三角褐指藻和小球藻藻粉添加對(duì)皺紋盤鮑稚鮑生長的影響

劉力源 ，李長青 ，姬廣磊，盧龍飛 ，楊曉斌,，常麗榮

（1.威海長青海洋科技股份有限公司，山東 榮成 264300；2.國家海產(chǎn)貝類工程技術(shù)研究中心，山東 榮成 264300；3.威海市漁業(yè)技術(shù)推廣站，山東 威海 264200；4.威海青逸未來生物技術(shù)有限公司，山東 榮成 264300）

【研究意義】皺紋盤鮑（Haliotis discus hannai）是一種具有極高經(jīng)濟(jì)價(jià)值的水產(chǎn)養(yǎng)殖貝類，是我國鮑養(yǎng)殖中的優(yōu)勢(shì)品種［1］。為了提供更加高效、合理的外源營養(yǎng)促進(jìn)稚鮑生長，人工配合飼料相關(guān)研究相繼發(fā)展起來［2］。飼料的種類、營養(yǎng)是影響稚鮑生長速度和養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)產(chǎn)量的關(guān)鍵因素［3］。工廠化養(yǎng)殖條件下稚鮑主要取食人工飼料，但目前市場(chǎng)上的人工飼料質(zhì)量參差不齊［4］。如何優(yōu)化飼料配比是影響稚鮑生長、提高稚鮑產(chǎn)量的關(guān)鍵問題?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】目前在稚鮑人工飼料中添加促生長的物質(zhì)主要有維生素、礦物質(zhì)和微生物制劑等［4-6］，對(duì)微藻添加的研究相對(duì)較少。微藻是鮑發(fā)育過程中不可缺少的重要餌料，鮑從浮游幼體發(fā)育至稚鮑，主要以硅藻門藻類為餌料［7］。微藻作為餌料，對(duì)提高鮑育苗存活率具有重要意義。Gordon 等［8］研究發(fā)現(xiàn)，皺紋盤鮑攝食底棲硅藻后能顯著提高其存活率。微藻富含蛋白、多糖、微量元素等，營養(yǎng)全面，在飼料中添加適量微藻具有促進(jìn)生長、增強(qiáng)抗病能力等效果［7］。陳全震等［9］研究發(fā)現(xiàn)，飼料中添加螺旋藻可以促進(jìn)皺紋盤鮑的生長，且效果優(yōu)于單一的海帶粉。陳曉燕［10］發(fā)現(xiàn)在養(yǎng)殖水中添加綠色巴夫藻能夠促進(jìn)稚鮑生長。朱豐等［11］研究認(rèn)為在養(yǎng)殖水中添加新鮮微藻既能凈化養(yǎng)殖水體的水質(zhì)，又能促進(jìn)鮑魚生長。三角褐指藻（Phaeodactylum tricornutum）隸屬硅藻門，羽紋綱，褐指藻目，褐指藻科，褐指藻屬［12］，易于養(yǎng)殖，含有豐富的蛋白質(zhì)、多糖、維生素等營養(yǎng)物質(zhì)［13］。目前，三角褐指藻在水產(chǎn)養(yǎng)殖方面僅作為飼料原料，較少涉及其對(duì)水產(chǎn)動(dòng)物的影響探究［14］。海洋小球藻（Chlorella）隸屬于綠藻門綠藻綱綠藻目小球藻科小球藻屬，含有豐富的蛋白質(zhì)，被廣泛應(yīng)用在飼料添加劑方面［15-16］。已有研究發(fā)現(xiàn)，用小球藻代替魚粉飼喂鯽魚能提高鯽魚增重率、降低餌料系數(shù)、提高肝臟生脂酶活性［17］。餌料添加小球藻能夠激活三疣梭子蟹的免疫活性［18］。小球藻能夠促進(jìn)南美白對(duì)蝦生長，顯著提高對(duì)蝦血淋巴和肝胰腺中的抗氧化酶活性，提高南美白對(duì)蝦的機(jī)體免疫能力［19-20］。日本蟳注射小球藻提取多糖后血清中的超氧化物歧化酶、過氧化氫酶和溶菌酶活性顯著提高，具有誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的作用［21］。但目前關(guān)于三角褐指藻和小球藻在稚鮑餌料添加方面的應(yīng)用研究依然不足。

