食品微生物檢驗方法和技術(shù)研究進展

劉英語，程愛迪，吳酉芝，彭 飛

（1.上海中僑職業(yè)技術(shù)大學(xué) 食品藥品學(xué)院，上海 201514；2.南昌大學(xué) 食品學(xué)院，江西 南昌 330047；3.華南理工大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，廣東 廣州 510641）

0 引言

食品微生物檢驗是目前國內(nèi)外檢驗食品安全性的權(quán)威手段。這些年來頻發(fā)的食品安全事故，不斷降低人們對市場上食品安全的信心，其中微生物污染是食品安全中最為突出的問題[1]。判定食品中的微生物是否合乎檢驗標(biāo)準(zhǔn)是衡量食品安全度的一個關(guān)鍵方法，這也是評估被檢品能否流入市場并且安全食用的科學(xué)依據(jù)[2]。保證食品安全可以有效減少人畜中毒等事件，提升食品的價值性和保證人體健康。所以，發(fā)展微生物篩選技術(shù)是食品工業(yè)健康發(fā)展的關(guān)鍵。原料生產(chǎn)制造環(huán)境、食物種類與包裝材料和微生物類型與含量等因素對食物生產(chǎn)都有影響，可能引起食品變質(zhì)，那么從原料到成品及食品保藏等階段都應(yīng)嚴(yán)格監(jiān)控，因此國內(nèi)外學(xué)者應(yīng)該更努力以切實有效且科學(xué)的手段保障食品安全[3-6]。

1 食品微生物檢驗技術(shù)現(xiàn)狀

長期以來，食品微生物檢驗技術(shù)一直采用標(biāo)準(zhǔn)的分離純化、制劑、生化和血清分析步驟。傳統(tǒng)方法具有準(zhǔn)確可靠的優(yōu)點，但存在檢查程序時間長、所需人員專業(yè)化水平高、檢查程序多、效率低等缺點[7-8]。例如，分離純化和生化鑒定等步驟通常需要培養(yǎng)24 h以上的菌落，菌落挑選則需要具有一定專業(yè)經(jīng)驗的操作人員；另外，涉及目標(biāo)細(xì)菌的鑒定等多種生化研究。我國在2003年以前頒布的國內(nèi)食品檢驗標(biāo)準(zhǔn)幾乎都是使用上述常規(guī)檢驗程序，直到2008年后國內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)出臺，才逐漸更新檢測技術(shù)和方法。在參考和創(chuàng)新檢測標(biāo)準(zhǔn)的基礎(chǔ)上，通過對受試樣品進行了全面的質(zhì)量監(jiān)測，并根據(jù)近年來的監(jiān)測數(shù)據(jù)和可行性管理提出了一些新的篩查和PCR檢測方法，循環(huán)檢測技術(shù)也被報道用于穩(wěn)態(tài)溫度測量和基因分析方法[9]。

2 食品微生物檢測的定義及內(nèi)容

2.1 食品微生物檢測的定義

微生物檢測技術(shù)主要是基于分離培養(yǎng)技術(shù)和利用教育知識來鑒定微生物種類。通常分為2個步驟：第一步是在微生物生長時測試樣品，第二步是通過直接控制微生物性能進行生物鑒定。傳統(tǒng)的微生物診斷方法主要包括2類：指示菌培養(yǎng)法和生理生化反應(yīng)[10]。區(qū)別在于，前者要求該指示菌不能致病，并且可以快速生長，如大腸桿菌總數(shù)和腸桿菌數(shù)的測定；后者是要求標(biāo)準(zhǔn)菌株具有不同的性能癥狀，如能夠產(chǎn)生酸、堿物質(zhì)的代謝物，以及在一定溫度和環(huán)境下的代謝作用[11]。

通過分離培養(yǎng)鑒定致病菌仍然是微生物檢測的一種常用方法，但也存在明顯的缺陷：分離培養(yǎng)的過程持續(xù)時間長、頻率高、低效率和致病培養(yǎng)過程。由于細(xì)菌污染防不勝防，假如人類突然出現(xiàn)因致病菌污染而導(dǎo)致的食物中毒，傳統(tǒng)檢測技術(shù)因耗時偏長不能及時為急救醫(yī)生等提供參考信息[12]。因此，微生物篩選技術(shù)的全面系統(tǒng)性建立及迅速程序化對醫(yī)學(xué)臨床工作和公共衛(wèi)生事件具有重要的貢獻意義。

