茄子TCP 轉(zhuǎn)錄因子的鑒定及脅迫處理下的表達(dá)分析

梅文宇，方燕芬，宮 超，麥培婷，孫保娟，李植良，李 濤，孫光聞

（1.廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所/廣東省蔬菜新技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510640；2.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，廣東 廣州 510642）

【研究意義】TCP 轉(zhuǎn)錄因子是植物中特有的一類轉(zhuǎn)錄因子，能夠響應(yīng)激素、營(yíng)養(yǎng)元素、生物和非生物逆境脅迫，在激素介導(dǎo)的植物細(xì)胞增殖及器官發(fā)育中起著重要作用［1］。【前人研究進(jìn)展】1999 年Cubas 等通過(guò)分析金魚草草（Antirrhinum majus）中的CYC（CYCLOIDEA）蛋白與玉米中的TB1（TEOSINTE BRANCHED1）蛋白保守區(qū)域的二級(jí)結(jié)構(gòu)，確定了一個(gè)相對(duì)保守的堿性螺旋-環(huán)-螺 旋（basic helixloop-helix,bHLH）結(jié)構(gòu)域，并利用首批成員金魚草CYC、玉米TB1 及水稻的PROLIFERATING CELL FACTOR 1 和2（PCF1/ 2）將該家族正式命名為TCP 家族［2］。TCP 家族基因都具備由59 個(gè)氨基酸組成的bHLH結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)也被稱為TCP 結(jié)構(gòu)域，TCP 結(jié)構(gòu)域主要參與DNA 結(jié)合、蛋白互作［3］。根據(jù)核定位序列以及bHLH 結(jié)構(gòu)域第二個(gè)螺旋的長(zhǎng)度等方面的差異，可將TCP 轉(zhuǎn)錄因子分為Class ⅠTCP 和Class ⅡTCP［4］，I 類和II 類都包含轉(zhuǎn)錄激活因子和轉(zhuǎn)錄抑制因子［1］。根據(jù)TCP 結(jié)構(gòu)域內(nèi)序列的不同，Class ⅡTCP 又可以進(jìn)一步分為CYC/TB1類TCP 與CINCINNATA（CIN）類TCP［5］。相關(guān)研究已經(jīng)證明TCP 家族在各種植物中普遍存在，目前已經(jīng)在擬南芥、水稻［5］、玉米［6］、小麥［7］、蘋果［8］、黃瓜［9］、番茄［10］等多種植物中對(duì)TCP 家族成員完成了鑒定。近年來(lái)，隨著相關(guān)研究的開(kāi)展發(fā)現(xiàn)TCP 轉(zhuǎn)錄因子在植物的整個(gè)生長(zhǎng)周期都有著重要作用，從種子萌發(fā)、器官分化發(fā)育、脅迫響應(yīng)到激素調(diào)節(jié)等都離不開(kāi)TCP 家族的參與［11］。在擬南芥中，UP1 是調(diào)節(jié)擬南芥腋芽生長(zhǎng)的必須順式元件，AtTCP14能夠直接激活維管組織UP1 介導(dǎo)的與發(fā)芽相關(guān)的基因表達(dá)調(diào)控胚胎生長(zhǎng)［12］。AtTCP4能夠通過(guò)調(diào)控轉(zhuǎn)錄激活抑制因子GIS（GLABROUS INFLORESCENCE STEMS)基因的表達(dá)抑制調(diào)節(jié)南芥葉片和花序莖的毛狀細(xì)胞的分支［13］。TCP 蛋白能夠直接與MYB-bHLHWD40（MBW）中關(guān)鍵成分GLABRA3（GL3）相互作用，干擾擬南芥子葉毛狀體的發(fā)育［14］。高溫下，擬南芥AtTCP5、AtTCP13、AtTCP17能與PIF4（PHYTOCHROMEINTER ACTING FACTOR 4）互作，增強(qiáng)其活性，促進(jìn)擬南芥的熱形態(tài)建成（下胚軸和葉柄的伸長(zhǎng)）來(lái)適應(yīng)高溫［15-16］。在激素通路上，TCP 轉(zhuǎn)錄因子在生長(zhǎng)素［17］、赤霉素［18］、細(xì)胞分裂素［19］、脫落酸［20］、茉莉酸［21］、油菜素內(nèi)酯［22］及水楊酸［23］等多種激素的生物合成、運(yùn)輸及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑上存在調(diào)控作用。【本研究切入點(diǎn)】茄子（Solanum melongenaL.），一年生草本植物，原產(chǎn)溫帶與亞熱帶，其營(yíng)養(yǎng)豐富，具有較高的食用與藥用價(jià)值，也是僅位于馬鈴薯、番茄、辣椒后的第四大茄科作物［24］。隨著茄果類基因組測(cè)序計(jì)劃的完成，使得從基因組水平對(duì)茄果類重要基因家族及重要功能基因的分析和分子標(biāo)記的開(kāi)發(fā)成為可能，鑒于TCP 家族在植物生長(zhǎng)發(fā)育及環(huán)境適應(yīng)上的重要性，深入研究TCP家族在逆境下的表達(dá)情況及不同器官間的表達(dá)差異，將有利于解析TCP 家族逆境響應(yīng)機(jī)制及其在植物生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中的重要作用。【擬解決的關(guān)鍵問(wèn)題】本研究利用生物信息學(xué)方法對(duì)茄子TCP基因進(jìn)行預(yù)測(cè)、挖掘，并對(duì)茄子TCP 基因在脅迫及激素處理下進(jìn)行表達(dá)分析，以期為深入研究茄子TCP 基因的功能分析提供基礎(chǔ)信息，進(jìn)而為分子植物育種提供候選基因。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)在廣東省蔬菜新技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行，挑選飽滿的茄子R06112 種子，10%次氯酸鈉消毒20 min，隨后用無(wú)菌水沖洗干凈，播種于1/2MS 固體培養(yǎng)基中，放置于光照培養(yǎng)箱，每日設(shè)置光照16 h、黑暗8 h，溫度25 ℃，20 d 后，茄子植株生長(zhǎng)至四片真葉階段時(shí)對(duì)植株進(jìn)行脅迫及激素處理。不同器官組織表達(dá)材料種植于廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院白云基地，約2～3 個(gè)月后結(jié)出幼果，對(duì)同一發(fā)育時(shí)期的根、莖、葉、花及果各器官進(jìn)行采樣。

