磷脅迫下內生真菌對米老排生長和磷素吸收的影響

沈 雯 ，鄒秉章，林能慶，代甜甜，林 晗 ，洪永輝，林景泉，謝安強

（1.福建農(nóng)林大學林學院，福建 福州 350002；2.福建省高校森林生態(tài)系統(tǒng)經(jīng)營與過程重點實驗室，福建 福州 350002；3.福建省上杭白砂國有林場，福建 龍巖 364200；4.龍巖市林業(yè)種苗站，福建 龍巖 364200）

【研究意義】米老排（Mytilaria laosensis）是一種常見的速生樹種，主要在東南亞國家和我國西南、東南等地區(qū)廣泛種植，具有良好的經(jīng)濟價值、生態(tài)價值和觀賞價值［1］，同時也是土壤改良、水土保持、混交造林、水源涵養(yǎng)和生物防火的優(yōu)良樹種，是我國重要的闊葉樹種和速生樹種之一［2］。米老排作為一種快速生長的高大闊葉樹，在土壤保護和管理方面發(fā)揮著重要作用，其大規(guī)模種植有助于增加生態(tài)效益。米老排在我國一般生長在南方酸性土壤中，以沙巖、花崗巖等酸性紅壤土為主。南方土壤的弱酸性和低磷特點造成米老排等南方樹種質量和產(chǎn)量下降［3］。近年來，隨著人們對木材需求量的不斷增大，科研工作者發(fā)現(xiàn)米老排具有巨大的發(fā)展?jié)摿屠脙r值，因此，有關米老排樹種的研究工作在不斷加強和深入?！厩叭搜芯窟M展】磷在植物生長和發(fā)育過程中發(fā)揮重要作用，參與植物體內的許多生化過程［4］以及信號傳遞，對植物生長發(fā)育和提高抗逆性有著顯著促進作用。研究表明，缺磷會抑制植物的正常生長發(fā)育。然而，為適應低磷脅迫環(huán)境，大多數(shù)植物會通過增加根部酸性磷酸酶等滲出物的方式，以減輕對植物生長發(fā)育的抑制作用。此外，為避免低磷脅迫下植株體內活性氧自由基的過度累積而產(chǎn)生的損傷，植物會提升超氧化物歧化酶等保護酶的活性來降低低磷脅迫所導致的氧化損傷［5-6］。在我國南方林區(qū)，土壤磷素礦化現(xiàn)象很普遍，阻礙了磷的有效利用［7-8］，嚴重限制了農(nóng)林植物的正常生長發(fā)育?！颈狙芯壳腥朦c】內生真菌是指生活在健康植株不同組織和器官中的微生物，不會對植株產(chǎn)生明顯病害癥狀［9-10］。有研究表明內生真菌可以合成并分泌植株生長所需要的生長素IAA、赤霉素GA 等植物激素，也可以促進植株對營養(yǎng)元素的吸收，促進植株生長。內生真菌對植株的光合特性具有積極影響，能夠提高植株抗生物和非生物的脅迫能力［11-13］。目前，關于采用內生真菌促進米老排幼苗生長和磷元素吸收的研究尚未見報道?！緮M解決的關鍵問題】本研究以一年生米老排實生幼苗作為供試材料，土壤設置不同濃度的磷脅迫，開展內生真菌對米老排幼苗生長和磷素吸收的作用機制研究，以此為米老排在低磷環(huán)境下提高磷元素吸收利用效率和抗逆性以及促進生長提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本試驗在福建農(nóng)林大學森林生態(tài)系統(tǒng)過程與經(jīng)營重點實驗室進行，米老排幼苗栽植于福建農(nóng)林大學田間實驗地。試驗所用的米老排幼苗為福建省上杭白砂國有林場所提供的生長良好、無病蟲害的一年實生幼苗。

