響應(yīng)面法優(yōu)化克氏原螯蝦蝦頭酶解工藝研究

燕瑜翰，盧靜靜

（1.武漢設(shè)計(jì)工程學(xué)院食品與生物科技學(xué)院，湖北 武漢 430205；2.江蘇大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，江蘇 鎮(zhèn)江 212023）

0 引言

克氏原螯蝦因其味道鮮美、蛋白質(zhì)含量豐富、營養(yǎng)價(jià)值高、烹飪方式多樣，受到廣大消費(fèi)者的青睞。在克氏原螯蝦加工和消費(fèi)過程中，產(chǎn)生了大量的蝦頭、蝦殼等副產(chǎn)廢棄物，目前常見的處理方法是將蝦頭等廢棄物粉碎后與魚粉混合加工飼料，但其附加值較低[1]。

蝦頭富含蛋白質(zhì)、脂肪酸及風(fēng)味物質(zhì)，作為副產(chǎn)廢棄物之一，其回收加工再利用研究備受關(guān)注，以蝦頭為原料加工開發(fā)水產(chǎn)調(diào)味品，成為目前的研究熱點(diǎn)。解萬翠等人[2]以南美白對蝦蝦頭酶解蛋白粉為原料，加工開發(fā)得到蝦味濃郁的蝦風(fēng)味料。任艷艷等人[3]以中國對蝦蝦頭為原料，利用木瓜蛋白酶和風(fēng)味蛋白酶進(jìn)行復(fù)合酶解，對酶解液進(jìn)行處理，得到香味濃郁的蝦調(diào)味料。鄭捷等人[4]采用風(fēng)味蛋白酶和堿性蛋白酶復(fù)合酶法對蝦下腳料進(jìn)行酶解，以酶解液為原料處理后，進(jìn)行調(diào)配，得到香味濃郁、蝦味鮮美的復(fù)合調(diào)味料。另外，湯丹劍等人[5]、徐坤華等人[6]分別以哈氏仿對蝦蝦頭、中華管鞭蝦蝦頭為原料，進(jìn)行研究，制備蝦味調(diào)味料。但關(guān)于克氏原螯蝦蝦頭利用的研究報(bào)道較少，因此試驗(yàn)以克氏原螯蝦蝦頭為原料，利用堿性蛋白酶進(jìn)行水解，并對酶解工藝進(jìn)行了優(yōu)化，為蝦頭副產(chǎn)物綜合利用提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

克氏原螯蝦蝦頭，購自農(nóng)貿(mào)市場；堿性蛋白酶，安徽天悅生物科技有限公司提供；水合茚三酮、磷酸二氫鈉、磷酸二氫鉀等，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司提供。

1.2 儀器與設(shè)備

AL104型分析天平、722型可見分光光度計(jì)，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司產(chǎn)品；TG-16WS型高速離心機(jī)，長沙湘智離心機(jī)儀器有限公司產(chǎn)品；UV-2800型紫外分光光度計(jì)，上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 克氏原螯蝦蝦頭酶解條件優(yōu)化

蝦頭解凍后洗凈，加水粉碎磨漿，取蝦頭漿于錐形瓶中，按料液比（1∶0.5，1∶1.0，1∶2.0，1∶3.0，1∶4.0）加水混勻，調(diào)溶液pH值為（6.0，7.0，8.0，9.0，10.0），加入堿性蛋白酶（500，1 000，1 500，2 000，2 500，3 000 U/g），在適當(dāng)?shù)臏囟认拢?0，50，60，70，80℃），酶解（2.0，2.5，3.0，3.5，4.0 h）后，沸水浴10 min滅酶，然后以轉(zhuǎn)速4 500 r/min離心10 min，取上清液測游離氨基酸含量，計(jì)算水解度，研究酶解條件對酶解效果的影響[1]。在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，應(yīng)用Design Expert軟件設(shè)計(jì)響應(yīng)面試驗(yàn)，以水解度為響應(yīng)值進(jìn)行優(yōu)化。

1.3.2 酶解液水解度測定

（1）游離氨基酸含量測定[7]。采用茚三酮比色法，準(zhǔn)確吸取200 μg/mL的異亮氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液0，0.5，1.0，1.5，2.0，2.5，3.0 mL，置于25 mL容量瓶中，加水定容至4.0 mL，加入緩沖溶液1 mL，混勻后水浴加熱15 min，冷卻至室溫，定容搖勻。靜置15 min，于波長570 nm處測吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線Y=0.001 1X+0.075 1。

（2）蛋白質(zhì)含量的測定參考凱氏定氮法GB 5009.5—2016。

2 結(jié)果與分析

2.1 底物料液比對蝦頭酶解效果的影響

料液比對蝦頭酶解效果的影響見圖1。

圖1 料液比對蝦頭酶解效果的影響

由圖1可知，隨著體系溶劑量的增大，底物濃度逐漸減小，蝦頭水解度先上升后下降，在料液比為1∶1（g∶mL）時(shí)，體系水解度達(dá)到最大，隨后水解度開始下降，可能是由于底物濃度降低，不利于堿性蛋白酶與蛋白質(zhì)的結(jié)合[8]，因此當(dāng)料液比為1∶1時(shí)酶解效果最好。

