCAPRdsRNA注射后8 d(成蟲(chóng)羽化后8 d)檢測(cè)脂肪體和卵巢中目的基因的相對(duì)表達(dá)水平以及卵巢生長(zhǎng)和初級(jí)卵母細(xì)胞發(fā)育。圖中數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤(n=8-29)；柱上星號(hào)表示兩組間差異顯著 (*P<0.05;**P<0.01)(T檢驗(yàn))。The relative expression levels of target genes in the fat body and ovary and the ovarian growth and primary oocyte development were determined at 8 d post dsRNA injection (8 d post adult eclosion).Data in the figure are mean±SE (n=8-29).Asterisks above bars represent significant difference between two groups (*P<0.05;**P<0.01)(T-test).The same for the following figures.Ov:卵巢Ovary;Ol:卵小管Ovariole;Po:初級(jí)卵母細(xì)胞Primary oocyte.圖5-8同。The same for Figs.5-8.

脊椎動(dòng)物中PTH/PTHR通路已經(jīng)有大量研究，其主要功能為調(diào)控骨骼重塑和鈣離子代謝(Lanskeetal.,1996;Whiteetal.,2019)，但昆蟲(chóng)中PTH/PTHR的研究報(bào)道較少。注射dsPTH/PTHrPR1的飛蝗雌成蟲(chóng)脂肪體和卵巢中PTH/PTHrPR1表達(dá)水平相比注射dsGFP的對(duì)照組分別顯著下降92.4%和88.9%(P<0.01)(圖5:A)。卵巢生長(zhǎng)和初級(jí)卵母細(xì)胞發(fā)育受到明顯抑制(圖5:B)，初級(jí)卵母細(xì)胞平均長(zhǎng)×寬為5.6 mm×5.6 mm，顯著小于對(duì)照組的(P<0.01)(圖5:C)。

圖5 PTH/PTHrPR1被RNAi后PTH/PTHrPR1的相對(duì)表達(dá)水平(A)及飛蝗卵巢生長(zhǎng)(B)和初級(jí)卵母細(xì)胞發(fā)育(C)Fig.5 Relative expression level of PTH/PTHrPR1 (A) and the ovarian growth (B) and primary oocyte development (C) in Locusta migratoria after RNAi of PTH/PTHrPR1

注射dsADGRL3的雌成蟲(chóng)脂肪體中和卵巢中ADGRL3表達(dá)水平相比注射dsGFP的對(duì)照組分別顯著降低69.3%(P<0.01)和64.5%(P<0.05) (圖6:A)。卵巢和初級(jí)卵母細(xì)胞明顯小于對(duì)照組的(圖6:B)，初級(jí)卵母細(xì)胞長(zhǎng)×寬為1.8 mm×1.8 mm，較對(duì)照組的顯著降低了78.1%(P<0.01)(圖6:C)。

圖6 ADGRL3被RNAi后ADGRL3的相對(duì)表達(dá)水平(A)及飛蝗卵巢生長(zhǎng)(B)和初級(jí)卵母細(xì)胞發(fā)育(C)Fig.6 Relative expression level of ADGRL3 (A) and the ovarian growth (B) and primary oocyte development (C) in Locusta migratoria after RNAi of ADGRL3

與注射dsGFP的對(duì)照組相比，Mthl15的RNAi在雌成蟲(chóng)脂肪體和卵巢中分別引起78.1%(P<0.01)和72.4%(P<0.05)的表達(dá)水平下調(diào)(圖7:A)，明顯阻礙了卵巢生長(zhǎng)和初級(jí)卵母細(xì)胞發(fā)育(圖7:B)，初級(jí)卵母細(xì)胞長(zhǎng)×寬為4.2 mm×4.2 mm，與對(duì)照組的相比顯著降低了47.5%(P<0.01)(圖7:C)。

圖7 Mthl15被RNAi后Mthl15的相對(duì)表達(dá)水平(A)及飛蝗卵巢生長(zhǎng)(B)和初級(jí)卵母細(xì)胞發(fā)育(C)Fig.7 Relative expression level of Mthl5 (A) and the ovarian growth (B) and primary oocyte development (C) of Locusta migratoria after RNAi of Mthl5

與注射dsGFP的對(duì)照組相比，注射dsDHR的雌成蟲(chóng)脂肪體和卵巢中DHR表達(dá)水平分別顯著降低了75.7%和68.4%(P<0.01) (圖8:A)，dsDHR處理組卵巢生長(zhǎng)和初級(jí)卵母細(xì)胞發(fā)育受到明顯抑制(圖8:B)，初級(jí)卵母細(xì)胞長(zhǎng)×寬=4.6 mm×4.6 mm，較對(duì)照組的顯著下降了43.3%(P<0.01)(圖8:C)，說(shuō)明DHR可能通過(guò)參與調(diào)控機(jī)體的滲透穩(wěn)態(tài)而在飛蝗卵黃發(fā)生中發(fā)揮重要作用。

圖8 DHR被RNAi后DHR的相對(duì)表達(dá)水平(A)及對(duì)飛蝗卵巢生長(zhǎng)(B)和初級(jí)卵母細(xì)胞發(fā)育(C)Fig.8 Relative expression level of DHR (A) and the ovarian growth (B) and primary oocyte development (C) in Locusta migratoria after RNAi of DHR

