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      中國(guó)辣椒BCAT 基因家族鑒定、表達(dá)分析及克隆

      2022-02-07 02:08:18謝炳春黃俊霖溫松森徐小萬徐曉美吳智明
      廣東農(nóng)業(yè)科學(xué) 2022年12期
      關(guān)鍵詞:基序支鏈辣椒

      謝炳春,黃俊霖,溫松森,李 濤,李 穎,徐小萬,徐曉美,吳智明,衡 周

      (1.仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院園藝園林學(xué)院,廣東 廣州 510225;2.廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所/廣東省蔬菜新技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,廣東 廣州 510640)

      【研究意義】辣椒(Capsicumspp.)是茄科(Solanaceae)辣椒屬(CapsicumL.)植物,原產(chǎn)于中南美洲,是我國(guó)種植面積最大的蔬菜[1]。中國(guó)辣椒(Capsicum chinenseJacq.)是辣椒5 個(gè)主要栽培種之一,其大多數(shù)資源均富含濃郁果香味,具有更豐富的味覺層次,是極好的商品性狀,如海南黃燈籠辣椒[2]、廣西小黃燈籠辣椒[3]和云南涮辣[4]等。據(jù)報(bào)道,中國(guó)辣椒中果香物質(zhì)主要為3-甲基丁酸-4-甲基戊酯、2-甲基丁酸-4-甲基戊酯和3-甲基丁酸-4-烯-6-甲基庚酯等支鏈酯類物質(zhì)[5]。植物支鏈酯類主要通過支鏈氨基酸途徑合成。BCAT 催化支鏈氨基酸生成相應(yīng)的2-氧代酸[6],經(jīng)過多步反應(yīng)后合成支鏈酯[8]。研究表明,BCAT基因在辣椒支鏈酯及相關(guān)代謝物合成過程中發(fā)揮著重要作用,因此開展中國(guó)辣椒BCAT基因的克隆和時(shí)空表達(dá)特征分析,對(duì)該基因功能研究和提升華南地區(qū)辣椒品質(zhì)育種具有重要意義[8-9]?!厩叭搜芯窟M(jìn)展】BCAT 作為催化植物支鏈酯類物質(zhì)合成第一步反應(yīng)的酶,受到許多研究重視。2002 年Diebold 等[10]首次鑒定并克隆出擬南芥中6 個(gè)BCAT基因并對(duì)其進(jìn)行基因功能驗(yàn)證,結(jié)果顯示AtBCAT1、AtBCAT2、AtBCAT3、AtBCAT5和AtBCAT6參與支鏈氨基酸合成,AtBCAT2、AtBCAT3、AtBCAT5 蛋白定位于葉綠體,AtBCAT1 蛋白位于線粒體。Schuster 等[11]2005 年使用GUS 染色和酶促動(dòng)力學(xué)等方法證明AtBCAT1 參與擬南芥所有組織中支鏈氨基酸代謝;2006 年發(fā)現(xiàn)AtBCAT4 參與蛋氨酸的鏈延長(zhǎng)途 徑[12]。2008 年Knill 等[13]推 測(cè)AtBCAT3 最有可能催化蛋氨酸鏈延長(zhǎng)過程中的末端步驟,從而產(chǎn)生短鏈硫代葡萄糖苷。隨后又有研究者相繼對(duì)番茄[14]、水稻[6]和小麥[14-15]中的BCAT基因進(jìn)行功能驗(yàn)證,相關(guān)基因功能與擬南芥的結(jié)果一致。2014 年郭道義[16]通過聯(lián)合改造酵母的亮氨酸、纈氨酸和脂肪酸途徑,成功實(shí)現(xiàn)支鏈醇和支鏈酯的生物合成,目前微生物中BCAT 參與支鏈醇和支鏈酯合成已經(jīng)被研究得比較清楚[17-18]。在乳球菌[19]、甜瓜[20]和香蕉[21]中均有報(bào)道顯示其表達(dá)量與支鏈酯類含量呈正相關(guān)?!颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所茄果研究室研發(fā)的辣椒品種金田1 號(hào)具有濃郁果香,據(jù)先前預(yù)實(shí)驗(yàn)分析得知其揮發(fā)性有機(jī)物質(zhì)主要為支鏈酯,這為中國(guó)辣椒支鏈氨基酸轉(zhuǎn)氨酶研究提供了物質(zhì)基礎(chǔ),前人研究表明BCAT基因參與支鏈酯和辣椒素等次生代謝物的生物合成,但在辣椒中還沒有BCAT基因家族相關(guān)的報(bào)道?!緮M解決的關(guān)鍵問題】本研究擬通過對(duì)中國(guó)辣椒BCAT基因家族的生物信息學(xué)鑒定、表達(dá)模式分析及克隆,明確中國(guó)辣椒基因組中BCAT基因的數(shù)目及分布,獲得其BCAT基因時(shí)空表達(dá)特征及確切序列。本研究是辣椒BCAT功能研究的基礎(chǔ),可為辣椒支鏈酯類物質(zhì)代謝機(jī)理研究提供一定的理論支持。

