花生芽白藜蘆醇大孔樹脂純化工藝及抑菌功效

王 娜，寧燦燦，趙 崢，李軍偉，王 凡，任紅濤，詹 軻，余秋穎,4

花生芽白藜蘆醇大孔樹脂純化工藝及抑菌功效

王 娜1,2,3,4，寧燦燦1,3，趙 崢1,3，李軍偉1,3，王 凡1,3，任紅濤1,3，詹 軻1,3，余秋穎1,3,4※

（1. 河南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，鄭州 450002；2. 河南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，鄭州 450002；3. 鄭州市營養(yǎng)與健康食品重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，鄭州 450002；4. 河南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物免疫學(xué)國際聯(lián)合研究中心，鄭州 450002）

為分離純化花生芽中具有潛在抑菌活性的白藜蘆醇化合物及研究其抑菌功效，提高花生的綜合利用價值。該研究通過靜態(tài)吸附-解吸試驗(yàn)，從16種不同型號大孔樹脂中確定白藜蘆醇較佳純化樹脂，并對其動態(tài)吸附-解吸條件優(yōu)化，采用倍比稀釋法、抑菌生長曲線及細(xì)胞膜通透性變化評價純化物對鼠傷寒沙門氏菌的抑制作用。結(jié)果表明：LSA-40大孔樹脂為花生芽白藜蘆醇較佳純化樹脂，其吸附條件為：上樣濃度120.00g/mL，速率1.00 mL/min，pH值4.2，上樣量8.00 mL/g；解吸條件為：80%乙醇溶液，pH值6.6，流速1.00 mL/min，白藜蘆醇純度可達(dá)84.0%；利用紫外光譜、傅里葉紅外光譜、超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜對純化后樣品進(jìn)行鑒定分析，發(fā)現(xiàn)純化物中主要成分為白藜蘆醇及其衍生物；純化物對鼠傷寒沙門氏菌抑制作用結(jié)果表明其最小抑菌濃度為250g/mL，在此濃度下可顯著增加細(xì)胞膜通透性（<0.01），破壞細(xì)胞壁完整性，造成胞內(nèi)蛋白質(zhì)嚴(yán)重泄露，最終導(dǎo)致鼠傷寒沙門氏菌死亡。該研究可為花生資源綜合深度利用及天然抑菌劑的開發(fā)提供一定理論參考。

吸附；抑菌；花生芽；白藜蘆醇；LSA-40大孔樹脂；質(zhì)譜鑒定

0 引 言

花生芽是花生萌發(fā)后產(chǎn)生的一種食療兼?zhèn)涞氖称?，也叫長壽芽，其具有生產(chǎn)工藝簡便、口感獨(dú)特及營養(yǎng)豐富等特點(diǎn)，因此深受大眾青睞[1]。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，花生在發(fā)芽過程中蛋白質(zhì)降解為肽和氨基酸，其生物利用率顯著增加，脂肪含量迅速降低，維生素、鉀、鎂等礦物質(zhì)含量全面提高，營養(yǎng)因子得到改善，特別是具有重要生物活性功能的多酚類物質(zhì)白藜蘆醇含量會大幅提升[2]。白藜蘆醇化學(xué)名為3,4',5-芪三酚，是一種“植物抗毒素”，近年來，國內(nèi)外很多學(xué)者對白藜蘆醇的生物學(xué)功能進(jìn)行了研究，結(jié)果表明其具有抗炎、抗過敏、抗氧化、調(diào)節(jié)糖脂代謝、抑制脂肪沉積、預(yù)防心血管疾病以及延緩衰老等多種作用[3-8]。