1.2 試驗(yàn)方法

在1/2MS 培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上開(kāi)展脅迫處理和激素處理。非生物脅迫處理包括42 ℃高溫處理、4 ℃低溫處理、NaCl 處理（濃度為200 mmol/L）、CdCl2處理（濃度為100 μmol/L）；生物脅迫處理包括青枯菌處理，所有對(duì)照均為未經(jīng)任何處理的茄子苗。激素處理包括ABA（100 μmol·/L）和SA（5 mmol/L）處理：分別將ABA、SA 兩種溶液噴灑于葉片，以噴施蒸餾水的葉片為對(duì)照，對(duì)所有處理的植株分0、1、2、8 h 時(shí)間段的整株取樣，3 次重復(fù)取樣，取樣后立即置于液氮中，–80 ℃保存，用于激素及脅迫下的茄子TCP 基因的響應(yīng)表達(dá)。器官組織取樣于播種后約60 d 的茄子植株，分別取同一發(fā)育時(shí)期根、莖、葉、花、果等5 個(gè)器官組織，用純凈水洗凈，置于液氮中，用于進(jìn)行茄子TCP 基因的器官組織表達(dá)。

1.3 茄子基因家族序列檢索和鑒定

番茄和擬南芥的TCP 基因家族成員下載自茄果類數(shù)據(jù)庫(kù)SGN（https：//solgenomics.net/）、擬南芥生物信息庫(kù)TAIR（https：//www.arabidopsis.org/），利用已知的擬南芥和番茄的蛋白序列為參考在茄子的全基因組數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行blastp，設(shè)置E-value 參數(shù)為0.001，得到候選的茄子TCP蛋白序列。并利用Pfam（http：//pfam.xfam.org/）和SMART（http：//smart.embl-heidelberg.de/）對(duì)其去除無(wú)DNA 結(jié)合結(jié)構(gòu)域和激活或抑制結(jié)構(gòu)域的基因。在SGN（https：//solgenomics.net/）中的茄子基因信息GFF3 文件（assembly gff3 file）中提取SmTCP的染色體位置，并使用MapChart軟件繪制家族基因的染色體位置。利用在線工具ProtParam（https：//web.expasy.org/protparam/）和BUSCA（http：//busca.biocomp.unibo.it/）預(yù) 測(cè)蛋白的理化性質(zhì)，SOPMA2.0 軟件預(yù)測(cè)二級(jí)結(jié)構(gòu)，采用Phyre2.0 進(jìn)行同源建模分析。利用茄子TCP 成員各自對(duì)應(yīng)氨基酸序列，在網(wǎng)站 BUSCA（http://busca.biocomp.unibo.it/）和網(wǎng)站 Expasy 的ProtParam 工具（https://web.expasy.org/protparam/）分別得到茄子TCP 成員的亞細(xì)胞定位和茄子TCP成員的等電點(diǎn)（pI）和分子量（Mw）。