      1 材料與方法

      1.1 試驗(yàn)材料

      供試材料為中國(guó)辣椒栽培種金田1 號(hào)(圖1、圖2),由廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所茄果研究室李穎提供。2021 年7 月將辣椒種子浸泡12 h后于28℃催芽,露白后播種于裝有專用育苗基質(zhì)的32 孔穴盤,待幼苗長(zhǎng)至5~6 片真葉,移栽到廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院白云試驗(yàn)基地露地栽培,按常規(guī)田間栽培管理。開花坐果后分別掛牌,每隔5 d取樣1 次,分別取名為F1~F8,設(shè)3 個(gè)生物學(xué)重復(fù),液氮速凍后帶回實(shí)驗(yàn)室液氮下研磨成粉末保存于–80℃超低溫冰箱。

      圖1 辣椒植株Fig.1 Plant of Capsicum chinense

      圖2 不同生長(zhǎng)時(shí)期辣椒果實(shí)Fig.2 Different stage of pepper fruit

      1.2 試驗(yàn)方法

      1.2.1 辣椒BCAT 家族數(shù)據(jù)獲取與鑒定 由NCBI網(wǎng)站(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)下載中國(guó)辣椒基因組數(shù)據(jù),查詢相關(guān)文獻(xiàn)已經(jīng)驗(yàn)證過的BCAT基因的序列信息(表1),在Pfam 網(wǎng)站(https://pfam.xfam.org/search/#tabview=tab1)下載BCAT(PF01063)的hmm 文件,使用HMMER(V3.3.1)軟件和TB Tools(V1.09876)軟件對(duì)蛋白質(zhì)的氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)(E-value<1×10-5,其余參數(shù)默認(rèn))。通過在線BLAST、hmmsearch及hmmbuild 和hummsearch 聯(lián)用等手段對(duì)辣椒BCAT 基因家族成員進(jìn)行鑒定。

      表1 已鑒定的BCAT 基因Table 1 Identified BCAT genes

      1.2.2 辣椒BCAT基因家族成員蛋白理化性質(zhì)、亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)和染色體定位 辣椒BCAT 蛋白的氨基酸數(shù)目、分子量大小、等電點(diǎn)、親水性及亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)分別由在線軟件ExPASy-ProtParam(https://web.expasy.org/protparam/)和Plant-mPLoc serve(http://www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/plant-multi/)完成,染色體分布圖繪制在軟件MapChart 2.32 上完成。

      1.2.3 辣椒BCAT基因家族進(jìn)化樹構(gòu)建 使用MAGA X(Version 10.2.6)軟件對(duì)擬南芥、番茄、水稻、小麥和辣椒BCAT 家族成員構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(鄰接法,1 000 次重復(fù))。

      1.2.4 辣椒BCAT基因家族成員內(nèi)含子外顯子分析 使用在線工具GSDS2.0(http://gsds.gao-lab.org/)對(duì)辣椒BCAT基因家族成員內(nèi)含子外顯子進(jìn)行分析。

      1.2.5 辣椒BCAT家族基因保守基序分析 使用在線軟件MEME(http://memesuite.org/tools/meme)對(duì)辣椒BCAT 蛋白進(jìn)行保守基序(Motif)分析,最大motif 檢索數(shù)值為20。

      1.2.6 辣椒BCAT家族基因蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)、三級(jí)結(jié)構(gòu)分析、活性位點(diǎn)和配體預(yù)測(cè) 分別使用在線軟件SOPMA(https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html)和數(shù)據(jù)庫Phyre2(http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2/html/page.cgi?id=index)提交所得蛋白序列,經(jīng)過運(yùn)算后得到蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)和三級(jí)結(jié)構(gòu)。使用蛋白質(zhì)活性位點(diǎn)預(yù)測(cè)數(shù)據(jù)庫COACH(https://zhanggroup.org/COACH/)對(duì)辣椒BCAT 蛋白進(jìn)行活性位點(diǎn)及配體預(yù)測(cè),提取配體結(jié)合度最高的結(jié)果,使用軟件PyMOL(https://pymol.org/2/)進(jìn)行修飾,查看BCAT 基因家族成員蛋白的溶劑催化通道。