2.2 食品微生物檢測的內(nèi)容

食品微生物檢測的內(nèi)容，通常分為食物總菌落密度、大腸菌群、致病菌3個部分來進行研究。菌落總數(shù)是對需要測試的食物進行適當(dāng)處理后于固體培養(yǎng)基上每一平方單位表面積上所生長形成的菌落總數(shù)，以該項數(shù)據(jù)來反映該狀態(tài)下相關(guān)食品中微生物的性質(zhì)和數(shù)量[13-14]。而食品內(nèi)部大腸菌群的檢測，就是將該樣品放置于適合大腸菌群生活的環(huán)境中，等待適當(dāng)?shù)臅r間，測算最終的相應(yīng)數(shù)據(jù)，確定被檢測食品中大腸菌群的數(shù)量[15]。檢測人員在進行對病原菌測試后得出結(jié)論：食品中的大腸菌群數(shù)量超過正常水平，反映出食物中致病菌的存在幾率增加，會威脅食用者的健康，甚至損害食用者的健康[16]。因此，食品中微生物的系統(tǒng)性檢驗是實現(xiàn)國內(nèi)外食品安全目標(biāo)的關(guān)鍵所在，也是食品行業(yè)自我升華的決定性因素[17]。

2.2.1 對食品污染程度指示菌的檢驗

細(xì)菌總數(shù)是指在一定條件下采集和培養(yǎng)的1 mL或1 g食品和飲用水中的細(xì)菌數(shù)量，也叫菌落總數(shù)，直接反映出食品的衛(wèi)生質(zhì)量[18]。大腸菌群可作為評估食品污染程度的指示菌；它們是指一組需氧或兼性厭氧的細(xì)菌，在36±1℃下培養(yǎng)能發(fā)酵乳糖產(chǎn)生酸和氣體的革蘭氏陰性無芽孢桿菌，主要來自人和動物腸道[19]。而在評估食物和飲用水純度的過程中檢測到大腸菌群，即認(rèn)為已被糞便污染。因此，大腸菌群的存在和數(shù)量高低不僅可以判斷食品是否被糞便污染，而且也用來指示食品中腸道致病菌的存在幾率。

2.2.2 對食品中致病菌的檢測

GB 4789食品微生物學(xué)檢驗標(biāo)準(zhǔn)不斷對微生物數(shù)量的統(tǒng)計、菌落形態(tài)描述、產(chǎn)毒菌種等方面做出更新。因此，不僅要重視食品中的大腸菌群（MPN）和菌落總數(shù)的檢測；還需拓寬微生物種類檢測領(lǐng)域，主要包括志賀氏菌、金黃色葡萄球菌、產(chǎn)毒霉菌等致病菌，做到鑒定技術(shù)成熟化、檢測程序規(guī)范化[20]。

3 食品微生物檢測的技術(shù)分類

由于細(xì)菌具有生長周期短、繁殖快的特點，在食品微生物檢驗時，如果給予的培養(yǎng)基所含營養(yǎng)組分是完全正確且足夠的，培養(yǎng)的細(xì)菌則會呈線性增長。如果繼續(xù)培養(yǎng)大量細(xì)菌，細(xì)菌代謝產(chǎn)物就會出現(xiàn)，這些代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生會改變細(xì)菌培養(yǎng)環(huán)境[21]。代謝技術(shù)通俗來講是由電阻、輻射測量及代謝檢測技術(shù)組成的技術(shù)模型，該技術(shù)的依據(jù)可能是監(jiān)測微生物生長代謝物引起的分布阻力的變化[22]。目前，該研究可以用來檢測食品中大腸桿菌的存在和數(shù)量，以及獲取其他數(shù)據(jù)。上述診斷方法可以有效地測定相關(guān)細(xì)菌的數(shù)量和種類，了解食品中微生物的分布和含量，做到整體控制和分步控制。該類診斷方法在實測中得到了廣泛的應(yīng)用，這為今后的食品微生物檢測分析研究注入了信心[23]。

3.1 抗體技術(shù)