【研究切入點(diǎn)】近年來病害頻發(fā)嚴(yán)重制約了鮑工廠化養(yǎng)殖的發(fā)展，其中細(xì)菌性病害占重要位置［22-25］?；【亲畛Ｒ娗椅：ψ顕?yán)重的細(xì)菌性病原之一［21,26-27］，目前主要采用抗生素進(jìn)行防治，但并不能從根本上解決病害頻發(fā)的問題。改善鮑人工餌料配比、提高自身免疫力是預(yù)防鮑病害的重要途徑，而且由于微藻具有較高的營養(yǎng)價(jià)值，作為餌料添加劑對(duì)促進(jìn)生長具有積極作用?！緮M解決的關(guān)鍵問題】本研究以三角褐指藻和小球藻作為添加劑，比較不同添加量對(duì)皺紋盤鮑稚鮑生長存活的影響，探究在稚鮑餌料中添加三角褐指藻和小球藻的可行性，為皺紋盤鮑的養(yǎng)殖生產(chǎn)提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試的三角褐指藻、海水小球藻以及皺紋盤鮑均來自尋山集團(tuán)有限公司，藻粉冷凍干燥過孔徑0.150 mm 網(wǎng)篩后混入人工餌料中。本研究所用鮑餌料購自威海金牌生物科技有限公司，營養(yǎng)成分如下：粗蛋白≥30.0%、粗灰分≤30.0%、粗纖維≤12.0%、賴氨酸≥1.3%、總磷≥1.0%、水分≤12.0%、粗脂肪≥2.5%。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 養(yǎng)殖管理 養(yǎng)殖試驗(yàn)于2021 年5—8 月在尋山集團(tuán)有限公司的養(yǎng)殖車間進(jìn)行。鮑養(yǎng)殖在有附著基的白色塑料養(yǎng)殖槽（53 cm×38 cm×20 cm）內(nèi)，使用沙濾流水養(yǎng)殖（水溫20±2 ℃），暫養(yǎng)10 d 后開始試驗(yàn)。每個(gè)養(yǎng)殖槽內(nèi)放置200 頭稚鮑（殼長9.80±1.21 mm，體質(zhì)量0.12±0.01 g）。試驗(yàn)周期為40 d，養(yǎng)殖期間每天16：00 投喂飼料，投餌量為稚鮑體質(zhì)量的3%～5%，投餌后停水1 h，次日8：00 清理剩余飼料及糞便，并統(tǒng)計(jì)稚鮑死亡數(shù)量。

1.2.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì) 三角褐指藻和小球藻分別設(shè)置3 個(gè)添加濃度（1%、3%、5%），每個(gè)處理設(shè)置3個(gè)平行，分別用PT1、PT3、PT5 代表人工飼料中添加1%、3%、5%三角褐指藻處理，用CH1、CH3、CH5 代表人工飼料中添加1%、3%、5%小球藻處理，每個(gè)平行200 頭稚鮑；對(duì)照稚鮑只飼喂人工飼料。

1.2.3 指標(biāo)測(cè)定 于養(yǎng)殖10、20、30、40 d 時(shí)，分別從各處理隨機(jī)選取10 頭規(guī)格相近的稚鮑，檢測(cè)內(nèi)臟囊的細(xì)菌和弧菌數(shù)量。試驗(yàn)結(jié)束后各處理隨機(jī)測(cè)量100 頭稚鮑的殼長和體質(zhì)量，并隨機(jī)抽取10 頭稚鮑進(jìn)行全組織總抗氧化能力（T-AOC）和超氧化物歧化酶（SOD）活性測(cè)定，隨機(jī)抽取10 頭稚鮑進(jìn)行消化腺α-淀粉酶（AMS）和纖維素酶（CL）活性測(cè)定。