據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，全世界每年約有9 380萬人感染沙門氏菌，其中15.5萬人死亡，在中國，70%～80%的食源性細(xì)菌暴發(fā)都是由沙門氏菌引起的[9]。引起感染癥的沙門氏菌血清型主要有鼠傷寒沙門氏菌（，.）、腸炎沙門氏菌、豬霍亂沙門氏菌等10多個血清型，其中鼠傷寒是最常見的血清型之一[10-11]。白藜蘆醇作為一種幾乎無毒副作用且具有廣泛來源的天然植物活性物質(zhì)，具有許多抑菌類藥物不具備的優(yōu)點(diǎn)。近年來，國內(nèi)外已有大量研究發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇具有廣譜抑菌活性，如Marino等[12]通過試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇對金黃色葡萄球菌感染引發(fā)的角膜炎具有抑制作用；李峰等[13]研究表明白藜蘆醇對核桃細(xì)菌性黑斑病菌具有一定的抑制作用；Duan等[14]研究發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇通過下調(diào)sae RS減少金黃色葡萄球菌-溶血素的產(chǎn)生，從而達(dá)到一定的抑制作用。目前人們關(guān)于花生芽白藜蘆醇對鼠傷寒沙門氏菌的研究報道較少。因此本試驗(yàn)通過花生芽白藜蘆醇純化工藝研究，并在對純化物進(jìn)行傅里葉紅外（Fourier-Transform Infrared，F(xiàn)TIR）、超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜（Ultra-Performance Liquid Chromatography-Mass Spectrometry，UPLC-QTOF- MS/MS）鑒定分析的基礎(chǔ)上，通過觀察分析白藜蘆醇作用于鼠傷寒沙門氏菌標(biāo)準(zhǔn)株后，其對菌株的抑制作用，以期為白藜蘆醇在養(yǎng)殖業(yè)、食品行業(yè)和醫(yī)藥行業(yè)中[15]的合理開發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮花生芽，實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)；白藜蘆醇標(biāo)準(zhǔn)品純度≥ 98%、LB培養(yǎng)基、瓊脂粉，北京索萊寶科技有限公司；AB-8、S-8、LX-68、H103、HPD500、LS-303、X-5、ADS-8、HPD450A、LSA-7、LSA-10、LSA-12、LSA-21、LSA-30、LSA-33、LSA-40大孔樹脂，鄭州和成新材料科技有限公司；二甲基亞砜（Dimethyl Sulfoxide，DMSO）、BCA蛋白濃度測定試劑盒，蘭杰柯科技有限公司；硫酸卡那霉素，合肥中龍神力動物藥業(yè)有限公司；鼠傷寒沙門氏菌（ATCC14028），美國菌種保藏中心；所有分離用有機(jī)溶劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

SCIIIIDM型微波光波超聲波萃取儀，寧波新芝生物科技股份有限公司；TU-1901型雙光束紫外可見分光光度計(jì)，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；ME99-2A型自動液相色譜分離層析儀，上海滬西分析儀器廠有限公司；LGJ-10D型冷凍干燥機(jī)，北京四環(huán)科學(xué)儀器廠有限公司；Tensor II型傅立葉變換紅外光譜儀，美國BRUKER公司；1290型超高效液相色譜儀、6550型質(zhì)譜儀、色譜柱waters BEH C18（2.1 mm×100 mm，1.7m），美國Agilent公司。

1.3 大孔吸附樹脂的預(yù)處理

參照巫永華等[16]的方法將樹脂進(jìn)行活化處理，備用。

1.4 白藜蘆醇的標(biāo)準(zhǔn)曲線及曲線方程

參照馬密霞等[17]的方法。以吸光度對濃度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程為=0.1443-0.008，其中R=0.999 6，從而計(jì)算白藜蘆醇含量。

1.5 試驗(yàn)方法

1.5.1 花生芽白藜蘆醇的提取

采取本實(shí)驗(yàn)室的方法[18]進(jìn)行白藜蘆醇粗提液的制備。

1.5.2 乙酸乙酯萃取

將上述方法所得粗提液離心，棄沉淀，使用微孔濾膜（孔徑=0.45m）過濾除雜，其次采取陳瓊玲等[19]的方法進(jìn)行初步純化。

1.5.3 大孔樹脂靜態(tài)吸附-解吸動力學(xué)曲線

參照楊希娟等[20]方法，并稍作修改。準(zhǔn)確稱取預(yù)處理后樹脂2.0 g置于100 mL三角瓶中，加入白藜蘆醇質(zhì)量濃度為141.43g/mL的花生芽提取液20 mL，于溫度25 ℃、120 r/min的水浴搖床中振蕩吸附，每隔30 min取樣一次，以吸附時間為1軸，吸附量為1軸，測定樣液中白藜蘆醇含量，繪制吸附動力學(xué)曲線圖。將錐形瓶中吸附飽和的樹脂用蒸餾水沖洗至液體澄清、無渾濁狀態(tài)，其次加入20 mL 70%乙醇溶液，于25℃、120 r/min的水浴搖床中，每隔一定時間取樣一次，以解吸時間為2軸，解吸量為2軸，測定樣液中白藜蘆醇含量，繪制解吸動力學(xué)曲線圖。