      1.2.7 辣椒BCAT家族基因啟動(dòng)子區(qū)域順式作用元件分析 提取BCAT基因家族成員起始密碼子上游2 000 bp 序列,利用在線網(wǎng)站Plant CARE(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)結(jié)合TBtool 軟件對(duì)BCAT基因家族成員啟動(dòng)子區(qū)域的順式作用元件進(jìn)行預(yù)測(cè)分析。

      1.2.8 辣椒BCAT基因家族成員時(shí)空表達(dá)量分析 使用北京全式金生物技術(shù)股份有限公司RNA提取試劑盒提取辣椒根、莖、葉、花和各個(gè)時(shí)期果實(shí)的總RNA;反轉(zhuǎn)錄試劑盒和熒光定量試劑盒SYBR Premix Ex TaqTM均購自日本TaKaRa 公司,以上所有操作均按照試劑盒說明書進(jìn)行。反轉(zhuǎn)錄體系使用20 μL 體系,熒光定量PCR 采用25 μL體系,擴(kuò)增程序?yàn)?5℃ 30 s、95 ℃ 5 s、60℃ 30 s,40 個(gè)循環(huán);溶解曲線繪制程序?yàn)椋?5 ℃到95 ℃每0.5℃依次讀板,每個(gè)樣品3 次重復(fù)。目標(biāo)基因相對(duì)表達(dá)量計(jì)算使用2–ΔΔCT法。熒光定量PCR引物信息如表2。

      1.2.9CcBCAT1~4 基因克隆 根據(jù)CcBCAT1~4基因模板序列于目標(biāo)基因前后設(shè)計(jì)帶接頭特異引物(表2),使用cDNA 進(jìn)行擴(kuò)增膠回收后連接pNC-Cam1304-SubN 載體[22]。連接好的載體轉(zhuǎn)入Trans5α,菌液PCR 陽性后送北京擎科生物科技有限公司測(cè)序。

      表2 引物信息Table 2 Information of the primers

      2 結(jié)果與分析

      2.1 辣椒BCAT 基因家族成員鑒定和進(jìn)化分析

      通過自建隱馬爾可夫模型和下載隱馬爾可夫模型分別得到7 個(gè)BCAT基因,去除重復(fù)和保守結(jié)構(gòu)域篩選后鑒定出5 個(gè)BCAT基因家族成員,分別命名為CcBCAT1、CcBCAT2、CcBCAT3、CcBCAT4、CcBCAT5。染色體物理位置定位分析顯示,辣椒BCAT1~BCAT5 染色體位置分別位于12、4、2、8 和4 號(hào)染色體(圖3)。這些基因位于4 條染色體末端,其中CcBCAT2和CcBCAT5重復(fù)相近地位于4 號(hào)染色體上,這兩個(gè)基因在表達(dá)上可能有所聯(lián)系,其余辣椒BCAT 基因分別位于一條染色體上。

      圖3 CcBCATs 基因染色體定位圖Fig.3 Chromosome location of the CcBCAT genes

      系統(tǒng)進(jìn)化分析顯示辣椒BCAT基因的同源性與同為茄科的番茄同源性極高,如SlBCAT1、SlBCAT2和SlBCAT3分別與CcBCAT1、CcBCAT2、CcBCAT3高度同源,可以推測(cè)對(duì)應(yīng)蛋白質(zhì)具有相似的功能;CcBCAT4則呈現(xiàn)獨(dú)立進(jìn)化;CcBCAT5與AtBCAT1同源性較高(圖4)。

      圖4 擬南芥、番茄、水稻小麥和中國(guó)辣椒中BCAT 蛋白的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.4 Phylogenetic tree of BCAT proteins in Arabidopsis,tomato,rice,wheat and Capsicum chinense

      辣椒BCAT基因家族成員內(nèi)含子外顯子分析結(jié)果(圖5)表明,BCAT1 和BCAT3 含有9 個(gè)內(nèi)含子,BCAT2、BCAT4 和BCAT5 分別含有8、18、4 個(gè)內(nèi)含子。BCAT1 的內(nèi)含子序列最長(zhǎng),將近17 kb;BCAT2 的內(nèi)含子序列最短,僅有2 kb左右。