根據(jù)相關(guān)文獻研究的報道，可以得知抗體技術(shù)是將免疫檢測技術(shù)應(yīng)用于食品微生物檢測過程的一種綜合方法，這項技術(shù)的應(yīng)用原理是根據(jù)抗原和抗體的特異性結(jié)合進一步分析探究抗原的數(shù)量與性質(zhì)[24]。目前，應(yīng)用相對廣泛的抗體技術(shù)細(xì)分為：一是酶聯(lián)免疫吸附法，該項技術(shù)聯(lián)合生物酶催化反應(yīng)效率高、專一性強和抗原抗體特異性結(jié)合的優(yōu)勢，在定性和定量檢測樣品中的特異微生物中得到了廣泛的應(yīng)用。二是乳膠凝聚反應(yīng)，是指依照吸附在乳膠表面的抗原和樣品中的抗體結(jié)合后產(chǎn)生凝集的檢測技術(shù)，通過高度靈敏的反應(yīng)可以實現(xiàn)對食品中金黃色葡萄球菌的檢測。

3.2 分子生物學(xué)技術(shù)

生物技術(shù)包括2種通用技術(shù)，即聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)和基因探針技術(shù)。其中，包括對食品中微生物跡象進行深度檢測的基因工程，以及與性別有關(guān)的跡象的測序及其與微生物的有效結(jié)合，還有微生物的遺傳學(xué)研究，以及各種微生物跡象和癥狀的鑒定[25]。目前的食品檢測過程正在對分子生物技術(shù)進行深入的研究，分子生物學(xué)的檢測方法有2種：一是聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)，簡稱PCR技術(shù)，是以DNA分子作為模型進行縮放，并使用一對分別與模板互補的寡核苷酸片段作為基礎(chǔ)模型的補充。在DNA聚合酶的作用下，沿著模板線延伸，直至形成新的DNA鏈；二是核酸探針檢測技術(shù)，根據(jù)被標(biāo)記的核酸序列與目的基因雜交的規(guī)則，可快速檢測食品中的病原微生物[26]。

3.3 儀器技術(shù)

目前，鑒于食品種類的復(fù)雜化和檢測標(biāo)準(zhǔn)的提高（如痕檢），在實際測試過程中，相應(yīng)的儀器技術(shù)也將由簡單設(shè)備跨向復(fù)雜精密型檢測設(shè)備，如光譜類、色譜類、致病菌微生物檢測儀或多種設(shè)備聯(lián)用[27]。食品檢測儀器設(shè)備在食品檢測中的應(yīng)用分析。該類分析方法具有更高的精密度可以保證分析結(jié)果的準(zhǔn)確性，還可以節(jié)約人力物力，以降低研究成本。儀器設(shè)備是保證食品檢測順利進行的先決條件，有利于保障食品微生物檢測方法的嚴(yán)格化、全面化發(fā)展，這將是未來發(fā)展的方向。但在儀器設(shè)備研發(fā)創(chuàng)新和實際應(yīng)用的整個過程中仍有很多研究需要學(xué)者的討論和進一步的深化[28]。

3.4 快速檢測技術(shù)

快速檢測是指在較短的檢測時間內(nèi)，利用較為簡便的儀器設(shè)備即可反饋準(zhǔn)確可靠的測試結(jié)果的行為[29]。食品快速檢測相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)法規(guī)研究進展包括樣品制備過程，通常認(rèn)為可以在2 h內(nèi)完成分析的化學(xué)和物理分析方法是一種快速檢測方法[30]。與傳統(tǒng)的標(biāo)準(zhǔn)方法相比，當(dāng)前食品微生物測試方法的分析周期可以減少1/2或1/3，可以認(rèn)為是一種快速反應(yīng)方法，而快速現(xiàn)場測試通常會在30 min內(nèi)得出測試結(jié)果。

4 食品微生物檢驗技術(shù)的發(fā)展趨勢

隨著醫(yī)學(xué)技術(shù)和衛(wèi)生事業(yè)的發(fā)展，食品微生物檢驗技術(shù)在科技的推動下迅速衍化。食品微生物檢驗技術(shù)正在從傳統(tǒng)培養(yǎng)階段向分子階段轉(zhuǎn)變，即食品微生物檢驗技術(shù)越來越科技化。高精尖的組合技術(shù)將是微生物檢測機構(gòu)最具發(fā)展力的技術(shù)，這也是對檢驗結(jié)果準(zhǔn)確性和科學(xué)性的保障[31]。

