蘭州百合多糖的酶解工藝及其體外抗氧化活性研究

惠和平，王 萍，張心馳，蔡 偉，李曉東，李冠男，劉穎楠

（1.甘肅農(nóng)業(yè)職業(yè)技術(shù)學院，甘肅 蘭州 730020；2.甘肅中醫(yī)藥大學藥學院，甘肅 蘭州 730010；3.甘肅省中醫(yī)院，甘肅省中醫(yī)藥研究院，甘肅 蘭州 730050）

蘭州百合（Lilium davidii var.unicolor Salisb.）為百合科（Liliaceae）百合屬（Lilium）多年生草本球根植物[1]，主要分布在我國甘肅省蘭州市七里河地區(qū)。作為我國西部地區(qū)大面積種植的食用百合，其鱗莖碩大、鱗片豐滿、口感甘甜，名列食用百合之首。蘭州百合始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》[2]，具有較高的營養(yǎng)價值和藥用價值，富含19種游離氨基酸和多種人體必需的微量元素，其蛋白含量是普通蔬菜的3~5倍，糖含量是普通蔬菜的10倍[3]?，F(xiàn)代藥理學研究表明，蘭州百合多糖具有明顯的增強免疫、抗疲勞、抗癌、提高耐缺氧等作用[4-7]。

近年來，天然源多糖因其生物活性豐富、無毒、生物可降解和生物相容性等而備受關(guān)注[8-10]。然而，大部分多糖的生物活性受到其理化性質(zhì)和結(jié)構(gòu)的影響，如分子量大、黏度高，水中溶解度低及結(jié)構(gòu)復(fù)雜等問題，其開發(fā)和利用受到一定的限制。國內(nèi)外報道[8，11-13]顯示蘭州百合多糖為雜多糖，含有β-1,4-葡糖糖、β-1,4-甘露糖和α-1,3-半乳糖等多種連接類型，結(jié)構(gòu)復(fù)雜，分子量大（10萬左右），黏度達81.698 cm3/g，這也導致蘭州百合多糖的應(yīng)用受限。有研究表明，多糖的活性中心可能是其中某幾個多糖片段或寡糖[14-16]，而降解多糖是目前獲得分子量低、水溶性好、結(jié)構(gòu)簡單的高活性多糖片段或寡糖的主要手段。

酶解法，作為目前多糖降解的常用方法，具有專一性強、反應(yīng)迅速、條件溫和、得率高等優(yōu)點，且能最大程度地保護反應(yīng)底物的活性基團[17-19]。如李科等人[20]采用內(nèi)切α-1,4-葡聚糖酶酶解黃芪多糖，獲得了不同聚合度的寡糖組分，并且發(fā)現(xiàn)聚合度在10~18之間的寡糖活性強于多糖，可能為黃芪多糖的活性中心。Wu Q等人[21]運用響應(yīng)面法優(yōu)化了纖維素酶對黑木耳多糖的酶解，在獲得最佳酶解工藝的條件下發(fā)現(xiàn)酶解后黑木耳多糖具有更好的抗氧化活性。楊玲[22]采用β-甘露聚糖酶酶解仙茅多糖，通過純化得到仙茅寡糖XP1~XP5，并且發(fā)現(xiàn)三聚葡甘露寡糖XP3保留了仙茅寡糖的活性基團，其誘導巨噬細胞分泌IL-1的能力高于仙茅多糖X-2。β-甘露聚糖酶可以選擇性降解1,4-連接的甘露葡聚糖和甘露聚糖等[22]，而蘭州百合多糖主要由1,4-β-D-吡喃甘露糖和葡萄糖組成。截至目前，沒有關(guān)于酶降解蘭州百合多糖的報道。因此，采用β-甘露聚糖酶降解蘭州百合多糖，通過正交試驗得到最佳酶解工藝，并對酶解前后蘭州百合多糖的抗氧化活性進行了比較研究，以期為蘭州百合多糖活性片段的制備及其高值化利用提供可行的技術(shù)路線和試驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