1.4 茄子TCP 的分類及系統(tǒng)進(jìn)化分析

使用默認(rèn)設(shè)置的ClustalX（Version 2.1）軟件對(duì)茄子、番茄和擬南芥的序列進(jìn)行比對(duì)，再運(yùn)用MEGA7 中的鄰近法（Neighbor Joining，NJ），構(gòu)建茄子、番茄與擬南芥的TCP 基因的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，使用1 000 個(gè)重復(fù)進(jìn)行bootstrap 分析，并根據(jù)擬南芥的分類方法為茄子TCP 成員進(jìn)行分類。

1.5 保守基序的鑒定及結(jié)構(gòu)分析

利用MEME 4.6.1（http：meme.nbcr.net/meme/intro.html）在線平臺(tái)進(jìn)行茄子TCP 蛋白中保守基序（motif）分析，最大motif 檢索數(shù)值定為20。并確定基序的P 值、E 值和基序在茄子TCP 家族基因中出現(xiàn)的次數(shù)。

1.6 TCP 家族基因的表達(dá)分析

分子生物學(xué)試驗(yàn)在廣東省蔬菜新技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室完成。采用Trizol（Invitrogen）法提取總 RNA，經(jīng)DNase I 處理去除基因組DNA，使用NanoDrop 2000c 分光光度計(jì)（Thermo）檢測(cè)RNA 樣品的濃度和純度。吸取1 μg RNA，反轉(zhuǎn)錄合成第1 鏈cDNA，稀釋4 倍后做qRTPCR 模板。根據(jù)獲得的SmTCP基因的cDNA 序列及SGN 數(shù)據(jù)庫(kù)基因序列的比對(duì)結(jié)果，利用Oligo6.0 設(shè)計(jì)引物（表1），由英濰捷基（上海）生物公司合成。熒光實(shí)時(shí)定量PCR 反應(yīng)采用SYBR Green Realtime PCR Master Mix（Takara，大連）試劑盒，在Roche LightCycler 480 儀器進(jìn)行。反應(yīng)體系為總體積10.0 μL，含 SYBR Premix ExTaqTM Ⅱ（TliRNaseH Plus）（2×）5 μL、引物（10 μmol/L）各0.4 μL、cDNA 模 板1.0 μL、無(wú)菌雙蒸餾水3.2 μL。反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性30 s；95 ℃變性5 s，60 ℃退火20 s，循環(huán)40 次；融解曲線分析95 ℃ 0 s，65 ℃ 15 s，95 ℃ 0 s。采用2-ΔΔCT 方法計(jì)算非生物脅迫、激素處理以及各器官組織中的基因相對(duì)表達(dá)量，每個(gè)基因的表達(dá)反應(yīng)3 次重復(fù)，以SmActin作為內(nèi)參基因。

2 結(jié)果與分析

2.1 茄子TCP 基因家族成員的鑒定及理化特性

通過(guò)對(duì)茄子TCP 基因家族成員進(jìn)行篩選，最終確定32 個(gè)SmTCP基因，暫將其命名為SmTCP1～SmTCP32（表1）。編 碼SmTCP蛋 白的氨基酸數(shù)目從111 個(gè)（SmTCP3）到850 個(gè)（SmTCP20），分子量從14 924.09 Da（SmTCP7）到89 598.03 Da（SmTCP3），等電點(diǎn)為5.25～10.03。這些蛋白的氨基酸長(zhǎng)度和蛋白特性差異均較大，表明TCP 家族成員特性不同，在生物學(xué)進(jìn)程中發(fā)揮不同的作用。二級(jí)結(jié)構(gòu)分析顯示，這些蛋白α-螺旋所占蛋白序列比例范圍是24.48%，β-折疊所占蛋白序列比例范圍是7.38%，無(wú)規(guī)則卷曲所占蛋白序列比例范圍是50.30%，延伸鏈的范圍是17.84%，表明這些蛋白由這4 種結(jié)構(gòu)組成，且無(wú)規(guī)則卷曲是主要的存在形式。

表1 茄子TCP 轉(zhuǎn)錄因子家族分布及理化性質(zhì)Table 1 Distribution and physicochemical properties of TCP transcription factor family in eggplant