供試菌株：前期從生長健壯、無病蟲害的一年生米老排幼苗根、莖、葉樣品中分離純化內生真菌，選擇10 種內生真菌，分別為葉片中分離出的M1、M2，根系中分離出的M3、M4、M5、M6、M7、M8、M9 以及莖中分離出的M10，經(jīng)鑒定后菌株信息如下：青霉屬（Penicilliumsp.，M1）、枝孢屬（Cladosporiumsp.，M2）、雙毛座孢屬（Thozetella pinicolasp.，M3）、Gliocladiopsissp.（M4）、枝孢屬（Cladosporiumsp.，M5）、擬盤多毛孢屬（Pestalotiopsissp.，M6）、間座殼屬（Diaporthesp.，M7）、Tainosphaeriasp.（M8）、青霉屬（Penicilliumsp.，M9）、Gliocladiopsissp.（M10）。

1.2 試驗方法

試驗以土培盆栽的方式進行，選擇長勢相似的苗木，于2021 年4 月15 日將其定植于23 cm×21.5 cm×18 cm（上圓直徑×下圓直徑×高）的塑料盆中，每盆放入經(jīng)高壓滅菌后的黃壤，約6.5 kg。待植株經(jīng)過2 個月恢復性生長后，于6 月15 日開始進行接種試驗。從植物體頂部施澆100 mL 相同濃度的10 種菌株菌液，確保根、莖、葉以及土壤均有菌液，3 次重復，同時施澆相同體積的無菌水作為對照（CK）。接種15 d 后進行磷脅迫處理，脅迫60 d 后進行指標測定。

1.2.1 菌液配置 恒溫28℃下，通過馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA）將10 株純化并且存活的內生真菌培養(yǎng)一周，然后將培育良好的內生真菌轉接到50 mL 馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基（PDB）中，進行72 h 的恒溫搖床震蕩（28℃、180 r/min），利用血球計數(shù)板計算菌液濃度，經(jīng)無菌水稀釋后，配制成5.5×106CFU/mL 菌液。

1.2.2 低磷脅迫試驗設計 米老排幼苗土壤盆栽試驗設計，采用KH2PO4設置脅迫梯度，共設置4 個磷脅迫梯度：18 mg/kg（正常條件）、12 mg/kg（輕度脅迫）、6 mg/kg（中度脅迫）、0 mg/kg（重度脅迫）［14］，3 次重復，分別對應11 種接菌方式，共計132 盆。

1.3 指標測定

地上部生長量：分別用皮尺和游標卡尺測量苗高（cm）和地徑（mm），計算試驗前后的增量。

生物量：烘干后測量地上部和根系生物量，計算根冠比。

葉片酸性磷酸酶活性（APA）測定：稱取洗凈的葉片0.05 g 放入含5 mL（pH 5.0、0.2 mol/L）醋酸－醋酸鈉緩沖液和5 mL 對硝基苯磷酸二鈉（5 mmol/L）的試管中，使用恒溫培養(yǎng)箱30℃暗保持30 min。隨之加入NaOH 終止反應，在波長為405 nm 下進行比色［15］。

根系APA 測定：稱取洗凈的較細米老排根部0.1 g，加0.2 mol/L 的醋酸鈉醋酸—醋酸鈉緩沖液，進行冰浴勻漿。勻漿放置離心管中并放入冰箱，1 h 后10 000 r/min 離心30 min。取出上清液進行根系APA 測定［16］。土壤酸性磷酸酶活性測定參考張海偉［17］等方法，植物磷含量測定采用鉬銻抗比色法［18］。

數(shù)據(jù)的整理使用Excel 2016 完成，采用SPSS 19.0 進行方差分析及差異性檢驗，并利用Origin 19.0 進行作圖。

2 結果與分析

2.1 磷脅迫下內生真菌對米老排幼苗地上部生長量的影響

不同磷脅迫下，接種內生真菌的米老排幼苗苗高（表1）和地徑（表2）增量均呈現(xiàn)先增后降的變化趨勢。不同磷脅迫下接種菌株M1 的米老排幼苗苗高與地徑增量顯著。隨著脅迫程度的增加，接種菌株M9 的米老排幼苗苗高與地徑的增量較高，在中度脅迫時苗高增量顯著高于CK，在重度脅迫時地徑增量較為顯著。接種菌株M8 在不同程度脅迫時均能顯著提高米老排幼苗地徑。在重度脅迫時，接種菌株處理的米老排幼苗地徑增量均高于CK。