采用游標(biāo)卡尺和珠寶稱測(cè)量稚鮑的殼長（精確度為0.01 mm）和體質(zhì)量（精確度為0.01 g）。采用南京建成生物工程研究所試劑盒測(cè)定稚鮑的T-AOC、SOD、AMS和CL，詳細(xì)操作步驟見說明書。采用平板涂布法（PC 法）［28］進(jìn)行細(xì)菌培養(yǎng)及菌落計(jì)數(shù)，采用2216E 培養(yǎng)基檢測(cè)細(xì)菌數(shù)量、TCBS特異性培養(yǎng)基檢測(cè)弧菌數(shù)量。取樣時(shí)先用無菌海水沖洗內(nèi)臟囊3 次，然后放入小型勻漿器中加入1 mL 生理鹽水進(jìn)行研磨，充分混勻并適當(dāng)稀釋，吸取1 mL 稀釋后的菌液涂布培養(yǎng)基，每個(gè)處理至少3 次重復(fù)。25（±1）℃恒溫培養(yǎng)48 h 后，統(tǒng)計(jì)2216E 和TCBS 平板上的菌落數(shù)量，即為細(xì)菌和弧菌數(shù)量。

1.3 指標(biāo)計(jì)算

殼長日增長（DLG）、日增重（DWG）、殼長增長率（LGR）、增重率（WGR）、餌料系數(shù)（FCR）、死亡率計(jì)算公式如下：

式中，Li、Lt分別表示試驗(yàn)開始和結(jié)束時(shí)稚鮑的平均殼長，Wi、Wt分別表示試驗(yàn)開始和結(jié)束時(shí)稚鮑的平均體質(zhì)量，T表示養(yǎng)殖天數(shù)。

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 24.0 對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析（one-way ANOVA），采用Duncan進(jìn)行組間多重比較，采用SigmaPlot 14.0 作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同三角褐指藻和小球藻添加量對(duì)稚鮑生長參數(shù)的影響

經(jīng)過40 d 養(yǎng)殖后，飼料中添加微藻的6 個(gè)處理稚鮑的生長參數(shù)見表1。由表1 可知，飼料中添加三角褐指藻和小球藻可促進(jìn)稚鮑殼長的生長，各處理稚鮑的殼長均顯著高于對(duì)照。三角褐指藻處理稚鮑的殼長均顯著高于小球藻處理，以5%三角褐指藻處理殼長最大（16.38±2.49 mm）。三角褐指藻處理稚鮑的殼長日增長均顯著高于對(duì)照和小球藻處理。飼料中添加三角褐指藻促進(jìn)了稚鮑體質(zhì)量的增長，三角褐指藻處理稚鮑的體質(zhì)量均顯著高于對(duì)照和小球藻處理，以5%三角褐指藻處理體質(zhì)量最大（0.66±0.01 g）。三角褐指藻處理日增重均顯著高于對(duì)照和小球藻處理。兩種微藻的添加降低了稚鮑的死亡率，各處理死亡率均顯著低于對(duì)照，以1%小球藻處理死亡率最低（2.00%±0.67%）。三角褐指藻處理殼長增長率和增重率均顯著高于對(duì)照和小球藻處理，均以5%三角褐指藻處理最高。此外，三角褐指藻的添加顯著降低稚鮑餌料利用率，其中以5%三角褐指藻處理的餌料系數(shù)最低（0.44）。

表1 不同微藻添加處理稚鮑的生長參數(shù)比較Table 1 Comparison of growth parameters of juvenile abalone treated with different microalgae