百合，購自甘肅省蘭州市七里河區(qū)上西園種植戶，經(jīng)蘭州大學藥學院馬志剛教授鑒定為蘭州百合（Lilium davidii var.unicolor Salisb.）。

β-甘露聚糖酶（6×104U/g），北京Solarbio生物科技有限公司提供；1,1-二苯基-2-苦基肼基（DPPH），（分析純98%），上海源葉生物科技有限公司提供；2,2-聯(lián)氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二銨鹽（ABTS），（分析純≥98%）、葡萄糖標準品，（分析純≥99%），美國Sigma公司提供；3,5-二硝基水楊酸（DNS），（分析純98%）、焦性沒食子酸，（分析純＞99%），上海麥克林生化科技有限公司提供；過硫酸鈉，（分析純≥98%），天津市科密歐化學試劑有限公司提供；水楊酸、過氧化氫、七水硫酸亞鐵，國藥集團化學試劑有限公司提供，（分析純≥99%）。

1.2 儀器與設(shè)備

DF-101S型集熱式磁力加熱攪拌器、DZF-6050型電熱真空干燥箱、RE-2000A型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀、DF-101S型恒溫水浴鍋，上海耀特儀器設(shè)備有限公司產(chǎn)品；SCIENTZ-10N型冷凍干燥機，寧波新芝生物科技股份有限公司產(chǎn)品；AnkeGL-16G-II型高速冷凍離心機，上海安亭科學儀器有限公司產(chǎn)品；UV-2800A型紫外可見分光光度計，尤尼柯（上海）儀器有限公司產(chǎn)品。

1.3 試驗方法

1.3.1 蘭州百合多糖的酶解工藝流程

蘭州百合→搗碎→80%乙醇回流脫脂→濾渣抽干→熱水提取→70%乙醇沉淀→離心取沉淀→凍干→蘭州百合多糖→加水溶解→Sevag法脫蛋白→濃縮凍干→β-甘露聚糖酶酶解→滅酶→過濾取上清液濃縮→透析→冷凍干燥即得。

1.3.2 還原糖標準曲線的制作

精密稱取葡萄糖標準品100 mg，加水定溶于100 mL容量瓶中。分別精密吸取葡萄糖溶液0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.2 mL于25 mL容量瓶中，補蒸餾水至2 mL，分別加入3 mL DNS溶液，混合均勻后，90℃水浴加熱7 min，取出后迅速冷卻至室溫，加蒸餾水定容至刻度，搖勻放置30 min，于波長540 nm處檢測吸光度。以吸光度（Y）為縱坐標，葡萄糖質(zhì)量濃度（X）為橫坐標繪制還原糖的標準曲線，得出回歸方程為Y=1.296 8X-0.049 5，相關(guān)系數(shù)R2=0.996 1。

1.3.3 單因素試驗

取1.0 g蘭州百合多糖為原料，在β-甘露聚糖酶的最適溫度（50℃）和最適pH值（pH=4.8）條件下，考查底物質(zhì)量分數(shù)、酶添加量和酶解時間對還原糖質(zhì)量濃度的影響。

首先，固定酶添加量0.3%，酶解時間3 h，考查底物質(zhì)量分數(shù)（0.05%，0.10%，0.15%，0.20%，0.25%）對還原糖生成量的影響，確定底物質(zhì)量分數(shù)的試驗水平；其次，固定底物質(zhì)量分數(shù)0.15%，酶解時間3 h，考查酶添加量（0.1%，0.2%，0.3%，0.4%，0.5%）對還原糖生成量的影響，確定酶添加量的試驗水平；接著，固定底物質(zhì)量分數(shù)0.15%，酶加入量0.3%，考查酶解時間（1，2，3，4，5 h）對還原糖生成量的影響，確定酶解時間的試驗水平。試驗平行操作3次，通過統(tǒng)計軟件分析確定底物質(zhì)量分數(shù)、酶添加量和酶解時間3個因素的試驗水平。