表1 磷脅迫下內生真菌對米老排幼苗苗高（cm）的影響Table 1 Effects of endophytic fungi on height (cm) of Mytilaria laosensis seedlings under phosphorus stress

表2 磷脅迫下內生真菌對米老排幼苗地徑（mm）的影響Table 2 Effects of endophytic fungi on ground diameter (mm)of Mytilaria laosensis seedlings under phosphorus stress

2.2 磷脅迫下內生真菌對米老排幼苗根冠比的影響

不同磷脅迫下內生真菌對米老排幼苗根冠比的影響如表3 所示，不同脅迫下米老排幼苗根冠比均小于1，地上部的干重顯著大于根系。隨著脅迫程度的增加，接種菌株M3、M4、M9 的米老排幼苗根冠比呈增加趨勢，接種菌株M5、M7、M8 的根冠比呈先增加后減小的變化趨勢，接種菌株M6 的根冠比呈減小趨勢。在輕度脅迫和中度脅迫下，接種菌株M10 的米老排幼苗根冠比較CK 顯著增加。

表3 磷脅迫下內生真菌對米老排幼苗根冠比的影響Table 3 Effects of endophytic fungi on root/shoot ratio of Mytilaria laosensis seedlings under phosphorus stress

2.3 磷脅迫下內生真菌對米老排幼苗磷含量的影響

2.3.1 地上部磷含量 如圖1 所示，隨著磷脅迫程度增加，接種內生真菌能夠有效促進米老排幼苗的生長。在正常條件下，接種菌株M6、M10的米老排幼苗地上部磷含量分別較CK 顯著增加36.9%、33.25%；在輕度脅迫下，接種菌株M1、M10 的米老排幼苗地上部磷含量較CK 顯著增加4.48%、23.0%；在中度脅迫下，接種菌株M9、M10 的米老排幼苗地上部磷含量較CK 顯著增加29.9%、27.2%。重度脅迫處理下，接種菌株M4、M6、M9 對米老排幼苗地上部磷含量均有不同程度的促進作用，其中接種M6 的磷含量較CK顯著增加41.1%。因此，在正常條件和重度脅迫下菌株M6 能夠有效提高米老排幼苗地上部磷含量，隨著脅迫程度增加，菌株M9 的促進效果更為突出，除重度脅迫外，菌株M10 均具有顯著促進作用。

圖1 磷脅迫下內生真菌對米老排幼苗地上部磷含量的影響Fig.1 Effects of endophytic fungi on aboveground phosphorus content of Mytilaria laosensis seedlings under phosphorus stress

2.3.2 根系磷含量 根是植物重要的水分和養(yǎng)分吸收器官，在不同磷水平下的形態(tài)變化可以反映其對磷的需求和適應能力［19］。隨著磷脅迫程度的增加，接種菌株后的米老排幼苗地下部磷含量呈現(xiàn)下降趨勢（圖2）。在正常條件下，接種菌株M6、M7、M9 的米老排幼苗地下部磷含量較CK 顯著增加，分別增加58.3%、74.35、80.6%。在輕度脅迫下，僅接種菌株M1、M2 的米老排幼苗地下部磷含量增加。在中度脅迫下，接種菌株M4、M10 的米老排幼苗地下部磷含量較CK 顯著增加，分別增加49.2%、48.5%。重度脅迫下，除菌株M8 外，接種其余菌株的米老排地下部磷含量較CK 均有增加，其中接種菌株M4 較CK 具有顯著性差異，增加57.7%。因此，隨著脅迫程度增加，菌株M4 能夠顯著增加米老排幼苗地下部磷含量。

圖2 磷脅迫下內生真菌對米老排幼苗根系磷含量的影響Fig.2 Effects of endophytic fungi on root phosphorus content of Mytilaria laosensis seedlings under phosphorus stress