2.2 不同三角褐指藻和小球藻添加量對(duì)稚鮑抗氧化能力和消化酶活性的

由表2 可知，飼料中添加5%三角褐指藻可顯著提高稚鮑的T-AOC、SOD 和AMS 活性，添加5%小球藻可顯著提高稚鮑SOD 活性。各處理稚鮑的SOD 活性均高于對(duì)照，其中以5%小球藻處理SOD 活性最高（12.90±0.75 U/mg），5%三角褐指藻處理和5%小球藻處理SOD活性（12.90±0.75、12.99±0.42 U/mg）均顯著高于對(duì)照。各處理T-AOC 活性均高于對(duì)照，其中以5%三角褐指藻處理T-AOC 活性最高（1.19±0.06 U/mg），顯著高于對(duì)照。各處理α-淀粉酶活性均高于對(duì)照，其中以5%三角褐指藻處理α-淀粉酶活性最高（4.92±0.74 U/dL），顯著高于對(duì)照。飼料中添加三角褐指藻和小球藻對(duì)稚鮑體內(nèi)的纖維素酶活性未產(chǎn)生影響，各處理間差異不顯著。

表2 不同微藻添加處理稚鮑的抗氧化能力和消化酶活性比較Table 2 Comparison of antioxidant capacity and digestive enzyme activities of juvenile abalone treated with different microalgae

2.3 不同三角褐指藻和小球藻添加量對(duì)稚鮑內(nèi)臟囊中細(xì)菌和弧菌數(shù)量的影響

由圖1 可知，飼料中添加5%三角褐指藻和5%小球藻對(duì)稚鮑內(nèi)臟囊中細(xì)菌和弧菌具有一定的抑制作用。用添加微藻的飼料投喂稚鮑10 d和20 d 后，各處理稚鮑內(nèi)臟囊中細(xì)菌和弧菌的數(shù)量低于對(duì)照，但差異不顯著；養(yǎng)殖30 d 后，5%三角褐指藻處理稚鮑內(nèi)臟囊中弧菌和細(xì)菌數(shù)量（4 185±427、5 500±377 CFU/mL）顯著低于對(duì)照；養(yǎng)殖40 d 后，各處理內(nèi)臟囊中細(xì)菌和弧菌的數(shù)量均低于對(duì)照，其中5%三角褐指藻和5%小球藻處理稚鮑內(nèi)臟囊中弧菌和細(xì)菌數(shù)量均顯著低于對(duì)照，5%小球藻處理稚鮑內(nèi)臟囊中弧菌數(shù)量（4 463±459 CFU/mL）最低，5%三角褐指藻處理稚鮑內(nèi)臟囊中細(xì)菌數(shù)量（5 025±240 CFU/mL）最低。

圖1 不同時(shí)期不同微藻添加處理稚鮑內(nèi)臟囊中細(xì)菌和弧菌的數(shù)量統(tǒng)計(jì)Fig.1 Quantitative statistics of visceral bacteria and vibrio in juvenile abalone treated with different microalgae at different stages

3 討論

本研究采用添加三角褐指藻和小球藻藻粉的人工飼料飼喂皺紋盤鮑稚鮑，結(jié)果表明，藻粉添加可顯著提高稚鮑的殼長、顯著降低稚鮑死亡率，經(jīng)過40 d 養(yǎng)殖后，部分處理T-AOC 和SOD 活性顯著提高，表明三角褐指藻和小球藻藻粉的添加能促進(jìn)稚鮑的生長、提高稚鮑的抗氧化能力。已有研究發(fā)現(xiàn)，微藻能促進(jìn)魚蝦蟹和其他貝類等水產(chǎn)動(dòng)物的生長、存活率和增強(qiáng)抗病性等［19,29-31］。樓寶［32］研究表明，在飼料中混入三角褐指藻能促進(jìn)太平洋牡蠣面盤幼蟲的生長等。本研究結(jié)果與已發(fā)表研究基本相符。

