一株異養(yǎng)硝化菌的篩選鑒定及其在農(nóng)村養(yǎng)殖廢水處理中的應(yīng)用

利 勇，代群威,2，王維富，鄧信爽，趙玉連，王 宇

（1.西南科技大學(xué)環(huán)境與資源學(xué)院，四川 綿陽 621010；2.西南科技大學(xué)核廢物與環(huán)境安全國防重點(diǎn)學(xué)科實(shí)驗(yàn)室，四川 綿陽 621010；3.西南科技大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，四川 綿陽 621010）

【研究意義】隨著我國居民生活水平的提升，居民對肉類產(chǎn)品需求增加，促進(jìn)畜禽業(yè)發(fā)展。畜禽養(yǎng)殖業(yè)集約化發(fā)展的同時(shí)，也產(chǎn)生大量養(yǎng)殖廢水［1］，我國養(yǎng)豬場每年產(chǎn)生1.6 億t 的養(yǎng)豬廢水［2］。養(yǎng)豬廢水成分復(fù)雜，一般含有豐富的有機(jī)物、高濃度NH4+-N、懸浮固體等成分，養(yǎng)豬廢水中的大量含氮污染物直接排放會(huì)造成嚴(yán)重的水體污染和富營養(yǎng)化，威脅周邊居民的用水安全［3-4］。因此，為滿足廢水排放標(biāo)準(zhǔn)，會(huì)采用一些生物、物理或化學(xué)方法來降低污染物濃度，其中生物法通過好氧或厭氧微生物構(gòu)建工藝，具有操作簡單、脫氮高效、環(huán)境友好等優(yōu)點(diǎn)［5］。【前人研究進(jìn)展】傳統(tǒng)的生物脫氮技術(shù)通過自養(yǎng)硝化菌和厭氧反硝化菌將含氮有機(jī)物-氨化-硝化-反硝化成N2達(dá)到去除氮的目的［6］。傳統(tǒng)工藝分為好氧和厭氧兩段，且自養(yǎng)硝化菌的生長速度緩慢，需要較長的啟動(dòng)時(shí)間，從而無法廣泛應(yīng)用［7］。近年來，異養(yǎng)硝化細(xì)菌因其生長速度快、適應(yīng)能力強(qiáng)而受到越來越多的關(guān)注，異養(yǎng)硝化細(xì)菌可以在高濃度NH4+-N 和有機(jī)物下生長，并利用廢水中的有機(jī)物作為能源進(jìn)行異養(yǎng)硝化的同時(shí)降低有機(jī)物和氨氮濃度［8］。與自養(yǎng)型硝化細(xì)菌比較，異養(yǎng)硝化細(xì)菌生長速率更快且適應(yīng)能力更強(qiáng)［9］，關(guān)于異養(yǎng)硝化菌的研究已經(jīng)逐漸成為研究熱點(diǎn)。目前發(fā)現(xiàn)的異養(yǎng)硝化菌主要包括假單胞菌屬（Pseudomonassp.）、不動(dòng)桿菌屬（Acinetobactersp.）、芽孢桿菌屬（Bacillussp.）等［10］?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】關(guān)于異養(yǎng)硝化細(xì)菌的應(yīng)用研究主要集中于低濃度NH4+-N 廢水，因此有必要尋找高效的異養(yǎng)硝化細(xì)菌來處理高濃度NH4+-N 的廢水，如其在養(yǎng)殖廢水中的實(shí)際應(yīng)用，此外異養(yǎng)硝化菌在未滅菌處理的實(shí)際廢水中的研究也較少［11］?！緮M解決的關(guān)鍵問題】本研究從某湖泊底泥中富集、分離鑒定出能有效去除NH4+-N 的異養(yǎng)硝化菌，研究其異養(yǎng)硝化和好氧反硝化能力，以及在不同接種比例、碳源、pH、溫度、C/N、初始氨氮濃度條件下對菌株脫氮特性的影響，再以農(nóng)村養(yǎng)殖戶污水池中的養(yǎng)豬廢水為試驗(yàn)對象，將該異養(yǎng)硝化菌用于養(yǎng)豬廢水處理，探究其在高濃度氨氮廢水中的異養(yǎng)硝化能力與處理養(yǎng)豬廢水的可行性。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