      圖5 CcBCATs 基因的結(jié)構(gòu)Fig.5 Structure of CcBCAT genes

      2.2 CcBCATs 啟動(dòng)子區(qū)域順式作用元件分析

      啟動(dòng)子控制著基因的時(shí)空表達(dá),對(duì)基因的調(diào)控具有重要作用。辣椒BCAT 基因家族成員啟動(dòng)子順式作用元件如圖6 所示,BCAT基因家族成員啟動(dòng)子區(qū)域含有14 種啟動(dòng)子,如光響應(yīng)元件、茉莉酸響應(yīng)元件、低溫響應(yīng)元件等常見啟動(dòng)子。BCAT1-5 啟動(dòng)子區(qū)域均發(fā)現(xiàn)MYB 轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)。

      圖6 CcBCAT 基因家族成員啟動(dòng)子區(qū)域順式元件分析Fig.6 Cis-acting elements analysis for the promoter of CcBCAT gene family members

      2.3 CcBCATs 基因家族成員理化性質(zhì)和亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)

      CcBCATs 蛋白的理化性質(zhì)如表3,CcBCATs編碼氨基酸序列長(zhǎng)度在184 aa(CcBCAT5)至557 aa(CcBCAT4),分子量 在20 289.41 u(CcBCAT5)至89 598.03 u(CcBCAT4),等電點(diǎn)從5.57(CcBCAT5)至8.34(CcBCAT2),疏水性系數(shù)均為負(fù)值,為親水性蛋白。亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)顯示,CcBCAT1基因編碼的蛋白定位在葉綠體和線粒體,其他CcBCAT 家族基因編碼的蛋白均定位在葉綠體,這與番茄中BCAT基因定位結(jié)果[13]一致。

      表3 中國(guó)辣椒CcBCAT 基因家族分布及理化性質(zhì)分析Table 3 Basic information of BCAT family genes in Capsicum chinense

      2.4 CcBCATs 基因保守基序分析

      在線軟件MEME 對(duì)CcBCATs 基因保守基序(Motif)分析結(jié)果表明,CcBCAT 蛋白中含有8個(gè)保守基序,有著相似的保守基序組成的辣椒BCAT 基因家族成員可能有著相似功能。其中基序4 和基序7 共同組成Aminotran_4 結(jié)構(gòu)域(圖7),除CcBCAT5基因不含有此結(jié)構(gòu)域,其他辣椒BCAT基因家族成員均含有。對(duì)應(yīng)MEME 預(yù)測(cè)的辣椒中基序1、基序2、基序4 和基序7 均為4 個(gè)基因成員含有,其中CcBCAT4 不含基序1 和基序2、CcBCAT5 不含基序4 和基序7。

      圖7 CcBCAT 蛋白質(zhì)Motif 分析Fig.7 Protein motif analysis of CcBCAT protein

      2.5 CcBCATs 基因蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)和三級(jí)結(jié)構(gòu)分析

      CcBCAT基因家族成員蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)分析結(jié)果(圖8)表明,5 個(gè)基因家族成員均有α-螺旋、延伸鏈、β-轉(zhuǎn)角和無規(guī)則卷曲4 種結(jié)構(gòu)元件。CcBCAT4 的α-螺旋占比(34.83%)高于其他4 個(gè)基因家族成員;CcBCAT5 延伸鏈占比高于其他4 個(gè)基因家族成員,β-轉(zhuǎn)角則相反;5個(gè)基因家族成員蛋白的無規(guī)則卷曲數(shù)量占比一致(表4)。

      圖8 CcBCAT 蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)分析結(jié)果Fig.8 Prediction analysis of the secondary structure of CcBCAT protein

      表4 CcBCATs 蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)元件Table 4 Secondary structure of CcBCATs proteins

      CcBCAT基因家族成員蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)、活性位點(diǎn)和配體預(yù)測(cè)如圖9 所示,其蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)外型相似,活性位點(diǎn)均在蛋白質(zhì)腔體內(nèi)部。配體預(yù)測(cè)結(jié)果顯示BCAT1-4 的配體均為4-甲基-2-氧戊酸,BCAT5 則沒有合適配體。

      圖9 CcBCAT 蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)分析結(jié)果Fig.9 Prediction analysis of the tertiary structure of CcBCAT protein