同時，未來檢驗技術(shù)發(fā)展必將集中于監(jiān)測設(shè)備的工具化和自主性，以及檢驗結(jié)果的準(zhǔn)確性和時效性。另外，無論是從提高檢驗有效性和節(jié)約成本的角度考慮，還是從檢驗結(jié)果的準(zhǔn)確性分析，人工試驗和推導(dǎo)占據(jù)主體地位的檢測必然會被自動化的儀器設(shè)備檢測所取代；對測試結(jié)果的準(zhǔn)確性和有效性的追求是所有技術(shù)的終點，同時技術(shù)發(fā)展和工具的自主性無非是為了達到更準(zhǔn)確有效的測試結(jié)果的目的[32]。

4.1 基于傳統(tǒng)微生物檢測技術(shù)上的改進

對培養(yǎng)基成分進行改良，提高其特異性富集或改善分離效果，如沙門氏菌的膠體金快速檢測試劑條等；對培養(yǎng)基的使用進行便利性的改進，集成的生化識別試劑條和儀器自動化技術(shù)等試劑的研發(fā)使檢測便利性得到提高，還能將傳統(tǒng)檢驗中比較繁瑣的試驗操作通過儀器實現(xiàn)自動化完成[33]。

4.2 免疫學(xué)快速篩選方法

由于免疫學(xué)反應(yīng)具有快速，靈敏和特異的特點，因此可以用于目標(biāo)生物的快速篩選，如快速檢測試紙條[34-35]。該類方法在實測中不僅操作簡便快速而且檢測靈敏度更高，適合現(xiàn)場快速檢測。免疫磁場的處理通過免疫來對目標(biāo)微生物的集中以增加標(biāo)準(zhǔn)方法的靈敏度，并且還能篩選進行與自身酶有關(guān)的熒光掃描，完成自身免疫裝置的掃描并達到自動生成的目的[36-38]。

4.3 基于核酸擴增的分子診測技術(shù)

近年來，隨著分子生物技術(shù)的發(fā)展，基于核酸分析的微生物檢測技術(shù)和方法也不斷吐故納新，最常用的方法是熒光PCR和定量PCR，此外還有環(huán)介導(dǎo)恒溫擴增法和依賴核酸序列的擴增技術(shù)（NASBA）法[39-40]。這類方法首先需要確定目標(biāo)生物保留的核酸序列，設(shè)計特定的堿基排列并訪問核細(xì)胞數(shù)據(jù)系統(tǒng)，然后通過成像系統(tǒng)的核酸快速激活，使得核酸數(shù)量迅速增加，從而可以檢測到片段，優(yōu)點是可以在短時間內(nèi)增加核酸片段的數(shù)量，從而可以掃描目標(biāo)生物，此后在PCR技術(shù)的基礎(chǔ)上發(fā)展多重PCR技術(shù)，即為多個目標(biāo)微生物的核酸序列設(shè)計幾個引物，然后同時破壞多種目標(biāo)生物的核酸，最終結(jié)果可以通過瓊脂糖凝膠電泳、毛細(xì)管電泳、基因芯片雜交等技術(shù)進行食品微生物分析[41-42]。

5 結(jié)語

保證準(zhǔn)確可靠的檢測結(jié)果和規(guī)定準(zhǔn)確有效的檢測方法對食品進行微生物鑒定分析，能夠為食品的安全性和完整性提供技術(shù)支持。雖然，我國目前的微生物檢測技術(shù)比較先進，取得了良好的實驗室效果，但時效和技術(shù)進步必然要回歸到更有利的檢測方法上。這意味著需要繼續(xù)對食品微生物檢測技術(shù)進行探究，以確保食品安全性隱患能夠及時察覺并得到有效解決。

總之，人類健康與食物供應(yīng)有著直接而深遠(yuǎn)的聯(lián)系。希望能夠提供嚴(yán)謹(jǐn)可靠的食品安全指標(biāo)，以確保所有食品檢測的科學(xué)相關(guān)性。近年來，國內(nèi)外相關(guān)人員越來越意識到微生物食品需要準(zhǔn)確跟蹤相應(yīng)的檢測方法和檢測規(guī)則的重要性，因此檢驗員必須嚴(yán)格遵守專業(yè)標(biāo)準(zhǔn)，不斷學(xué)習(xí)、不斷開發(fā)和完善檢測技術(shù)。