2.4 磷脅迫下菌種對米老排幼苗及土壤APA 的影響

2.4.1 葉片APA 隨著脅迫程度的增加，接種不同菌株后的米老排幼苗葉片APA 活性呈現(xiàn)不同的變化趨勢（圖3）。在正常條件和輕度脅迫下，接種菌株M10 的米老排幼苗葉片APA 較CK 均有提升，且差異顯著，分別增加32.4%、22.4%。在中度脅迫下，接種菌株M9 的米老排幼苗葉片APA 較CK 顯著增加28.9%。在重度脅迫下，接種菌株M6、M9 的米老排幼苗葉片APA 較CK 顯著增加40.3%、11.39%。由此可見，隨著脅迫程度的增加，菌株M9 與菌株M6 的促進作用逐漸凸顯。

圖3 磷脅迫下內生真菌對米老排幼苗葉片酸磷性酶活性（APA）的影響Fig.3 Effects of endophytic fungi on leaf acid phospatase activity (APA) of Mytilaria laosensis seedlings under phosphorus stress

2.4.2 根系APA 由圖4 可知，隨著磷脅迫程度的增加，接種不同菌株后的米老排幼苗根系APA均有一定程度的提升。在正常條件、中度脅迫和重度脅迫下，菌株處理后的米老排幼苗根系APA較CK 均有顯著提升。在正常條件下，接種菌株M9 米老排幼苗根系APA 較CK 顯著增加77.6%。在輕度脅迫下，接種菌株M2、M7 米老排幼苗根系APA 較CK 顯著增加7.9%、17.8%。其中菌株M7 對于提高根系APA 具有顯著的促進作用，在各處理條件下的根系APA 均高于對照，以正常條件下促進作用最顯著。

圖4 磷脅迫下內生真菌對米老排幼苗根系酸磷性酶活性（APA）的影響Fig.4 Effects of endophytic fungi on root acid phospatase activity (APA) of Mytilaria laosensis seedlings under phosphorus stress

2.4.3 土壤APA 磷脅迫下內生真菌對米老排幼苗土壤APA 的影響如圖5 所示。隨著脅迫程度的增加，接種不同菌株后的土壤APA 變化趨勢不同，其中接種菌株M5 能夠顯著提升在正常條件、輕度脅迫和重度脅迫下的土壤APA，分別為59.2%、89.5%、65.8%。正常條件下，接種菌株M9、M10的土壤APA 較CK顯著提升65.1%、38.75%。在輕度脅迫下，除接種菌株M5 外，接種其他菌株差異不顯著。中度脅迫下，僅接種菌株M6 的土壤APA 較CK 顯著提升18.4%。

圖5 磷脅迫下內生真菌對米老排幼苗土壤酸磷性酶活性（APA）的影響Fig.5 Effects of endophytic fungi on soil acid phospatase activity (APA) of Mytilaria laosensis seedlings under phosphorus stress

3 討論

脅迫環(huán)境會造成植物生長緩慢、產(chǎn)量降低等特點。研究表明，接種內生真菌能夠顯著促進低磷脅迫下杉木幼苗的生長［20］。本研究也發(fā)現(xiàn)，接種菌株M9 的米老排幼苗苗高與地徑的增量較高且根冠比呈增加趨勢，接種菌株M10 的米老排幼苗根冠比顯著增加，這可能因為內生真菌侵染可提高植物對營養(yǎng)元素的吸收和累積，也可能是因為內生真菌分泌植物生長所需的植物激素，從而促進米老排幼苗苗高地徑的增加和根系生長［21］。隨著脅迫程度的增加，接種菌株M5、M7 和M8 的根冠比先增加后減小，可見，隨著脅迫增加，這些菌株相較于菌株M9、M10 的促生能力逐漸減弱。