      2.6 CcBCAT 基因家族成員時(shí)空表達(dá)量分析

      CcBCAT基因家族成員時(shí)空表達(dá)量分析如圖10 所示,辣椒BCAT基因家族成員在不同組織表達(dá)情況分析發(fā)現(xiàn):CcBCAT1在F1 期表達(dá)量最高,CcBCAT2在花中的表達(dá)量最高,CcBCAT3、CcBCAT4在成熟辣椒中表達(dá)量最高,CcBCAT5在根、莖、葉、花和果實(shí)中均沒有表達(dá)。

      圖10 CcBCAT 基因在不同組織及果實(shí)發(fā)育中的表達(dá)情況Fig.10 Expression of CcBCAT genes in different tissues and developing fruits

      對(duì)BCAT基因家族成員在辣椒果實(shí)成熟過程基因表達(dá)量進(jìn)行分析,結(jié)果顯示,CcBCAT1表達(dá)量在辣椒果實(shí)成熟過程中呈現(xiàn)逐步下調(diào)的趨勢(shì)并在成熟果實(shí)中達(dá)到最低值,CcBCAT2和CcBCAT3的表達(dá)量在辣椒發(fā)育過程中呈現(xiàn)先下降后升高并在成熟果實(shí)中達(dá)到峰值,CcBCAT4表達(dá)量在辣椒發(fā)育成熟過程中逐步提升并在成熟果實(shí)中達(dá)到最高。

      2.7 CcBCAT1~CcBCAT4 基因克隆

      根 據(jù)CcBCAT1~CcBCAT4的CDS 序列設(shè) 計(jì)PCR 特異引物,以cDNA 為模板,對(duì)目標(biāo)基因進(jìn)行PCR 擴(kuò)增,獲得長(zhǎng)度約為2 000 bp 大小的片段(圖11)。片段膠回收,連載體轉(zhuǎn)入大腸桿菌中,將PCR 陽性菌落送測(cè)序,測(cè)序序列與目標(biāo)參考序列進(jìn)行比對(duì),CcBCAT1、CcBCAT2和CcBCAT4克隆序列與模板序列完全一致;CcBCAT3則顯示第18、23、225 和903 處有單個(gè)堿基突變,造成CcBCAT3 氨基酸序列第8 處的纈氨酸(V)變成丙氨酸(A)。

      圖11 CcBCAT1~CcBCAT4 基因擴(kuò)增結(jié)果Fig.11 Amplification result of CcBCAT1~CcBCAT4 genes

      3 討論

      BCAT基因家族作為一個(gè)小基因家族,最早于擬南芥中開始研究,是生物體內(nèi)支鏈氨基酸代謝的重要一環(huán),對(duì)辣椒合成相關(guān)支鏈氨基酸衍生物如辣椒素[23]和支鏈酯[7,24]等應(yīng)對(duì)生物及非生物脅迫具有重要意義,在擬南芥[10-11]、番茄[14]、水稻[6]和小麥[15]中均有報(bào)道。本研究從中國(guó)辣椒基因組中鑒定出5 個(gè)BCAT基因,發(fā)現(xiàn)CcBCAT1~CcBCAT3在進(jìn)化關(guān)系上分別與番茄[14]SlBCA-T1-3 高度同源;CcBCAT4雖然在進(jìn)化樹位置上呈現(xiàn)獨(dú)立進(jìn)化,但是CcBCAT4的氨基酸序列擁有BCAT 基因的Aminotran_4 結(jié)構(gòu)域,并且配體預(yù)測(cè)結(jié)果與4-甲基-2-氧戊酸[7]底物特異性結(jié)合;CcBCAT5則與擬南芥AtBCAT1同源性較高。CcBCAT 亞細(xì)胞定位結(jié)果顯示,除CcBCAT1 定位在葉綠體或線粒體,其他均在葉綠體中,符合支鏈氨基酸轉(zhuǎn)氨酶亞細(xì)胞定位結(jié)果[6,14]。因此所鑒定出的5 個(gè)CcBCAT基因與經(jīng)過驗(yàn)證的BCAT[6,10-11,14-15]基因序列特征相似,具有支鏈氨基酸轉(zhuǎn)氨酶蛋白的主要特征。