式中為大孔樹脂的吸附率，%；為大孔樹脂解吸率，%；0為吸附前樣品溶液白藜蘆醇的質(zhì)量濃度，g/mL；1為吸附后樣品溶液白藜蘆醇的質(zhì)量濃度，g/mL；1為樣液體積，mL；2為解吸液中白藜蘆醇質(zhì)量濃度，g/mL；2為解吸液體積，mL。

1.5.4 大孔樹脂動態(tài)吸附-解吸條件的優(yōu)化

參考劉樹興等[21]的方法進(jìn)行優(yōu)化。將處理好的樹脂濕法裝柱，考察料液濃度、上柱速率、粗提液pH值、上樣量對大孔樹脂吸附效果的影響；吸附完成后考察解吸劑濃度、解吸劑pH值、解吸流速、解吸劑體積對大孔樹脂解吸效果的影響。

1.5.5 產(chǎn)品純度定性定量分析及組分鑒定

1）紫外光譜掃描

準(zhǔn)確稱取一定量的白藜蘆醇純化物凍干粉和標(biāo)準(zhǔn)品，用甲醇溶液將其配制成8.0g/mL的樣液及標(biāo)液。以甲醇作為空白對照，在190～700 nm范圍內(nèi)進(jìn)行紫外光譜掃描[22]。

2）傅里葉紅外光譜掃描檢測

利用傅里葉紅外光譜儀進(jìn)行分析。在衰減全反射模式（Attenuated Total Refraction，ATR）下，稱取一定量的白藜蘆醇凍干粉和標(biāo)準(zhǔn)品，對其特征吸收峰進(jìn)行表征。波數(shù)范圍為400～4 000 cm-1。

3）超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜（UPLC-QTOF-MS/MS）檢測

色譜條件：色譜柱為waters BEH C18（2.1 mm×100 mm，1.7m）；流動相A：5 mmol乙酸銨水溶液；流動相B：甲醇溶液。梯度洗脫程序?yàn)椋?～25 min：55%～40%A、45%～60%B；25～30 min：40%～55%A、60%～45%B；30～40 min：55%A、45%B。進(jìn)樣量5L，流速為 0.3 mL/min；質(zhì)譜掃描范圍：一級50～1 000 m/z，鞘流氣溫度350℃，鞘流氣流量12 L/min，ESI-模式，電壓3 200 V。

1.6 花生芽白藜蘆醇抑菌功效研究

1.6.1 最小抑菌濃度（Minimum Inhibitory Concentration，MIC）測定

參考杜貝貝[23]、郭文瑤[24]的方法測定.的MIC，同時以硫酸卡那霉素藥物培養(yǎng)基為陽性對照，以含2%DMSO培養(yǎng)基為陰性對照，通過酶標(biāo)儀測定600 nm菌液的吸光度，以無菌生長孔所對應(yīng)的白藜蘆醇純化物濃度為最小抑菌濃度[25]。

1.6.2 生長曲線的測定

參考朱亞珠等[26]的方法并稍作修改，繪制白藜蘆醇對.的生長曲線。

1.6.3 細(xì)菌通透性測定

參考Wang等[27]的試驗(yàn)方法，收集菌體上清液，將上清液用0.22m濾膜過濾，按照BCA蛋白濃度測定試劑盒的方法測定不同處理?xiàng)l件下菌體細(xì)胞外的蛋白質(zhì)含量。

1.7 數(shù)據(jù)分析

所有試驗(yàn)均重復(fù)3次，使用Excel 2019對數(shù)據(jù)進(jìn)行初步處理，采用SPSS 16.0軟件進(jìn)行單因素差異性分析，使用Origin 8.5、GrapHPad Prism8軟件進(jìn)行作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 大孔樹脂對白藜蘆醇靜態(tài)吸附-解吸的影響

不同大孔樹脂因其極性和比表面積不同，故會表現(xiàn)出不同的吸附和解吸性能。16種大孔樹脂吸附和解吸性能如表1所示，LSA-40樹脂吸附率與解吸率均高于其他型號樹脂，且LSA-40樹脂為弱極性，由于多酚類化合物的分子中含有多個酚羥基結(jié)構(gòu)，其分子的極性不高，所以弱極性的樹脂吸附效果較好。因此，選用LSA-40樹脂作為分離純化白藜蘆醇的較佳樹脂。