篩選樣品于2021 年12 月采自某淺水湖泊的底泥，取樣后馬上進(jìn)行菌株篩選；養(yǎng)豬廢水于2022 年5 月采自綿陽市某農(nóng)村小型養(yǎng)殖戶的污水池，保存于聚乙烯瓶中，取樣后第2 天用于試驗(yàn)。后續(xù)試驗(yàn)于2022 年在西南科技大學(xué)實(shí)驗(yàn)室內(nèi)進(jìn)行。

異養(yǎng)硝化培養(yǎng)基：硫酸銨0.47 g/L、二水合檸檬酸鈉4.08 g/L、50 mL 維氏鹽溶液，pH 值為7.0～7.2。硝酸鹽培養(yǎng)基：硝酸鉀0.722 g/L、二水合檸檬酸鈉4.08 g/L、50 mL 維氏鹽溶液，pH 值為7.0～7.2。亞硝酸鹽培養(yǎng)基：亞硝酸鈉0.49 g/L、二水合檸檬酸鈉4.08 g/L、50 mL 維氏鹽溶液，pH值為7.0～7.2。維氏鹽溶液：磷酸氫二鉀5.0 g/L、七水合硫酸鎂2.5 g/L、氯化鈉2.5 g/L、四水合硫酸錳0.05 g/L、七水合硫酸亞鐵0.05 g/L。固體培養(yǎng)基需加入2%的瓊脂粉，培養(yǎng)基均高溫高壓滅菌（121 ℃、30 min）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 菌株的分離與鑒定 取3 份適量樣品分別置于20 mL 0.9%生理鹽水中，混勻后靜置，取2 mL上清液接種到異養(yǎng)硝化液體培養(yǎng)基，富集3 d，選擇變渾濁的培養(yǎng)基進(jìn)行后續(xù)研究。

取富集菌液進(jìn)行梯度稀釋，選擇10-5、10-6、10-7梯度進(jìn)行平板涂布，置于30℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。待長出菌落，挑選不同形態(tài)菌落進(jìn)行平板劃線純化2～3 次。將純化后的不同菌株接種至異養(yǎng)硝化液體培養(yǎng)基中，在30 ℃、120 r/min 搖床中培養(yǎng)48 h 后將培養(yǎng)液在8 000 r/min、3 min 條件下離心，取上清液檢測NH4+-N 濃度，對比不同菌株的氨氮去除率，選擇效果最好的菌株進(jìn)行后續(xù)研究。

觀察菌株在平板上菌落的特征，并進(jìn)行革蘭氏染色，委托天津諾禾致源生物信息科技有限公司測序。測序結(jié)果同Blast 數(shù)據(jù)庫中細(xì)菌的16SrDNA 進(jìn)行同源性分析，用MEGA7.0 構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.2 菌株的異養(yǎng)硝化性能 將活化的菌液以2%接種比接種于異養(yǎng)硝化培養(yǎng)基中，設(shè)空白對照，在30 ℃、130 r/min 條件下恒溫培養(yǎng)。每隔4 h 取樣，測定培養(yǎng)基中菌體的細(xì)胞密度OD600的數(shù)值，同時(shí)取樣離心，測定上清液NH4+-N、NO-3-N、NO-2-N 的濃度變化。

1.2.3 菌株的好氧反硝化性能 將活化的菌液以2%接種比分別接種于硝酸鹽培養(yǎng)基和亞硝酸鹽培養(yǎng)基中，設(shè)置空白對照，在30 ℃、120 r/min條件下培養(yǎng)。每隔4 h 取樣，測定OD600和離心測定上清液NO-3-N、NO-2-N 濃度。

1.2.4 菌株的脫氮特性 測定菌液接種量、碳源、pH、溫度、C/N、初始NH4+-N 濃度等單因素對菌株的脫氮特性的影響。菌液接種量為0%、2%、4%、7%、10%的不同接種比例；碳源包括丁二酸鈉、乙酸鈉、檸檬酸鈉、葡萄糖；pH 為6、7、8、9、10；溫度為15、20、25、30、35 ℃；C/N 為2、6、10、15、20；初始NH4+-N 濃度為50、100、200、400、800 mg/L。固定單一因素，其余條件保持不變，將活化的菌液接種于100 mL 異養(yǎng)硝化培養(yǎng)基中，設(shè)置空白對照，在搖床中培養(yǎng)48 h 后，測定NH4+-N 濃度和OD600。