1.3.4 正交試驗設(shè)計

蘭州百合多糖酶解因素與水平設(shè)計見表1。

表1 蘭州百合多糖酶解因素與水平設(shè)計

根據(jù)單因素試驗結(jié)果，選擇底物質(zhì)量分數(shù)、酶添加量和酶解時間3個因素進行正交試驗，每個因素分別選擇3個水平（見表1），設(shè)計L9（34）正交試驗（見表2），以還原糖質(zhì)量濃度為考查指標，通過統(tǒng)計軟件IBM SPSS Statistics 25分析確定蘭州百合多糖酶解的最佳工藝。

1.3.5 還原糖生成量的測定

取凍干后酶解產(chǎn)物加蒸餾水配置成1 mg/mL的溶液，吸取0.1 mL，補蒸餾水至2 mL，依“1.3.2”方法下“分別加入3 mL DNS溶液，…”操作，按照公式（1）計算還原糖的質(zhì)量濃度。

式中：X——樣品溶液中多糖質(zhì)量濃度，mg/mL；

V1——樣品溶液濃縮后體積，mL；

N——稀釋倍數(shù)；

V2——樣品溶液濃縮前體積，mL。

1.3.6 體外抗氧化活性試驗

（1）樣品的制備。準確稱取蘭州百合多糖酶解產(chǎn)物和維C分別配制成質(zhì)量濃度為4.00，2.00，1.00，0.50，0.25 mg/mL的溶液備用。

（2）DPPH自由基清除活性的測定。參考文獻[23]測定DPPH自由基清除能力，按公式（2）計算清除率。

式中：A樣——不同質(zhì)量濃度的多糖溶液+DPPH儲備液的吸光度；

A控——不同質(zhì)量濃度的多糖溶液+50%乙醇的吸光度；

A空——蒸餾水+DPPH儲備液的吸光度。

（3）ABTS自由基清除活性的測定。參考文獻[24]測定ABTS自由基清除能力，按公式（3）計算清除率。

式中：A樣——不同質(zhì)量濃度的多糖溶液+ABTS儲備液的吸光度；

A控——不同質(zhì)量濃度的多糖溶液+蒸餾水的吸光度。

（4）羥自由基清除活性的測定。參考文獻[25]測定羥自由基清除能力，按公式（4）計算清除率。

式中：A樣——不同質(zhì)量濃度的多糖溶液+FeSO4·7H2O溶液+水楊酸溶液的吸光度；

A控——不同質(zhì)量濃度的多糖溶液+FeSO4·7H2O溶液+蒸餾水的吸光度；

A空——蒸餾水+FeSO4·7H2O溶液+水楊酸溶液的吸光度。

（5）超氧自由基清除活性的測定。參考文獻[26]測定超氧自由基清除能力，按公式（5）計算清除率。

式中：V1——樣品作用下鄰苯三酚的自氧化速率，%；

V0——鄰苯三酚的自氧化速率，%。

1.4 數(shù)據(jù)分析

所有數(shù)據(jù)均以“平均值±標準差”表示，采用Origin 2019b 64Bit繪圖，IBM SPSS Statistics 25軟件進行試驗分析和方差分析，p＜0.05或p＜0.01表示差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗結(jié)果

底物質(zhì)量分數(shù)、酶添加量、酶解時間對蘭州百合多糖酶解后還原糖質(zhì)量濃度的影響見圖1。

由圖1（a）可知，隨著底物質(zhì)量分數(shù)的增加，還原糖質(zhì)量濃度呈逐漸增加的趨勢，在底物質(zhì)量分數(shù)為0.2%時達最大，之后還原糖質(zhì)量濃度隨底物質(zhì)量分數(shù)的增加反而降低。這可能是因為質(zhì)量分數(shù)較低時，底物可以充分的溶解在溶液中，當質(zhì)量分數(shù)再增加，底物的溶解趨于飽和。此時，增加底物質(zhì)量分數(shù)還會導致溶液變黏稠。底物質(zhì)量分數(shù)0.20%與0.25%對還原糖質(zhì)量濃度的影響之間具有顯著性差異（p＜0.05），底物質(zhì)量分數(shù)0.1%對應(yīng)的還原糖質(zhì)量濃度大于0.25%，且其對還原糖生成量的影響差異顯著（p＜0.05）。因此，選擇底物質(zhì)量分數(shù)為0.10%，0.15%，0.20%。