      啟動(dòng)子是一段位于結(jié)構(gòu)基因5′端上游區(qū)的DNA 序列,決定基因的表達(dá)與否。對(duì)啟動(dòng)子的研究有利于了解CcBCAT基因的調(diào)控模式和對(duì)外界環(huán)境的響應(yīng)。啟動(dòng)子順式元件分析顯示,辣椒BCAT基因家族成員基因在啟動(dòng)子區(qū)域具有多種順式作用元件,包括調(diào)控辣椒素及次生代謝物合成的MYB 轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合區(qū)域。MYB 轉(zhuǎn)錄因子是植物中第一大類轉(zhuǎn)錄因子家族,廣泛參與調(diào)控植物次生代謝物合成,對(duì)植物抵御外界生物脅迫[25-27]和非生物脅迫具有重要意義。例如,2014年Li等[28]發(fā)現(xiàn)蘋果MYB1 和MYB6 可以與蘋果AAT2 啟動(dòng)子區(qū)域的MYB 位點(diǎn)結(jié)合,增強(qiáng)其轉(zhuǎn)錄活性;2019年Zhu 等[29]發(fā)現(xiàn)MYB31基因能激活辣椒合成途徑相關(guān)基因,使辣椒素得以合成積累,2022 年Zhang 等[30]對(duì)辣椒素合成途徑相關(guān)基因啟動(dòng)子區(qū)域分析,發(fā)現(xiàn)多個(gè)功能基因上游均有MYB 結(jié)合位點(diǎn)。還有研究發(fā)現(xiàn),蘋果中BCAT 參與了蘋果支鏈酯合成[31]。結(jié)合本研究結(jié)果和已有文獻(xiàn)推測(cè),CcBCAT 可能在辣椒素和相關(guān)酯類物質(zhì)合成中起到重要作用。

      基因的表達(dá)量是影響蛋白表達(dá)豐度進(jìn)而影響相應(yīng)酶功能的重要因素。對(duì)CcBCAT基因的表達(dá)分析顯示其存在組織特異性表達(dá),且在果實(shí)的不同發(fā)育時(shí)期表達(dá)規(guī)律也有所差異。CcBCAT5 雖然有完整的開放閱讀框、能編碼完整的蛋白,但是在所有組織器官中均檢測(cè)不到表達(dá),這一結(jié)果與番茄中SlBCAT5-6 表達(dá)模式[32]一致。但CcBCAT5是否是一個(gè)假基因還需要進(jìn)一步驗(yàn)證。CcBCAT4 僅在辣椒花和果實(shí)中有表達(dá),并且隨著果實(shí)的生長(zhǎng)表達(dá)量不斷提高,與辣椒素積累量[33]、辣椒揮發(fā)性有機(jī)物質(zhì)積累量呈正相關(guān),推測(cè)其參與中國(guó)辣椒的辣椒素合成,該結(jié)果與Zhang 等[30]、Zhang 等[34]和Kim 等[23]研究結(jié)果一致,而番茄果實(shí)中BCAT 則一直呈現(xiàn)低水平表達(dá)[14]。CcBCAT2 和CcBCAT3 的表達(dá)模式相似,辣椒果實(shí)發(fā)育時(shí)兩者的表達(dá)量變化一致,CcBCAT2 和CcBCAT3 兩者之間有可能與擬南芥AtBCAT3-4的關(guān)系[12-13]相似,參與蛋氨酸碳鏈延長(zhǎng)步驟中的一環(huán),不過兩者的功能和相關(guān)性還需要更多實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行支撐。

      4 結(jié)論

      通過生物信息學(xué)的方法鑒定出中國(guó)辣椒基因組中5 個(gè)BCAT 基因,并對(duì)其蛋白質(zhì)理化性質(zhì)、二級(jí)結(jié)構(gòu)、三級(jí)結(jié)構(gòu)、活性位點(diǎn)、配體和時(shí)空表達(dá)特異性等進(jìn)行分析,克隆出CcBCAT1~CcBCAT4等4 個(gè)關(guān)鍵基因。結(jié)果表明中國(guó)辣椒BCAT 基因家族是一個(gè)結(jié)構(gòu)復(fù)雜的小基因家族,除CcBCAT5可能是個(gè)假基因,其他基因的表達(dá)均有特異性,如CcBCAT4在辣椒果實(shí)中表達(dá)模式與辣椒素和相關(guān)揮發(fā)性代謝物積累模式一致,有可能參與支鏈氨基酸衍生物合成。本研究將有利于推進(jìn)辣椒支鏈氨基酸代謝研究,為辣椒風(fēng)味品質(zhì)提升提供數(shù)據(jù)支持。

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