表1 不同型號樹脂對白藜蘆醇吸附解吸性能

2.2 LSA-40大孔樹脂的靜態(tài)吸附-解吸動力學(xué)曲線

由圖1a可知，在吸附前110 min內(nèi)，樹脂對白藜蘆醇的吸附量隨時間的延長呈線性增加趨勢，在110 min時，吸附速率逐漸平穩(wěn)，表明此時樹脂已接近吸附平衡，故選用110 min為較佳吸附平衡時間。由圖1b可知，90 min時，LSA-40樹脂對花生芽白藜蘆醇的解吸率達(dá)到飽和，其后隨著解吸時間的延長解吸率趨于平衡。由此確定較佳解吸時間為90 min。

圖1 LSA-40大孔樹脂的靜態(tài)吸附和解吸動力學(xué)曲線

2.3 LSA-40樹脂對白藜蘆醇動態(tài)吸附-解吸影響因素研究

2.3.1 上樣料液濃度、速率、pH值和液質(zhì)比對吸附效果的影響

由圖2a可知，在白藜蘆醇總量相同的情況下，吸附率與上柱濃度呈拋物線關(guān)系，濃度在120g/mL時吸附率達(dá)最高，因此，選擇上柱濃度120g/mL為最佳。由圖 2b可知，上樣速率越小，則樹脂對白藜蘆醇的吸附容量就越大，但所耗時會增加。當(dāng)速率超過1.0 mL/min后，吸附率下降較快，綜合考慮吸附率及效率可選擇流速1.0 mL/min。劉樹興等[21]對虎杖中白藜蘆醇的純化研究也得出了相同結(jié)果。由圖2c發(fā)現(xiàn)，隨著pH值的增加，白藜蘆醇吸附率呈先增加后降低的趨勢，在pH=4.2時，吸附率達(dá)到峰值，因此確定上柱液的pH值為4.2。根據(jù)圖 2d可以看出，當(dāng)上樣量與樹脂質(zhì)量比例為8時吸附效果最好，上樣量的比例再增大，則超過樹脂飽和吸附量，吸附率反而下降，故選擇上樣量為樹脂質(zhì)量的8倍為較佳。

注：同一指標(biāo)不同字母代表差異顯著（P<0.05），下同。

2.3.2 乙醇濃度、pH值和流速對解吸效果的影響

由圖3a可知，隨著乙醇濃度增大，解吸率逐漸增高，因考慮到隨著乙醇濃度增加，洗脫液中其他脂溶性雜質(zhì)溶出增加，并且當(dāng)濃度上升到80%時，再增大乙醇濃度，解吸率無顯著差異（>0.05），故選用80%的乙醇作為解吸劑。由圖3b可知，解吸液在pH值為7.6時解吸效果最好，因白藜蘆醇在堿性溶液中不穩(wěn)定，且在自然狀態(tài)下pH值為6.6，與pH值7.6時解吸率無顯著差異（>0.05），故選用pH值為6.6解吸液進(jìn)行洗脫更有利于其穩(wěn)定性。由圖3c可知，解吸率隨流速增大而減小，且流速越大，溶劑與樹脂的作用時間越短，使有效成分不能充分解吸。但隨著流速的增大，生產(chǎn)效率會提高。綜合考慮選擇流速1.0 mL/min較為合適。

2.3.3 花生芽白藜蘆醇解吸曲線研究

根據(jù)已知確定的吸附條件以選取10 g樹脂為例，上樣充分吸附后，以解吸條件進(jìn)行解吸操作，流出液每8 mL單獨(dú)收集于刻度試管中，并測定每份解吸液的白藜蘆醇濃度，以解吸液體積為橫坐標(biāo)，白藜蘆醇濃度為縱坐標(biāo)，繪制解吸曲線。由圖4可以看到，解吸初始，白藜蘆醇洗脫較少，但很快，在10～80 mL的洗脫液中，解吸了大部分的有效成分，隨著乙醇的繼續(xù)洗脫，剩余少量的白藜蘆醇也逐漸被解吸下來，考慮到提高純化效率，故選用解吸液體積80 mL，其與樹脂質(zhì)量比為8 mL/g作為較佳洗脫量。

a. 乙醇濃度對解吸率的影響a. Effects of ethanol concentration on desorption rateb. pH值對解吸率的影響b. Effects of pH on desorption ratec. 流速對解吸率的影響c. Effects of flow rate on desorption rate

圖4 白藜蘆醇解吸曲線

2.4 純化后白藜蘆醇的分析及鑒定

2.4.1 紫外全波長掃描分析

由圖5可知，將分離純化所得出的白藜蘆醇用甲醇溶解，對比白藜蘆醇標(biāo)品與純化后樣品紫外全波長掃描圖，發(fā)現(xiàn)樣品與標(biāo)準(zhǔn)品吸收峰基本一致，說明該提取物屬于白藜蘆醇類物質(zhì)。參考紀(jì)秀鳳等文獻(xiàn)的方法[28]，通過計(jì)算，樣品白藜蘆醇純度可達(dá)84.0%。

圖5 花生芽白藜蘆醇純化物紫外可見光譜掃描圖

2.4.2 FTIR掃描分析

花生芽白藜蘆醇純化物的傅里葉紅外光譜結(jié)果如圖 6所示，可知該純化產(chǎn)物與標(biāo)準(zhǔn)品特征吸收峰之間無明顯差異，主要吸收峰有：3 336、1 607、1 513、1 461、1 144、1 061、964、831、670、515 cm-1。3 336 cm-1處吸收峰是由于分子結(jié)構(gòu)中羥基的伸縮振動形成的；在1 607、1 513、1 461 cm-1處有吸收峰主要是由于苯環(huán)內(nèi)的C=C和C-C間耦合而成的伸縮振動作用導(dǎo)致；在1 061、964、831 cm-1處有強(qiáng)吸收峰是因兩酚環(huán)間的反式-C=C-的伸縮振動引起；在670 cm-1處有特征吸收峰是由于兩酚環(huán)間順式-C=C-的伸縮振動所導(dǎo)致。以上說明花生芽白藜蘆醇結(jié)構(gòu)中有酚羥基、苯環(huán)、-C=C-等特征基團(tuán)，此結(jié)果與孫磊磊[29]和李小妹等[30]文獻(xiàn)研究報道相一致。

圖6 花生芽白藜蘆醇純化物紅外光譜圖分析

2.4.3 UPLC-QTOF-MS/MS鑒定分析

通過超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜（UPLC-QTOF- MS/MS），結(jié)合準(zhǔn)分子離子[M-H]-(m/z)和相對應(yīng)的碎片離子信息，對花生芽白藜蘆醇純化物組成進(jìn)行分析。圖7為負(fù)離子模式下得到的總離子流圖，對譜峰的多級碎片進(jìn)行解析，共鑒別了8個化學(xué)成分，主要包含白藜蘆醇和原花青素兩種物質(zhì)。白藜蘆醇是一種非黃酮類多酚化合物，順式白藜蘆醇對光不穩(wěn)定，故自然界中大多以反式白藜蘆醇存在，其衍生物主要包括氧化白藜蘆醇和白藜蘆醇苷，根據(jù)其聚合程度分為白藜蘆醇二聚體、四聚體等[31]；原花青素是由黃烷-3-醇結(jié)構(gòu)單元組成的多酚類物質(zhì)，單體主要包括兒茶素（Catechin，Cat）、表兒茶素（Epicatechin，EC）、表兒茶素沒食子酸酯（Epicatechin Gallate，ECG）及表沒食子兒茶素沒食子酸（Epigallocatechin Gallate，EGCG）等[32-33]，根據(jù)單體間化學(xué)鍵結(jié)合位置不同可以將其分為A型原花青素和B型原花青素，而花生中以A型原花青素為主，且A型更穩(wěn)定性、生物利用度更高。

注：1-8號含義見表2。

純化物主要成分組成，匯總結(jié)果具體見表2。

表2 已知化合物的鑒定分析結(jié)果

化合物1和2的分子離子[M-H]-m/z為863，其結(jié)構(gòu)為A型原花青素三聚體。Monagas等[34]發(fā)現(xiàn)其碎片離子包括m/z 711、m/z 575、m/z 451、m/z 411和m/z 289。其中m/z 711是在T-unit位置發(fā)生逆狄爾斯-阿爾德（Retro- Diels-Alder，RDA ）和雜環(huán)裂解（Heterocyclic Ring Fission，HRF）斷裂產(chǎn)生的離子，m/z 575是分子離子黃烷醇間連接鍵的斷裂量子力學(xué)（Quantum Mechanics，QM）發(fā)生在T-unit連接鍵位置時形成的，m/z 451和m/z 411是M-unit上發(fā)生HRF裂解產(chǎn)生，m/z 289是分子離子黃烷醇間連接鍵的斷裂（QM）發(fā)生在M-unit連接鍵位置時形成的。通過表2碎片離子信息與上述參考文獻(xiàn)描述相符，確定其為A型原花青素三聚體。

化合物3的分子離子[M-H]-m/z為575，其結(jié)構(gòu)為A型原花青素二聚體。紀(jì)秀鳳[35]研究發(fā)現(xiàn)其碎片離子包括m/z 289、m/z 285。m/z 289和m/z 285是由于QM碎裂失去B-unit和T-unit中性碎片所形成的。通過表2碎片離子信息與上述參考文獻(xiàn)一致，確定其為A型原花青素二聚體。

化合物4的分子離子[M-H]-m/z為243，其結(jié)構(gòu)為氧化白藜蘆醇。對于氧化白藜蘆醇通過丟失碎片C2H2O、2C2H2O形成產(chǎn)物離子m/z 201、m/z 159。通過表2碎片離子信息與楊陽[36]文獻(xiàn)結(jié)果一致，因此確定為氧化白藜蘆醇。

化合物5的分子離子[M-H]-m/z為227，其結(jié)構(gòu)為白藜蘆醇。在負(fù)離子模式下掃描，并通過碰撞誘導(dǎo)解離（Collision-Induced Dissociation，CID）產(chǎn)生一系列特征碎片離子m/z 185、m/z 159、m/z 143。通過表2碎片離子信息與吳泳錫等[37]文獻(xiàn)描述相符，確定其為白藜蘆醇。

化合物6的分子離子[M-H]-m/z為441，其結(jié)構(gòu)為表兒茶素沒食子酸酯。在負(fù)離子模式下對母離子進(jìn)行碰撞誘導(dǎo)解離，獲得二次特征碎片離子m/z 288、m/z 169。通過表2碎片離子信息與馮峰等[38]參考文獻(xiàn)描述相符，確定其為表兒茶素沒食子酸酯。

化合物7的分子離子[M-H]-m/z為451，其結(jié)構(gòu)為白藜蘆醇二聚體。通過丟失碎片H2O、C2H2O、C7H6O形成產(chǎn)物離子m/z 435、m/z 409、m/z 305。準(zhǔn)分子離子峰[M-H]-失去碎片C2H2O形成產(chǎn)物離子m/z 409是其間苯二酚失去C2H2O所致。通過表2碎片離子信息與宇嘉[31]參考文獻(xiàn)描述相符，確定其為白藜蘆醇二聚體。

化合物8的分子離子[M-H]-m/z為389，其結(jié)構(gòu)為白藜蘆醇苷。通過表2得到的主要碎片離子m/z 185、m/z 143，與白黎蘆醇苷母離子裂解丟失一個取代葡萄糖基(-C6H10O5)生成的苷元，白藜蘆醇負(fù)離子的m/z 185相符，并與董靜等[39]文獻(xiàn)方法對白藜蘆醇苷的分析結(jié)果一致，因此確定m/z為389的化合物為白藜蘆醇苷。

2.5 花生芽白藜蘆醇對鼠傷寒沙門氏菌抑菌功效評價

2.5.1 花生芽白藜蘆醇對鼠傷寒沙門氏菌最小抑菌濃度的研究

由圖8可知，白藜蘆醇純化物濃度在250g/mL（含白藜蘆醇為210g/mL）時能夠顯著抑制.的生長（<0.01），因此白藜蘆醇純化物對.的最小抑菌濃度（MIC）為250g/mL，與紅豆皮多酚提取物MIC[40]（2 500g/mL）相比具有顯著優(yōu)勢；隨著白藜蘆醇純化物濃度增加，抑制活性越強(qiáng)，在500g/mL時，基本能夠完全抑制.生長；在低于MIC濃度時，白藜蘆醇純化物均不能有效抑制.的生長。

2.5.2 花生芽白藜蘆醇純化物對鼠傷寒沙門氏菌生長曲線影響的研究

細(xì)菌在適宜條件下的生長曲線大致呈“S”型，一般會經(jīng)歷延滯期、對數(shù)期、穩(wěn)定期。由圖9可知，白藜蘆醇純化物濃度為62.5、125、250g/mL 3個試驗(yàn)組的生長曲線表現(xiàn)出不同程度的抑制效果。62.5g/mL組約在5 h后呈指數(shù)形式增長，約16 h后到達(dá)穩(wěn)定期；125g/mL組約在7 h后呈指數(shù)形式增長，約18 h后到達(dá)穩(wěn)定期，說明在62.5、125g/mL濃度處理?xiàng)l件下白藜蘆醇破壞了.生長周期，導(dǎo)致其延滯期延長及對數(shù)生長期生長速度降低，且白藜蘆醇濃度越高，抑制作用越明顯250g/mL組約在18 h后才表現(xiàn)出微小的生長趨勢，且整體生長速度緩慢，延滯期相比陰性對照組明顯延長，說明濃度為250g/mL的白藜蘆醇溶液幾乎完全破壞了細(xì)菌的正常細(xì)胞分裂及生長周期，.的正常生長受到嚴(yán)重破壞。綜上，62.5和125g/mL處理組抑制作用表現(xiàn)為延長遲緩期并降低其生長速度，當(dāng)白藜蘆醇純化物濃度為250g/mL時，顯著抑制.的生長。

注：“*”表示組間存在顯著性差異（P<0.05），“**”表示組間存在極顯著差異（P<0.01），圖10同。

2.5.3 花生芽白藜蘆醇對鼠傷寒沙門氏菌蛋白質(zhì)泄露的研究

蛋白質(zhì)對于細(xì)胞的生長發(fā)育、生長代謝、各種生理功能的發(fā)揮具有重要作用。當(dāng)細(xì)胞膜受到損傷時，其通透性會增加，從而使胞內(nèi)大量內(nèi)容物外泄，嚴(yán)重影響細(xì)胞的正常生長。因此，可以通過測定培養(yǎng)基中的蛋白質(zhì)含量來判斷細(xì)胞是否遭到破壞。如圖10所示，白藜蘆醇純化物濃度62.5g/mL組與空白對照組沒有顯著性差異（>0.05），說明該濃度下菌體蛋白質(zhì)泄露不明顯。當(dāng)濃度增至125、250g/mL時，細(xì)胞遭到嚴(yán)重破壞，其內(nèi)容物溢出，導(dǎo)致培養(yǎng)液中的蛋白質(zhì)含量增加，與空白對照組相比有極顯著差異（<0.01），即白藜蘆醇濃度越大蛋白質(zhì)泄露程度越深，細(xì)胞膜和細(xì)胞壁破損越嚴(yán)重。由此表明，花生芽白藜蘆醇對.有明顯抑制作用。

圖9 鼠傷寒沙門氏菌在不同濃度白藜蘆醇純化物處理下的生長曲線

圖10 花生芽白藜蘆醇對鼠傷寒沙門氏菌蛋白質(zhì)泄露的影響

3 結(jié) 論

本文通過靜態(tài)吸附-解吸試驗(yàn)比較了AB-8、 S-8、LX-68、H103、X-5、LSA-40等16種大孔樹脂對花生芽白藜蘆醇提取物的分離純化效果，從中篩選出LSA-40為較佳吸附樹脂類型，該樹脂對花生芽白藜蘆醇具有較好的吸附和解吸性能，且價格便宜，易操作。通過動態(tài)吸附-解吸條件優(yōu)化，得到適宜吸附條件為上樣濃度120.00g/mL，上樣速率1.00 mL/min，pH值為4.2，上樣量8.00 mL/g；解吸條件為80%乙醇溶液，pH值6.6，流速1.00 mL/min。經(jīng)紫外光譜分析，LSA-40大孔樹脂在較優(yōu)工藝條件下分離純化的花生芽白藜蘆醇其純度可達(dá)84.0%；利用傅里葉紅外光譜、超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜鑒定分析表明純化物中主要含有白藜蘆醇低聚體及部分原花青素低聚體。通過測定白藜蘆醇純化物對.的最小抑菌濃度得出最小抑菌濃度（Minimum Inhibitory Concentration，MIC）為250g/mL，此外，通過繪制生長曲線及細(xì)胞內(nèi)容物蛋白質(zhì)含量變化得出白藜蘆醇純化物處理后的.，其延滯期延長、對數(shù)期生長速度降低，細(xì)胞壁完整性遭到破壞，細(xì)胞膜通透性增加，最終導(dǎo)致菌體無法正常生長，表明經(jīng)LSA-40樹脂純化后的花生白藜蘆醇具有較高的活性。該研究可為花生資源深度利用和白藜蘆醇生物活性的構(gòu)效分析及其在功能性食品、藥品、化妝品和無抗養(yǎng)殖等領(lǐng)域的利用提供一定的科學(xué)依據(jù)。