1.2.5 菌株在農(nóng)村養(yǎng)殖廢水中的應(yīng)用 在錐形瓶中進(jìn)行簡單振蕩試驗(yàn)，研究菌株在實(shí)際養(yǎng)豬廢水中的異養(yǎng)硝化能力。從綿陽農(nóng)村某養(yǎng)殖戶的污水池中采集養(yǎng)豬廢水，用棉網(wǎng)過濾水中浮渣，不做滅菌處理，其初始NH4+-N 濃度為1 048 mg/L，用自來水稀釋廢水得到不同濃度NH4+-N 廢水（500、1 000 mg/L）用于試驗(yàn)。檸檬酸鈉用于將廢水C/N比率調(diào)整為約10，將3 mL 活化的菌液接種至150 mL 養(yǎng)豬廢水中（試驗(yàn)組），然后在30 ℃、130 r/min 下培養(yǎng)。以相同條件下不加異養(yǎng)硝化細(xì)菌的養(yǎng)豬廢水作為空白對照，每隔12 h 取樣測試其NH4+-N、TN、NO3--N、NO2--N 的濃度。

式中，C空白為空白對照中NH4+-N 濃度，C樣品為試驗(yàn)組中不同時(shí)間的NH4+-N 濃度，NO3--N 去除率、NO2--N 去除率計(jì)算方法與上式相同。

1.3 測定指標(biāo)及方法

樣品在測定前經(jīng)離心處理，取上清液測定。NH4+-N 采用納氏試劑分光光度法（HJ 535-2009）；NO3--N 采用紫外分光光度法（HJ/T 346-2007）；NO2--N 采用鹽酸萘乙二胺檢測法（GB 7493-87）；TN 采用堿性過硫酸鉀消解紫外分光光度法（GB 11894—89）；菌體生長量以在波長600 nm 的吸光度表征，采用可見分光光度計(jì)（WFJ-2100 型，尤尼柯儀器有限公司）進(jìn)行測定。

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Excel 2021 進(jìn)行計(jì)算，使用Origin 2018 繪制數(shù)據(jù)圖進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株的篩選與鑒定

供試湖底泥經(jīng)分離篩選得到11 株細(xì)菌，其中1 株NH4+-N 去除率最大、為91.8%，命名為L-1，菌株L-1 屬于革蘭氏陰性菌，菌落呈乳白色、不透明、表面光滑。細(xì)胞呈短桿狀，大小為0.7～0.9 μm×0.4～0.5 μm，電鏡掃描圖像見圖1。L-1的16SrDNA 序列（1 415 bp）在Blast 數(shù)據(jù)庫中檢索，發(fā)現(xiàn)L-1 與多株Acinetobactersp.同源性在99%以上。通過MEGA7.0 構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，如圖2 所示，菌株L-1 與Acinetobacter_sp._bB11(2011)聚為一支，鑒定菌株L-1 為不動(dòng)桿菌屬（Acinetobactersp.）。

圖1 菌株L-1 的電鏡掃描圖像Fig.1 Scanning electron micrographs of strain L-1

圖2 菌株L-1 的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Phylogenetic tree of strain L-1

2.2 菌株L-1 的異養(yǎng)硝化性能

以NH4+-N 為唯一氮源，菌株生長情況與氮素變化如圖3 所示，菌株L-1 在4 h 進(jìn)入對數(shù)生長期，20 h 到達(dá)穩(wěn)定期，OD600達(dá)到最高值1.523，其中NH4+-N 的去除過程主要處于對數(shù)生長期，NH4+-N 濃度由100.75 mg/L 降至7.54 mg/L，NH4+-N 去除率達(dá)到92.52%，說明菌株能有效以NH4+-N 為唯一氮源進(jìn)行異養(yǎng)硝化。在NH4+-N 硝化過程中有少量NO3--N 和微量NO2--N 累積，在52 h 時(shí)NO3--N 只有0.04 mg/L，這與蒙小俊［12］、雷強(qiáng)等［13］研究相似，在硝化過程中產(chǎn)生NO3--N，隨后濃度逐漸降低，可能與L-1 的脫氮途徑相關(guān)。