3 討論

本研究利用序列比對(duì)和聚類分析，在飛蝗雌成蟲(chóng)脂肪體中新鑒定得到29個(gè)編碼GPCR的基因。在此基礎(chǔ)上，對(duì)新鑒定基因進(jìn)行組織表達(dá)分析和RNA干擾，明確在卵母細(xì)胞成熟和卵巢生長(zhǎng)中具有重要功能的GPCR基因。RNAi篩選顯示CCAPR,PTH/PTHrPR1,ADGRL3,Mthl15和DHR在飛蝗卵黃發(fā)生期卵巢生長(zhǎng)和卵母細(xì)胞成熟中具有關(guān)鍵作用。吸血蝽Rhodniusprolixus中，CCAPR在雌性生殖系統(tǒng)中高表達(dá)，CCAPR表達(dá)受干擾后心跳速率下降31%(Leeetal.,2013)。果蠅中，CCAPR參與調(diào)控馬氏管內(nèi)的液體分泌，從而促進(jìn)體內(nèi)的水分平衡和離子穩(wěn)態(tài)(Daviesetal.,2013)。本研究中，CCAPR的RNAi顯著抑制卵巢和初級(jí)卵母細(xì)胞生長(zhǎng)(圖4:B,C)，可能由血淋巴循環(huán)減弱和內(nèi)穩(wěn)態(tài)紊亂導(dǎo)致。最新研究表明，赤擬谷盜中的PTHR表達(dá)被RNA干擾后產(chǎn)卵量顯著減少，后代卵孵化率也顯著降低(Xieetal.,2020)。本研究中PTH/PTHrPR1的RNAi引起的卵巢生長(zhǎng)和初級(jí)卵母細(xì)胞生長(zhǎng)受阻(圖5:B,C)與赤擬谷盜的研究結(jié)果相符，然而該基因在生殖過(guò)程中的作用機(jī)制尚不清楚。ADGR蛋白具有多個(gè)功能性結(jié)構(gòu)域，如激素結(jié)合結(jié)構(gòu)域、表皮生長(zhǎng)因子-鈣離子結(jié)合結(jié)構(gòu)域等，哺乳動(dòng)物ADGR在胰島素分泌、脂肪生成、能量穩(wěn)態(tài)等內(nèi)分泌和代謝調(diào)控過(guò)程中具有核心作用，但昆蟲(chóng)中該類蛋白的功能和調(diào)控機(jī)制研究較少(Paavola and Hall,2012;Olaniru and Persaud,2019)。ADGRL3表達(dá)被RNA干擾的飛蝗雌成蟲(chóng)卵巢和初級(jí)卵母細(xì)胞生長(zhǎng)受到嚴(yán)重抑制(圖6:B,C)，說(shuō)明該受體對(duì)于飛蝗卵黃發(fā)生期的生理調(diào)控至關(guān)重要，然而其作用機(jī)理還有待進(jìn)一步研究。Mth/Mthl蛋白為后生動(dòng)物中古老的受體亞家族(Pateletal.,2012)。Mth突變的果蠅個(gè)體壽命延長(zhǎng)35%，并且抵御饑餓、高溫和氧化自由基等脅迫的能力也顯著增強(qiáng)(Linetal.,1998)。赤擬谷盜中，Mthl1和Mthl2表達(dá)被RNA干擾的雌成蟲(chóng)產(chǎn)卵量顯著降低，而Mthl1和Mthl4的RNAi嚴(yán)重抑制胚胎發(fā)育(Lietal.,2014)。本研究中Mthl15表達(dá)被RNA干擾的雌成蟲(chóng)初級(jí)卵母細(xì)胞生長(zhǎng)受到顯著抑制(圖7:B,C)。因此Mth/Mthl蛋白表達(dá)降低引起的壽命延長(zhǎng)和抗脅迫能力增強(qiáng)可能與生殖發(fā)育產(chǎn)生拮抗。昆蟲(chóng)利尿激素(diuretic hormone,DH)調(diào)控馬氏管內(nèi)的鹽分和水分運(yùn)輸，并具有促進(jìn)前腸、中腸以及背血管收縮的功能從而在取食相關(guān)的生理事件中發(fā)揮作用(Zandawala,2012;N?ssel and Zandawala,2019)。本研究中DHR的RNAi顯著阻礙雌成蟲(chóng)初級(jí)卵母細(xì)胞的發(fā)育(圖8:B,C)，說(shuō)明DHR可能通過(guò)調(diào)節(jié)機(jī)體滲透平衡和個(gè)體取食進(jìn)而參與飛蝗卵黃發(fā)生過(guò)程中的生理機(jī)能調(diào)控。

綜上所述，盡管利用基因組學(xué)和轉(zhuǎn)錄組學(xué)的方法在許多昆蟲(chóng)物種中鑒定到大量GPCR，但對(duì)于昆蟲(chóng)生殖生理調(diào)控相關(guān)GPCR的功能和作用機(jī)制研究仍然有限。飛蝗為不完全變態(tài)昆蟲(chóng)的典型代表，也是研究昆蟲(chóng)卵黃發(fā)生過(guò)程中JH調(diào)控機(jī)理的理想模型。本研究通過(guò)轉(zhuǎn)錄組分析和RNAi，鑒定了5個(gè)候選GPCR基因，其在飛蝗卵黃發(fā)生期的卵發(fā)育和卵巢生長(zhǎng)中發(fā)揮重要作用，為更深入地厘清JH依賴的卵黃發(fā)生基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)提供進(jìn)一步參考。對(duì)候選GPCR信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的研究也將有助于揭示其參與調(diào)節(jié)昆蟲(chóng)生殖發(fā)育的分子機(jī)制。