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Purification process by macroporous resin and antibacterial efficacy of resveratrol from peanut buds

Wang Na1,2,3,4, Ning Cancan1,3, Zhao Zheng1,3, Li Junwei1,3, Wang Fan1,3, Ren Hongtao1,3, Zhan Ke1,3, Yu Qiuying1,3,4※

(1.,,450002,;2.,,450002,; 3.,450002,;4.,,450002,)

Peanut sprout (longevity sprout) is one kind of favored food and therapy, due to its crisp taste and unique flavor. The energy, protein, and crude fat content of peanut buds after germination is significantly higher than that of various vegetables. There is a great increase in the content of vitamins, potassium, magnesium minerals, and various amino acids and trace elements required by the human body, especially the content of resveratrol, a polyphenol with important bioactive functions. Among them, resveratrol (chemically known as 3, 4', 5-astragalotriphenol) has the broad-spectrum antibacterial activity as the "plant antitoxin" in recent years. But, there are only a few reports on the effects of peanut bud resveratrol on. This study was focused on the isolation and purification technique of resveratrol from peanut buds, together with its antibacterial properties. The resins were screened with excellent adsorption and desorption properties for the peanut bud resveratrol compounds, in order to construct the isolation and purification process. The antibacterial efficacy was evaluated to improve the comprehensive utilization of peanut resources. A comparison was made to determine the effects of 16 types of macroporous resins on the separation and purification of arachidonic resveratrol compounds using static adsorption-desorption tests. The LSA-40 was selected as the best adsorption resin for the saturation and plateau in 110 and 90min of static adsorption, respectively. The dynamic adsorption-desorption conditions were optimized as follows. The loading concentration was 120.00g/mL, the flow rate was 1.00 mL/min, the pH value was 4.2, and theoptimum ratio of loading volume to resin was 8.00mL/g. The desorption conditions were the 80% ethanol solution, a pH value of 6.6, and a flow rate of 1.00 mL/min. Ultraviolet (UV) spectral analysis showed that the absorption peaks of the purified arachidonic resveratrol and the control were basically the same under the optimized process conditions, where the purity was calculated to be 84.0%. Fourier infrared spectroscopy and ultra-performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry were used to identify the components of the purified samples. It was found that the main components of the purified products were resveratrol and the derivatives. The inhibition effect of the purified product onwas evaluated by multiplicative dilution, inhibition growth curve, and cell membrane permeability. The minimum inhibitory concentration of resveratrol-purified product onwas 250g/mL. In addition,treated with resveratrol purification presented a prolonged lag period and a decreased growth rate in the logarithmic phase at the MIC concentration. The cell membrane permeability significantly increased (< 0.01), according to the growth curve and the protein content of cell contents. The integrity of the cell wall was damaged causing the serious leakage of intracellular proteins, eventually leading to the death of. This finding can provide some theoretical reference for the comprehensive utilization of peanut resources in natural antibacterial agents.

adsorption;bacteriostasis; peanut sprouts; resveratrol;LSA-40 macroporous resin; mass spectrometry identification

10.11975/j.issn.1002-6819.2022.18.032

TS209

A

1002-6819(2022)-18-0293-09

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2022-06-25

2022-09-13

“十三五”國家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃專項(xiàng)（2019YFC1605700）；鄭州市營養(yǎng)與健康食品重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室項(xiàng)目（KF20190426）；河南省花生產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系項(xiàng)目（2022）

王娜，博士，副教授，研究方向?yàn)槭称钒踩c免疫學(xué)。Email：na-wang@163.com

余秋穎，博士，講師，研究方向?yàn)槭称钒踩c免疫學(xué)。Email：yuqiuyingzf@163.com