圖1 底物質(zhì)量分數(shù)、酶添加量、酶解時間對蘭州百合多糖酶解后還原糖質(zhì)量濃度的影響

由圖1（b）可知，在酶解過程中，隨著酶添加量的增大，還原糖質(zhì)量濃度先增加后降低。當酶添加量增至0.4%后，還原糖質(zhì)量濃度開始陡然下降。究其原因可能是在底物固定的情況下，隨著酶的不斷加入，起初底物在同一時間被分解得更充分，當酶添加量超過一定范圍，就會達到飽和狀態(tài)，底物的分解也就趨于完全。統(tǒng)計分析顯示，酶添加量0.4%與0.3%之間對還原糖生成量的影響沒有顯著性差異（p＞0.05），但其與酶添加量0.2%和0.5%之間對還原糖質(zhì)量濃度的影響有顯著性差異（p＜0.05）。因此，選取酶添加量0.3%，0.4%，0.5%為宜。

由圖1（c）可知，酶解時間為1~3 h時，還原糖質(zhì)量濃度隨著酶解時間的增加而增加。當酶解時間超過3 h，還原糖生成量反而下降。這可能是因為酶解的時間增加到3 h時，酶的活性達到最大，此后還原糖質(zhì)量濃度因酶活性的下降而逐漸減小。相比其他酶解時間對還原糖質(zhì)量濃度的影響，酶解時間3 h對還原糖質(zhì)量濃度的影響顯著（p＜0.05）。綜合考慮，選擇酶解時間為2，3，4 h。

2.2 正交試驗結(jié)果與分析

蘭州百合多糖酶解正交試驗設(shè)計與結(jié)果見表2。

表2 蘭州百合多糖酶解正交試驗設(shè)計與結(jié)果

由表2可知，各因素對還原糖質(zhì)量濃度影響的次序為底物質(zhì)量分數(shù)（A）＞酶添加量（B）＞酶解時間（C），說明影響還原糖質(zhì)量濃度的主次順序為底物質(zhì)量分數(shù)、酶添加量、酶解時間。

方差分析結(jié)果見表3。

表3 方差分析結(jié)果

由表3可知，底物質(zhì)量分數(shù)、酶添加量和酶解時間對還原糖質(zhì)量濃度的影響均顯著（p＜0.01）。因此，3個因素A、B、C均選擇還原糖質(zhì)量濃度最大的水平，即A因素選擇A3，B因素選擇B3，C因素選擇C3。故蘭州百合多糖酶解的最佳工藝組合為A3B3C3，即底物質(zhì)量分數(shù)為0.2%，酶添加量為0.5%，酶解時間4 h，以此條件進行3次驗證試驗，還原糖質(zhì)量濃度為0.806 2±0.008 4 mg/mL。這說明優(yōu)化后的酶解工藝穩(wěn)定可靠，可以用來指導蘭州百合多糖活性片段的工業(yè)化生產(chǎn)。