2.2 酶用量對蝦頭酶解效果的影響

酶用量對蝦頭酶解效果的影響見圖2。

圖2 酶用量對蝦頭酶解效果的影響

由圖2可知，隨著堿性蛋白酶用量的增大，水解度呈現(xiàn)先增大后趨于穩(wěn)定的趨勢。酶用量由500 U/g增大至1 500 U/g，底物水解度由8.74%升高至20.44%，達(dá)到最大值，可能是在一定范圍內(nèi)，隨著酶用量的增大，酶濃度增加，酶與底物蛋白的結(jié)合位點(diǎn)逐漸增多，酶解效果不斷增強(qiáng)，達(dá)到一定濃度，酶與蛋白的結(jié)合位點(diǎn)達(dá)到飽和，水解度達(dá)到最大，而后繼續(xù)增加酶用量，但由于底物濃度固定，水解度基本保持穩(wěn)定，酶解效果變化不大。因此酶用量為2 000 U/g時(shí)，蝦頭酶解效果最好。

2.3 酶解pH值對蝦頭酶解效果的影響

酶解pH值對蝦頭酶解效果的影響見圖3。

圖3 酶解pH值對蝦頭酶解效果的影響

由圖3可知，隨著pH值的增大，水解度呈先升高后下降的趨勢，當(dāng)pH值由6.0增至9.0，底物水解度由5.55%增至22.3%，繼續(xù)增大pH值至10.0，水解度開始下降。原因在于酶的活性受pH值的影響，在酶最適pH值時(shí)酶的活性最大，此時(shí)酶解效果最好，試驗(yàn)所用堿性蛋白酶的最適pH值可能是9.0，此時(shí)體系內(nèi)生成的游離氨基氮含量最大，水解度最高。所以，當(dāng)初始pH值為9.0時(shí)，酶解效果最好。

2.4 酶解時(shí)間對蝦頭酶解效果的影響

酶解時(shí)間對蝦頭酶解效果的影響見圖4。

由圖4可知，隨著酶解時(shí)間由2 h增加至3 h，蝦頭水解度顯著增加，由9.63%增至22.57%，但反應(yīng)至3 h后，水解度基本趨于平穩(wěn)，不再有顯著變化?？赡苁怯捎诿概c底物結(jié)合需要一定的時(shí)間，隨著反應(yīng)時(shí)間的延長，底物與酶活性位點(diǎn)逐漸結(jié)合，酶解程度逐漸增大，當(dāng)?shù)孜锏鞍着c酶活性位點(diǎn)完全結(jié)合時(shí)，水解度增至最大，繼續(xù)延長反應(yīng)時(shí)間，無多余的酶活位點(diǎn)參與反應(yīng)，水解程度不再增加。因此，當(dāng)酶解3 h時(shí)，酶解效果最好。

圖4 酶解時(shí)間對蝦頭酶解效果的影響

2.5 酶解溫度對蝦頭酶解效果的影響

酶解溫度對蝦頭酶解效果的影響見圖5。

圖5 酶解溫度對蝦頭酶解效果的影響

由圖5可知，隨著酶解溫度的升高，水解度呈先增大后減小的趨勢，60℃時(shí)，水解度最大?？赡苡捎陔S著溫度的升高，酶活性逐漸增大，加速酶與蛋白質(zhì)之間的酶解反應(yīng)速率，達(dá)到酶最適溫度60℃時(shí)，酶活最大，酶解效果最好，體系水解度最大，繼續(xù)升溫，溫度過高會(huì)抑制蛋白酶的活性甚至失活，影響酶解反應(yīng)的速率，導(dǎo)致水解度降低。因此，當(dāng)酶解溫度為60℃時(shí)，酶解效果最好。

2.6 響應(yīng)面優(yōu)化蝦頭酶解試驗(yàn)

響應(yīng)面設(shè)計(jì)方案及分析結(jié)果見表1，方差分析結(jié)果見表2。

表1 響應(yīng)面設(shè)計(jì)方案及分析結(jié)果

由表2可知，模型p＜0.000 1表明回歸方程達(dá)到極顯著水平；相關(guān)系數(shù)R2=0.937 6，校正決定系數(shù)R2Adj=0.952 5，說明該模型可靠，可用于克氏原螯蝦蝦頭酶解條件的分析和預(yù)測。

表2 方差分析結(jié)果

通過對二次多元回歸模型進(jìn)行優(yōu)化處理，得到最優(yōu)酶解條件為料液比1∶1.2，初始pH值8.92，酶解時(shí)間3.11 h，酶解溫度60.66℃，得到酶解液水解度為24.89%。為驗(yàn)證該條件的可靠性，重復(fù)3次進(jìn)行試驗(yàn)，得到酶解液水解度為25.31%，與理論值的相對誤差為1.7%，說明該模型與實(shí)際情況擬合較好，結(jié)果可靠。

3 結(jié)論

以克氏原鰲蝦蝦頭為原料，采用堿性蛋白酶酶解制備酶解液，通過單因素試驗(yàn)及響應(yīng)面法確定最佳酶解條件為堿性蛋白酶添加量2 000 U/g，料液比1∶1.2，初始pH值8.92，酶解時(shí)間3.11 h，溫度60.66℃，該條件下水解度25.31%。