本研究的三角褐指藻添加處理稚鮑的生長優(yōu)勢(shì)明顯，其中5%三角褐指藻處理各生長參數(shù)相對(duì)最優(yōu)。這一結(jié)果可能與三角褐指藻的營養(yǎng)成分更優(yōu)有關(guān)。三角褐指藻的總糖含量、蛋白質(zhì)、部分游離氨基酸、葉綠素a 和類胡蘿卜素含量均高于小球藻［33］。同時(shí)，三角褐指藻富含二十碳五烯酸（EPA），EPA 是鮑生長的必需脂肪酸，在鮑生長、繁殖中具有重要作用［34］。Laura 等［35］發(fā)現(xiàn)，在一定條件下，飼料中蛋白質(zhì)的利用率與蛋白含量呈正相關(guān)。營養(yǎng)成分的差異可能是造成三角褐指藻和小球藻處理稚鮑生長差異的原因。此外，三角褐指藻和小球藻添加提高了稚鮑體內(nèi)α-淀粉酶活性。α-淀粉酶已被證明與水生動(dòng)物生長密切相關(guān)［36-38］。α-淀粉酶不僅可以影響水生動(dòng)物對(duì)食物的消化吸收能力，而且其合成量影響水生動(dòng)物的營養(yǎng)吸收［39］。本研究中，三角褐指藻添加處理稚鮑的α-淀粉酶活性平均值（4.69 U/dL）高于小球藻處理（3.88 U/dL）。結(jié)合生長參數(shù)發(fā)現(xiàn)，α-淀粉酶活性較高的處理各項(xiàng)生長參數(shù)均較高。

在飼料中添加三角褐指藻和小球藻可提高稚鮑T-AOC 和SOD 活性，降低稚鮑體內(nèi)弧菌和細(xì)菌的數(shù)量，這一結(jié)果與前人對(duì)三角褐指藻和小球藻的抑菌效果研究［40-43］具有一致性。Kellam等［43］研究發(fā)現(xiàn)，三角褐指藻和小球藻的提取物對(duì)很多革蘭氏陽性細(xì)菌和革蘭氏陰性細(xì)菌具有抑制作用。席波等［42］研究表明，海水小球藻具有抑菌作用，且其提取物抗氧化活性較高。Pratt等［44］從小球藻中分離出具有抗菌作用的脂肪酸混合物。在投喂三角褐指藻和小球藻后，太平洋紡錘水蚤和南美白對(duì)蝦的抗氧化酶活性明顯提高［19,45］，表明三角褐指藻和小球藻一方面可能包含抑菌活性物質(zhì)殺滅稚鮑體內(nèi)的弧菌和細(xì)菌，另一方面可能通過提高免疫力間接降低其體內(nèi)弧菌和細(xì)菌數(shù)量。鮑養(yǎng)殖環(huán)境和體內(nèi)弧菌達(dá)到一定數(shù)量時(shí)，會(huì)引起鮑大量死亡［46-47］。本研究通過改善鮑餌料營養(yǎng)成分，降低稚鮑體內(nèi)的細(xì)菌和弧菌數(shù)量，從而降低鮑病害發(fā)生的可能性，在一定程度上能夠預(yù)防病害發(fā)生。此外，本研究采用冷凍干燥的方式進(jìn)行藻粉預(yù)處理，很大程度上保留了微藻的有效成分［48］。關(guān)于三角褐指藻和小球藻對(duì)稚鮑體內(nèi)弧菌、細(xì)菌的抑制機(jī)理還有待進(jìn)一步深入研究。

4 結(jié)論

本研究分析了飼料中添加不同比例三角褐指藻和小球藻藻粉對(duì)皺紋盤鮑稚鮑生長、抗氧化酶、消化酶活性以及內(nèi)臟囊中細(xì)菌和弧菌數(shù)量的影響。結(jié)果顯示，飼料中添加三角褐指藻和小球藻能顯著提高稚鮑殼長，降低稚鮑死亡率，提高稚鮑T-AOC、SOD 和α-淀粉酶活性，但對(duì)纖維素酶活性影響不大。三角褐指藻藻粉促進(jìn)稚鮑殼長生長效果優(yōu)于小球藻藻粉。養(yǎng)殖40 d 后，添加5%三角褐指藻和添加5%小球藻可顯著降低稚鮑內(nèi)臟囊中弧菌和細(xì)菌的數(shù)量。添加5%三角褐指藻對(duì)促進(jìn)稚鮑生長效果最優(yōu)。