2.3 抗氧化活性試驗結(jié)果

蘭州百合多糖酶解產(chǎn)物清除DPPH自由基、ABTS自由基、羥自由基和超氧自由基能力結(jié)果圖見圖2。

由圖2（a）可知，在試驗濃度范圍內(nèi)，蘭州百合多糖及其酶解產(chǎn)物對DPPH自由基的清除率隨著質(zhì)量濃度的增加而逐漸增加。當質(zhì)量濃度為4.0 mg/mL時，酶解產(chǎn)物對DPPH自由基的清除率達39.75%，該值低于同質(zhì)量濃度的維C（89.56%），但高于同質(zhì)量濃度下蘭州百合多糖對DPPH自由基的清除率（30.17%），這表明酶解還是提高了蘭州百合多糖對DPPH自由基的抑制活性。由圖2（b）可知，當質(zhì)量濃度為0~4.0 mg/mL時，蘭州百合多及其糖酶解產(chǎn)物對ABTS自由基清除率，表現(xiàn)出緩慢增加的趨勢；在質(zhì)量濃度為4.0 mg/mL時，蘭州百合多糖及其酶解產(chǎn)物對ABTS自由基的清除率分別為18.39%和16.43%，它們的清除能力遠弱于維C。但是，蘭州百合多糖及其酶解產(chǎn)物對羥自由基的清除能力均很強，且隨著質(zhì)量濃度的增加，酶解產(chǎn)物對羥自由基的清除能力逐漸接近于維C，結(jié)果見圖2（c）。當質(zhì)量濃度為0.25 mg/mL時，酶解產(chǎn)物對羥自由基的清除率已超過50%，高于同質(zhì)量濃度下維C和蘭州百合多糖對羥自由基的清除率。當質(zhì)量濃度增加至4 mg/mL時，酶解產(chǎn)物對羥基自由基的清除率達92.18%，明顯高于蘭州百合多糖對羥自由基的清除率（69.16%）。蘭州百合多糖酶解產(chǎn)物對超氧自由基的清除能力低于維C但遠高于蘭州百合多糖的清除能力，尤其是低濃度時，結(jié)果見圖2（d）。從清除曲線看，酶解提高了蘭州百合多糖對4種自由基的清除能力，尤其是對羥自由基和超氧自由基的清除能力（p＜0.05），這與Wu Q等人[21]的研究結(jié)果相似。

圖2 蘭州百合多糖酶解產(chǎn)物清除DPPH自由基、ABTS自由基、羥自由基和超氧自由基能力結(jié)果圖

3 結(jié)論

研究采用β-甘露聚糖酶對蘭州百合多糖進行酶解，在底物質(zhì)量分數(shù)、酶添加量、酶解時間3個單因素試驗考查的基礎(chǔ)上，利用L9（33）正交試驗優(yōu)化蘭州百合多糖的酶解工藝，以期獲得蘭州百合多糖的活性片段。結(jié)果表明，3個因素對還原糖質(zhì)量濃度的影響順序為底物質(zhì)量分數(shù)＞酶添加量＞酶解時間，底物質(zhì)量分數(shù)、酶添加量和酶解時間的適當增加均能顯著增加還原糖質(zhì)量濃度（p＜0.05），蘭州百合多糖酶解的最佳工藝為底物質(zhì)量分數(shù)0.2%，酶添加量0.5%，酶解時間4 h，酶解溫度50℃，酶解pH值4.8。在此條件下，蘭州百合多糖酶解后還原糖質(zhì)量濃度為0.806 2±0.008 4 mg/mL，結(jié)果穩(wěn)定、可靠，可用于指導蘭州百合多糖活性片段的制備。體外抗氧化活性評價表明，蘭州百合多糖酶解產(chǎn)物對DPPH自由基、ABTS自由基、超氧自由基和羥自由基均具有較強的清除能力，且呈質(zhì)量濃度依賴關(guān)系。尤其是對羥自由基，酶解產(chǎn)物對其清除能力明顯高于未經(jīng)酶解的蘭州百合多糖的清除能力；隨著質(zhì)量濃度的增加，酶解產(chǎn)物對羥自由基的清除能力更趨近于維C的清除能力。這可能是因為酶解不但減小了多糖的分子量，降低了其黏度，增加了其水溶性，而且使多糖的活性中心得到了充分的釋放[16，27]，具體原因有待進一步研究。研究結(jié)果為蘭州百合多糖在食品、醫(yī)藥和化妝品等領(lǐng)域的再開發(fā)利用及工藝化生產(chǎn)提供一定的理論指導。