圖3 NH4+-N 為氮源時(shí)菌株L-1 的生長曲線和脫氮特性Fig.3 Growth curve and denitrification characteristics of strain L-1 with NH4+-N as nitrogen source

2.3 菌株L-1 的好氧反硝化性能

由圖4A 可知，菌株L-1 以NO3--N 作為唯一氮源時(shí)，在前24 h，菌株生長快速，OD600達(dá)到0.75，同時(shí)NO3--N 濃度快速降低，去除率達(dá)到75.61%，平均去除速率為3.13 mg/（L·h），反硝化過程中有少量NO2--N 累積，其濃度先升后降，累積量不超過0.9 mg/L。由圖4B 可知，以NO2--N 作為唯一氮源時(shí)，與NO-3-N 為氮源時(shí)不同，其達(dá)到穩(wěn)定期時(shí)間延長，生物量最大為0.49，說明高濃度NO2--N 會(huì)抑制了微生物的生長，但菌株仍能利用NO2--N，最終NO2--N 去除率為83.23%。

圖4 以NO3--N、NO2--N 為氮源時(shí)菌株L-1 的生長曲線和脫氮特性Fig.4 Growth curve and denitrification characteristics of strain L-1 with NO3--N and NO2--N as nitrogen sources

2.4 環(huán)境因素對菌株L-1 脫氮的影響

由于培養(yǎng)基中的營養(yǎng)物質(zhì)有限，不同的接種量影響微生物的生長速度，進(jìn)而影響微生物的硝化性能。從圖5A 可以看出，不同的接種量下各處理OD600和NH4+-N 濃度均發(fā)生不同變化，其中，2%的接種比的培養(yǎng)基中菌株生長狀況最好，在48 h 后，OD600達(dá)到1.056，NH4+-N 去除率達(dá)到86.68%，具體為OD600-2%＞OD600-4%≈OD600-7%＞OD600-10%。

圖5 不同環(huán)境條件對菌株L-1 異養(yǎng)硝化的影響Fig.5 Effects of different environmental conditions on heterotrophic nitrification of strain L-1

環(huán)境中pH 或溫度的變化，微生物的酶活性都會(huì)受到影響，當(dāng)pH 和溫度過高或過低，硝化細(xì)菌生長都會(huì)受到抑制［14］。如圖5B 所示，當(dāng)pH 為6、7、8、9 時(shí)，NH4+-N 去除率均在90%以上，OD600均在1.3 以上，說明弱酸、中性、弱堿條件下，L-1 均能正常生長并進(jìn)行異養(yǎng)硝化。其中pH 為9 時(shí)，菌株生長量最好，NH4+-N 去除率達(dá)到95.68%，而pH 升高到10 時(shí)，OD600沒有增長，說明L-1 在過堿性條件下生長完全受到抑制［15］。如圖5C 所示，在15 ℃條件下，菌株生長速度緩慢，幾乎停滯，NH4+-N 去除率僅為5.36%，20、25、30 ℃下菌株L-1 生長迅速，48 h 后OD600分別達(dá)到1.313、1.230 和1.161，其中20 ℃下NH4+-N 去除率最高、達(dá)到91.99%；但當(dāng)溫度繼續(xù)升高至35 ℃時(shí)，OD600降低至0.634，脫氮效果降到66.49%，說明L-1 的適宜溫度為20～30 ℃。

C/N 比直接影響硝化細(xì)菌生長，如圖5D 所示，C/N 為10、15、20 時(shí)，OD600均大于1.0，NH4+-N去除率均在88% 以上，最高達(dá)到95.78%；C/N 降低為6 時(shí)，NH4+-N 去除率和OD600分別為72.46%、1.052；當(dāng)C/N 為2 時(shí)，L-1 生長緩慢，NH4+-N 去除率僅有31.03%，說明低C/N 條件下菌株的生長和硝化作用受到抑制［16］。菌株L-1的適宜C/N 范圍為10～20。