SmTCP基因所在的染色體物理位置定位分析顯示，32 個(gè)基因隨機(jī)不均勻分布在茄子12 條染色體上（4 號(hào)染色體除外）。分析發(fā)現(xiàn)，SmTCP基因大多位于染色體兩端，僅3 號(hào)染色體上的基因位于染色體中部。此外，1 號(hào)染色體上的基因1和基因2 所在的物理位點(diǎn)較近。

2.2 茄子TCP 家族基因蛋白質(zhì)系統(tǒng)進(jìn)化分析

為研究茄子TCP 家族蛋白的進(jìn)化關(guān)系，對(duì)擬南芥、番茄和茄子TCP 家族氨基酸進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析（圖1），TCP 家族整體分為Class Ⅰ和Class Ⅱ兩類，Class Ⅱ又分為CIN 亞家族和CYC/TB1 亞家族，相同類型的TCP 基因在進(jìn)化樹(shù)圖中更相近，擬南芥的基因各亞類中基本聚類在一起，而番茄和茄子的TCP 基因間的聚類較擬南芥相離較近；在Class Ⅰ中，茄子和番茄TCP 基因有4個(gè)聚類在一起的分支（如SmTCP7和SmTCP13、SmTCP15和SmTCP21、SmTCP1和SmTCP15、SmTCP1和SmTCP21）。茄子和擬南芥TCP 基因之間有3 個(gè)聚類在一起的分支（如SmTCP11和AtTCP20、SmTCP18和AtTCP6、SmTCP32和AtTCP8）。茄子TCP 基因之間有5 個(gè)聚類在一起的分支（如SmTCP7和SmTCP13、SmTCP15和SmTCP21、SmTCP1和SmTCP15、SmTCP1和SmTCP21）。

圖1 茄子、擬南芥和番茄中TCP 基因家族進(jìn)化樹(shù)Fig.1 Phylogenetic tree of TCP gene families in eggplant,Arabidopsis and tomato

在Class Ⅱ中CIN 亞家族中，茄子和番茄TCP 基因有11 個(gè)聚類在一起的分支（如SmTCP22和SlTCP10、SmTCP29和SlTCP3、SmTCP23和SlTCP2、SmTCP2和SlTCP1、SmTCP17和SlTCP30、SmTCP8和SlTCP28、SmTCP9和SlTCP5、SmTCP14和SlTCP4、SmTCP20和SlTCP6、SmTCP24和SlTCP24、SmTCP25和SlTCP29）；茄子和擬南芥中只有3個(gè)聚類在一起的分支（SmTCP22和AtTCP10、SmTCP29和AtTCP10）。茄 子TCP 基因之 間也只有3 個(gè)聚類在一起的分支，如SmTCP2和SmTCP17、SmTCP14和SmTCP20、SmTCP24和SmTCP25；在Class Ⅱ中YC/TB1 亞家族中，有6 個(gè)SmTCP基因。其中茄子和番茄TCP 基因中，包含3 個(gè)聚類在一起的分支，如SmTCP16和SlTCP9、SmTCP30和SlTCP22、SmTCP28和SlTCP25；茄子和擬南芥的沒(méi)有聚類在一起的分支。茄子TCP 基因中SmTCP5和SmTCP10二者聚類在一起。

2.3 茄子TCP 家族蛋白基序分析

為進(jìn)一步分析茄子TCP 蛋白質(zhì)氨基酸的保守性，利用MEME 4.6.1 保守基序（motif）分析結(jié)果表明，在TCP 家族家族中含有20 個(gè)保守基序（表2），通常聚類分析在一個(gè)亞族的蛋白質(zhì)有著相似的motif 組成，其中基序1～3 共同組成TCP 結(jié)構(gòu)域（圖2），基本出現(xiàn)在所有茄子的TCP 家族中；本研究根據(jù)擬南芥的分類標(biāo)準(zhǔn)將茄子TCP 家族分為兩類，其中Class Ⅱ又分為CIN 亞家族和CYC/TB1 亞家族；根據(jù)擬南芥中Class Ⅰ的保守基序，預(yù)測(cè)茄子中該基序?qū)?yīng)MEME 預(yù)測(cè)的基序1，共有30 個(gè)成員；本研究發(fā)現(xiàn)在番茄中CIN 亞家族和CYC/TB1 亞家族分別對(duì)應(yīng)茄子的基序2 和基序3；根據(jù)擬南芥TCP 家族基序?qū)⑶炎覶CP 分為Class Ⅰ和Class Ