耐碳青霉烯類藥物肺炎克雷伯菌和鮑曼不動桿菌對替加環(huán)素的敏感性及藥物敏感性試驗的臨床應(yīng)用

劉 妍， 袁應(yīng)華

（同濟大學附屬第十人民醫(yī)院檢驗科，上海 200072）

替加環(huán)素是一種甘氨酰環(huán)素類抗菌藥物，具有廣譜抗菌活性，且臨床使用方便，不需根據(jù)腎功能受損情況調(diào)整劑量[1-2]。雖然大規(guī)模的監(jiān)測研究表明，替加環(huán)素對大多數(shù)臨床常見分離菌株（除銅綠假單胞菌外）的耐藥率仍然在10%以下，但隨著臨床的廣泛應(yīng)用，替加環(huán)素耐藥問題逐漸顯現(xiàn)，已有一些研究表明替加環(huán)素耐藥率在產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶（extended-spectrum beta-lactamases，ESBLs）、多重耐藥（multiple drug resistance，MDR）、廣泛耐藥（extensive drug resistance，XDR）、耐碳青霉烯類藥物的細菌中出現(xiàn)升高[3-5]。由于目前美國臨床實驗室標準化協(xié)會（the Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI）仍缺乏關(guān)于替加環(huán)素體外敏感性試驗的判斷標準，實驗室用于檢測替加環(huán)素體外敏感性的方法影響因素較多，所以替加環(huán)素敏感性檢測方法的選擇需慎重[6]。

本研究分析耐碳青霉烯類藥物肺炎克雷伯菌和鮑曼不動桿菌對替加環(huán)素的敏感性，希望通過試驗比較，找到適合臨床實驗室的用于替加環(huán)素體外敏感性檢測的方法，以便為臨床使用替加環(huán)素治療耐碳青霉烯類藥物細菌感染提供盡可能快速和可靠的依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 菌株來源

收集同濟大學附屬第十人民醫(yī)院2013年11月—2014年2月臨床分離，并經(jīng)Vitek 2 compact全自動微生物分析系統(tǒng)（簡稱Vitek 2）菌種鑒定和Vitek 2、紙片擴散法體外藥物敏感性試驗確認為耐碳青霉烯類藥物的菌株，其中肺炎克雷伯菌20株、鮑曼不動桿菌41株。在受試菌株中，31%來源于重癥監(jiān)護病房，41%來源于急診重癥室，18%來源于腦外科。將菌株置40%甘油肉湯-20 ℃冷凍保存。藥物敏感性試驗質(zhì)控菌株為大腸埃希菌（ATCC 25922）。

1.2 儀器與試劑

Vitek 2及配套革蘭陰性菌鑒定卡GN和革蘭陰性菌藥物敏感性卡GN13均為法國生物梅里埃公司產(chǎn)品，替加環(huán)素最低抑菌濃度（minimum inhibitory concentration，MIC）測試條為意大利Liofilchem公司產(chǎn)品，替加環(huán)素標準品為美國Sigma公司產(chǎn)品，水解酪蛋白胨肉湯和替加環(huán)素、阿米卡星等藥物敏感性紙片均為英國Oxoid公司產(chǎn)品。

1.3 體外藥物敏感性試驗

將61株冷凍保存的菌株復蘇并傳代，采用Vitek 2進行菌種鑒定，Vitek 2、紙片擴散法、MIC法、微量肉湯稀釋法進行包括替加環(huán)素在內(nèi)的藥物敏感性試驗。Vitek 2及配套細菌鑒定卡GN、藥物敏感性卡GN13、MIC測試條均嚴格按照產(chǎn)品使用說明書進行操作。紙片擴散法和微量肉湯稀釋法參照CLSI推薦的方法[7-8]進行操作。

1.4 藥物敏感性結(jié)果判讀標準

替加環(huán)素敏感性的判讀標準[1，9]：肺炎克雷伯菌參照美國食品與藥品監(jiān)督管理局（U.S. Food and Drug Administration，F(xiàn)DA）腸桿菌科標準，MIC法敏感、耐藥的判讀標準分別為≤2 mg/L、≥8 mg/L，紙片擴散法敏感、耐藥的判讀標準分別為≥19 mm、≤14 mm；鮑曼不動桿菌參照FDA鮑曼不動桿菌標準，MIC法敏感、耐藥的判讀標準分別為≤2 mg/ L、≥8 mg/L，紙片擴散法敏感、耐藥的判讀標準分別為≥16 mm、≤12 mm。其他抗菌藥物的敏感性：參照CLSI M100-S25文件中關(guān)于腸桿菌科以及不動桿菌屬的判讀標準[10]進行判讀?；疽恢滦裕╡ssential agreement，EA）為被評估方法MIC值與微量肉湯稀釋法MIC值相差不超過1個稀釋度的菌株百分比。分類一致性（categorical agreement，CA）為被評估方法藥物敏感性結(jié)果（敏感、中介、耐藥）與微量肉湯稀釋法一致的菌株百分比。非常重大誤差（very major error，VME）為被評估方法將耐藥誤判為敏感。重大誤差（major error，ME）為被評估方法將敏感誤判為耐藥。小誤差（minor error，mE）為被評估方法將中介報告為耐藥或敏感，或?qū)⒛退帯⒚舾袌蟾鏋橹薪??？山邮芊秶鸀椋篊A≥90%，EA≥90%，VME≤1.5%，ME≤3%，mE≤10%[2]。

1.5 統(tǒng)計學方法

數(shù)據(jù)采用WHONET 5.6軟件進行分析。

2 結(jié)果

2.1 鮑曼不動桿菌對除替加環(huán)素外的其他臨床常用抗菌藥物的敏感性分析

除對左氧氟沙星、米諾環(huán)素、復方磺胺甲噁唑、頭孢哌酮-舒巴坦外，41株鮑曼不動桿菌對其余抗菌藥物的耐藥率均＞90.0%。見表1。

表1 41株鮑曼不動桿菌對臨床常用抗菌藥物的敏感性[%（株）]

除對復方磺胺甲噁唑、米諾環(huán)素外，20株肺炎克雷伯菌對其余抗菌藥物耐藥率均≥90.0%。見表2。

表2 20株肺炎克雷伯菌對臨床常用抗菌藥物的敏感性[%（株）]

2.2 3種檢測方法對于替加環(huán)素的敏感性分析

20株耐碳青霉烯類藥物肺炎克雷伯菌對替加環(huán)素的耐藥率、中介率和敏感率，紙片擴散法結(jié)果分別為5.0%、70.0%、25.0%，MIC法結(jié)果分別為0.0%、5.0%、95.0%，微量肉湯稀釋法結(jié)果分別為5.0%、0.0%、95.0%。見表3。

檢測41株耐碳青霉烯類藥物鮑曼不動桿菌對替加環(huán)素的耐藥率、中介率、敏感率，紙片擴散法分別為17.1%、82.9%、0.0%，MIC法分別為0.0%、41.5%、58.5%，微量肉湯稀釋法分別為7.3%、29.3%、63.4%。見表3。

2.3 MIC法和紙片擴散法與微量肉湯稀釋法檢測結(jié)果的比較

MIC法檢測替加環(huán)素的敏感性結(jié)果與微量肉湯稀釋法比較，20株耐碳青霉烯類藥物肺炎克雷伯菌的EA、CA、VME、ME、mE均在可接受范圍內(nèi)，而41株耐碳青霉烯類藥物鮑曼不動桿菌的CA和mE欠佳。紙片擴散法與微量肉湯稀釋法比較，EA、CA、VME、ME、mE不理想。見表4。

2.4 61株細菌對替加環(huán)素和米諾環(huán)素的敏感性分布

采用微量肉湯稀釋法檢測41株耐碳青霉烯類藥物鮑曼不動桿菌對替加環(huán)素和米諾環(huán)素的敏感性，結(jié)果顯示二者同時耐藥2株，同時中介2株，米諾環(huán)素中介而替加環(huán)素敏感17株，米諾環(huán)素耐藥而替加環(huán)素中介10株，米諾環(huán)素耐藥而替加環(huán)素敏感9株，還有1株為替加環(huán)素耐藥而米諾環(huán)素中介。

表3 3種方法檢測耐碳青霉烯類藥物肺炎克雷伯菌和鮑曼不動桿菌對替加環(huán)素的敏感性

表4 MIC法和紙片擴散法與微量肉湯稀釋法檢測結(jié)果的比較 [%（株）]

采用微量肉湯稀釋法檢測20株耐碳青霉烯類藥物肺炎克雷伯菌對替加環(huán)素和米諾環(huán)素的敏感性，結(jié)果顯示二者同時敏感14株，一致率為70%。米諾環(huán)素中介或耐藥株替加環(huán)素的MIC值有不同程度的升高。

3 討論

本研究61株細菌對大部分抗菌藥物的耐藥率為90.0%～100.0%，由于XDR定義[11]中所涉及的部分抗菌藥物無法常規(guī)檢測，因而將本研究所選菌株定義為耐碳青霉烯類藥物細菌，其中31%樣本來源于重癥監(jiān)護病房，41%的樣本來自急診重癥室，18%的樣本來自腦外科，這些科室均為醫(yī)院感染監(jiān)控重點科室，也是醫(yī)院耐碳青霉烯類藥物細菌檢出率居前3位的科室，主要以鮑曼不動桿菌和肺炎克雷伯菌為主。上述科室大多數(shù)患者具有病情嚴重且復雜、住院時間較長、自身免疫力低下、長期使用廣譜抗菌藥物、接受侵入性操作（如手術(shù)、中心靜脈置管、氣管插管等）普遍且頻繁等特點，產(chǎn)生對替加環(huán)素耐藥的相關(guān)因素較多。替加環(huán)素的耐藥常出現(xiàn)于包含替加環(huán)素在內(nèi)的抗菌藥物治療以及碳青霉烯類藥物使用之后，其耐藥性的發(fā)生、發(fā)展可能與這些抗菌藥物的選擇性壓力有關(guān)；此外，在某些部位的感染（如尿路感染、血流感染和腹腔膿腫等）存在時，由于替加環(huán)素本身的藥物濃度分布以及體內(nèi)代謝特點，細菌常常暴露于亞抑菌濃度狀態(tài)下，這也可能是導致細菌對其不敏感的因素之一[12-14]。因此，應(yīng)當重視這些科室的耐碳青霉烯類細菌對替加環(huán)素敏感性的監(jiān)測。本研究結(jié)果顯示，耐碳青霉烯類藥物肺炎克雷伯菌對替加環(huán)素的敏感率為95.0%，而耐碳青霉烯類藥物鮑曼不動桿菌的敏感率僅為63.4%。