菌株對不同碳源的利用能力如圖5E 所示，L-1 以檸檬酸鈉作為碳源時(shí)，NH4+-N 去除率和生長情況最好，去除率達(dá)到90.16%，OD600達(dá)到最大1.269；以丁二酸鈉、乙酸鈉為碳源時(shí)NH4+-N去除率分別為69.09%和68.79%；而以葡萄糖為碳源時(shí)，L-1 生長情況最差，相應(yīng)地除氨效果也較差，去除率僅為6.77%。

菌株L-1 在不同初始NH4+-N 濃度中的生長與硝化效率如圖5F 所示，初始NH4+-N 濃度在50～800 mg/L 時(shí)，L-1 均能生長。因?yàn)镹H4+-N既是污染物又是營養(yǎng)物質(zhì)，故NH4+-N 濃度在50 mg/L 時(shí)，NH4+-N 去除率最高為94.59%，OD600為0.727；當(dāng)NH4+-N 濃度上升到為100、200 mg/L時(shí)，NH4+-N 去除率開始下降，分別為86.18%、46.34%；NH4+-N 濃度繼續(xù)上升到400、800 mg/L時(shí)，此時(shí)NH4+-N 去除率大幅下降，分別為23.71%、16.53%。

2.5 菌株L-1 在農(nóng)村養(yǎng)豬廢水中的脫氮效果

如圖6A 所示，在空白對照中，NH4+-N 濃度有緩慢下降趨勢，可能是養(yǎng)豬廢水未做滅菌處理，其中存在脫氮菌，但其效果一般。加入菌液后，NH4+-N 去除效果顯著提升，在NH4+-N 濃度為1 000 mg/L、處理96 h 后，NH4+-N 濃度降至298.46 mg/L，去除率為70.15%，比未添加菌液的空白對照高45.78%。如圖6B 所示，在1 000 mg/L廢水中，加入菌液后不僅去除大量NH4+-N，同時(shí)去除80.21%的NO3--N 和60.53%的NO2--N，說明在廢液中菌株L-1 進(jìn)行了異養(yǎng)硝化和好氧反硝化。

圖6 菌株L-1 對養(yǎng)豬廢水的處理效果Fig.6 Effect of strain L-1 on the treatment of pig wastewater

3 討論

3.1 菌株L-1 的異養(yǎng)硝化和好氧反硝化性能

本試驗(yàn)篩選出一株異養(yǎng)硝化-好氧反硝化細(xì)菌L-1，鑒定為不動(dòng)桿菌。菌株L-1 能利用NO3--N 和NO2--N 作為氮源進(jìn)行生長，說明L-1 能進(jìn)行反硝化作用，這與Acinetobacter pittiiSY9［17］、PseudomonasHNM-4［18］等異養(yǎng)硝化-好氧反硝化菌結(jié)果相似。研究菌株L-1 異養(yǎng)硝化和好氧反硝化性能發(fā)現(xiàn)，去除氮素與菌株生長量呈正相關(guān)，但不同氮源中的菌株生長量不同，其中NH4+-N＞NO3--N＞NO2--N，這與AHP123［19］在不同氮源中的生長情況相似。由上推測菌株L-1的反硝化途徑屬于傳統(tǒng)反硝化途徑。

3.2 菌株L-1 不同條件下的脫氮特性

異養(yǎng)硝化細(xì)菌的硝化性能受多個(gè)環(huán)境因素影響，本試驗(yàn)主要研究了接種比、pH、溫度、C/N 比、碳源、初始NH4+-N 濃度6 個(gè)因素對L-1 的生長與硝化性能的影響。微生物生長需要適宜的pH，過高過低都會(huì)影響到酶活性，pH 對微生物絮團(tuán)的NH4+-N 轉(zhuǎn)化效率和絮團(tuán)細(xì)菌活性均有影響［14］。試驗(yàn)得出菌株L-1 的適應(yīng)pH 范圍在6～9，與梁賢等［20］研究結(jié)果相似。溫度也是影響細(xì)菌生長的因素之一，溫度從20 ℃上升到35 ℃時(shí)，L-1的OD600逐漸下降，硝化性能減弱，因此在實(shí)際應(yīng)用時(shí)，應(yīng)考慮pH 和溫度對硝化細(xì)菌的影響。