在低磷環(huán)境下，內生真菌可以促進幼苗產(chǎn)生有利于植株生長的激素，同時植物體內也會形成適應性機制，以提高植株對磷素的吸收效率［22］。本研究中，接種內生真菌的米老排幼苗地上部及地下部的磷含量均不同程度的增加，其原因可能是在脅迫環(huán)境作用下，幼苗根系所吸收的磷可能被運輸?shù)降厣喜糠郑源藵M足地上器官對于磷素的需要，共同抵抗脅迫環(huán)境［23-24］。在正常條件和重度脅迫下菌株M6 能夠有效提高米老排幼苗地上部磷含量。隨著脅迫程度的增加，菌株M9顯著提高米老排幼苗地上部磷含量，菌株M4 顯著提高地下部磷含量。這可能是因為內生真菌在植株適應脅迫環(huán)境的過程中發(fā)揮了較大作用，內生真菌可以有效促進植株對營養(yǎng)元素的吸收。除重度脅迫外，菌株M10 均能有效促進米老排幼苗地上部磷含量，隨著脅迫程度的增加，接種菌株后的米老排幼苗地下部位磷含量呈現(xiàn)下降趨勢，這可能是由于脅迫程度的加深，外部環(huán)境所能提供可供植株生長的磷元素越來越少，不利于幼苗的正常生長發(fā)育。有研究表明，根系是脅迫環(huán)境帶來傷害的首要部位，因此菌株對植物的促生效果在根系部位更加顯著，對植物生理的響應機制也更加迅速［25-26］。本研究發(fā)現(xiàn)，在相同磷脅迫處理下，米老排幼苗地下部磷含量均比地上部低，該結果與趙楊景等［27］研究結果一致，隨著脅迫程度增加，地下部的磷含量下降趨勢較為緩慢，造成這種現(xiàn)象的原因可能是在根系部分，植物自身的生理響應機制會更加迅速，同時在與內生真菌的協(xié)作下，對植株適應脅迫環(huán)境有著更加顯著的促進作用［28］。

低磷脅迫會誘導植物根系酸性磷酸酶、核酸酶及有機酸的合成和分泌，增加土壤中無機磷的含量［29］。本研究結果表明，隨著脅迫程度的增加，菌株M9 與菌株M6 的促進葉片APA 的作用逐漸凸顯，其中在重度脅迫下顯著增加40.3%、11.39%。在正常條件、中度脅迫和重度脅迫下，菌株處理后的米老排幼苗根系APA 較CK 均有顯著提升。這可能是因為在脅迫環(huán)境下，植物自身也會快速響應，形成適應性機制來提高自身的抗逆性。APA 的增加有助于提高米老排幼苗對細胞中貯存磷的活化利用率，提升米老排在脅迫環(huán)境的抗逆性［30］。葉片APA 在不同的磷脅迫梯度下，大部分菌株呈現(xiàn)先上升的變化趨勢，這與艾如波等［31］試驗結果一致，大部分菌株在輕度脅迫處理下APA 高于正常條件。隨著脅迫程度的增加，葉片與根系的APA 出現(xiàn)降低的變化趨勢，這與梁霞［32］的研究結果不同，其原因可能是：在短期脅迫時間與輕度脅迫環(huán)境下，接種的菌株可能會提高植株體內的APA，但隨著脅迫程度增加與脅迫時間延長，米老排幼苗自身調節(jié)能力有限，菌株對于APA 的促進作用逐漸減弱。本研究還發(fā)現(xiàn)，接種菌株M5、M9、M10 在不同脅迫條件下，均能相對提高土壤APA，說明這些菌株可以刺激根系分泌更多的酸性磷酸酶，促進土壤有機磷轉化為無機磷［33］。研究證實，磷脅迫環(huán)境下植株所表現(xiàn)出的酶活性變化規(guī)律可能不同：有些植株體內和根系會分泌更多的磷酸酶以此提高對外部環(huán)境中磷素的吸收與利用效率，但有些植物［34-35］。因此，植物自身的生長特性以及遺傳因素也可能是導致本試驗結果的原因之一。幼苗葉片與根系的APA 變化規(guī)律存在個體差異，可能與米老排自身的營養(yǎng)遺傳特性有關［35］。今后可基于本研究成果，嘗試用更加完善和精準的標準進行內生真菌的選擇，研究米老排自身的營養(yǎng)遺傳特性，為米老排的生長發(fā)育提供更加適宜的種植環(huán)境，調節(jié)米老排栽種地區(qū)的土壤酸堿度，為解決米老排缺磷問題提供有效方法。

4 結論

本研究發(fā)現(xiàn)，接種菌株M9、M10 能夠促進米老排幼苗生長，菌株M4、M6、M9 能夠顯著增加米老排幼苗磷含量，接種菌株M6、M9 均能顯著提高米老排幼苗葉片、根系以及根際土壤酸性磷酸酶活性。