本研究采用MIC法檢測耐碳青霉烯類藥物肺炎克雷伯菌和鮑曼不動桿菌對替加環(huán)素的敏感性。MIC測試條類似于E-test測試條，MIC法因操作簡便，適用于單個樣本的檢測，而較容易應(yīng)用于臨床[1-2，6]。本研究結(jié)果顯示，MIC法檢測耐碳青霉烯類藥物肺炎克雷伯菌對替加環(huán)素的敏感性在使用FDA標準進行判讀時與微量肉湯稀釋法具有很好的一致性；而對耐碳青霉烯類藥物鮑曼不動桿菌進行檢測時，CA和mE超出可接受范圍，因此其結(jié)果需謹慎對待[2]。

雖然有文獻報道，紙片擴散法不適合用于耐碳青霉烯類藥物鮑曼不動桿菌對替加環(huán)素敏感性的檢測[2]，但由于微量肉湯稀釋法操作較繁瑣，MIC法成本較高，均不適用于臨床常規(guī)篩查，因此本研究還是同時使用了紙片擴散法進行替加環(huán)素敏感性分析。與微量肉湯稀釋法比較，紙片擴散法檢測2種細菌的耐藥率、中介率上升，敏感率下降，且2種細菌CA、mE等評價指標超出可接受范圍，但多數(shù)菌株為微量肉湯稀釋法敏感而紙片擴散法中介或微量肉湯稀釋法中介而紙片擴散法耐藥，未出現(xiàn)微量肉湯稀釋法耐藥而紙片擴散法敏感的結(jié)果。

從本研究61株細菌對臨床常用抗菌藥物的耐藥率分析可見，米諾環(huán)素仍然表現(xiàn)出一定的抗菌活性，其對耐碳青霉烯類藥物肺炎克雷伯菌的敏感率、中介率、耐藥率分別為70.0%、20.0%、10.0%，對耐碳青霉烯類藥物鮑曼不動桿菌的敏感率、中介率、耐藥率分別為0.0%、48.8%、51.2%。本研究就米諾環(huán)素和替加環(huán)素的敏感性分布進行了分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)對于耐碳青霉烯類藥物鮑曼不動桿菌二者結(jié)果一致率較低；對于耐碳青霉烯類藥物肺炎克雷伯菌結(jié)果一致率為70%，并且米諾環(huán)素中介或耐藥株替加環(huán)素的MIC值有不同程度升高。

綜上所述，替加環(huán)素對耐碳青霉烯類藥物肺炎克雷伯菌有較好的抗菌活性，而對耐碳青霉烯類藥物鮑曼不動桿菌的抗菌活性下降，臨床仍然需要對耐碳青霉烯類藥物菌株進行替加環(huán)素抗菌活性的監(jiān)測，尤其是在多重耐藥高發(fā)的重點科室。對于耐碳青霉烯類藥物肺炎克雷伯菌，MIC法檢測替加環(huán)素結(jié)果與微量肉湯稀釋法有較好的一致性，因此推薦MIC法用于臨床常規(guī)檢測或復核確認，而耐碳青霉烯類藥物鮑曼不動桿菌的MIC法檢測結(jié)果需謹慎對待，必要時用微量肉湯稀釋法進行確認。雖然各項評價指標不支持使用紙片擴散法進行替加環(huán)素敏感性分析，但在臨床實驗條件有限的情況下，可將紙片擴散法作為篩查手段，需注意對于不敏感菌株應(yīng)當謹慎解釋，或進一步使用微量肉湯稀釋法確認。耐碳青霉烯類藥物肺炎克雷伯菌對米諾環(huán)素和替加環(huán)素的敏感性結(jié)果的一致率為70%，并且米諾環(huán)素中介或耐藥株替加環(huán)素的MIC值有不同程度升高，因此對米諾環(huán)素敏感的耐碳青霉烯類藥物肺炎克雷伯菌可嘗試先使用替加環(huán)素紙片擴散法篩查，結(jié)果不敏感時可再考慮進行MIC法或微量肉湯稀釋法復核。

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