鄭冰冰等［21］研究不同C/N 對處理養(yǎng)殖廢水的影響時(shí)，發(fā)現(xiàn)低C/N 下，碳源不足會(huì)影響微生物生長，導(dǎo)致脫氮效果較差，選擇適宜的C/N有利于微生物快速生長。本試驗(yàn)結(jié)果與郭少鵬等［22］得出的最佳C/N 為12、孫將等［23］研究的最佳C/N 為15 的結(jié)果相似。廢水中C/N 比普遍較低，而菌株L-1 適宜更高的C/N 比，在后續(xù)L-1處理低C/N 比的廢水時(shí)需要考慮調(diào)節(jié)C/N。

碳源是微生物生物量累積和生命活動(dòng)的能量來源，不同碳源對其硝化能力有直接影響［24］。L-1 在以葡萄糖為碳源時(shí)，硝化性能較差，與Acinetobactersp.ND7 的結(jié)果［25］一致，相較于葡萄糖，檸檬酸鈉等無機(jī)碳源結(jié)構(gòu)簡單更容易被微生物吸收利用［19,26］。本研究中最佳碳源為檸檬酸鈉，這與朱曉明等［27］分離的菌株XK51、譚俊杰等［28］分離的菌株ADM-42、鄭建龍等［29］分離的菌株DG-3 的最佳碳源均為檸檬酸鈉相同。在處理廢水或調(diào)節(jié)廢水C/N 時(shí)，應(yīng)選擇能被高效利用的碳源。逐步提高初始NH4+-N 濃度，當(dāng)NH4+-N 濃度在800 mg/L 時(shí)，L-1 的異養(yǎng)硝化能力明顯下降，但其仍然可以生長且NH4+-N濃度下降，說明L-1 能夠耐受高濃度NH4+-N 脫氮，NH4+-N去除率較低的原因可能是處理時(shí)間不足［30-31］。故后續(xù)可研究其在含高濃度NH4+-N 的養(yǎng)殖廢水中脫氮能力。

3.3 菌株L-1 在農(nóng)村養(yǎng)殖廢水中的應(yīng)用

養(yǎng)豬廢水含有高濃度的NH4+-N，直接排放會(huì)嚴(yán)重破壞水體環(huán)境，所以必須降低氮素濃度。本試驗(yàn)采集發(fā)酵中的養(yǎng)豬廢水，將菌株L-1 投加到未滅菌的廢水，經(jīng)處理96 h 后，對氮素去除效果明顯。與CAO 等［11］處理配制的廢水和Klebsiella oxytoca YZ-12［13］處理滅菌后的廢水不同，采集的廢水來自發(fā)酵池且未做滅菌處理，其成分更加復(fù)雜，菌株L-1 可能會(huì)受到其他微生物的影響，L-1 對NH4+-N 去除不徹底，后續(xù)可以馴化L-1 在實(shí)際養(yǎng)豬廢水中的適應(yīng)能力以及串聯(lián)曝氣裝置［32-33］，提高對氮素的去除效果。

4 結(jié)論

從湖泊底泥中篩選出一株異養(yǎng)硝化-好氧反硝化菌株，經(jīng)分子生物學(xué)鑒定初步確定為不動(dòng)桿菌（Acinetobactersp），命名為L-1，菌株L-1不僅能去除NH4+-N，還能進(jìn)行好氧反硝化去除NO3--N、NO2--N。通過單因素研究菌株L-1 的脫氮特性結(jié)果顯示接種比例為2%、碳源為檸檬酸鈉、pH 為6～9、溫度20～30 ℃、C/N 為10～20、初始NH4+-N 濃度為50 mg/L 時(shí)氨氮去除率最高；在實(shí)際養(yǎng)豬廢水中投加L-1 進(jìn)行脫氮，1 000 mg/L NH4+-N 廢水中氨氮去除率為70.15%，與空白組對比NH4+-N 去除率提高45.78%，且廢水中的NO3--N、NO2--N 濃度分別降低了80.21%和60.53%，表明L-1 在實(shí)際廢水中具有一定異養(yǎng)硝化-好氧反硝化能力。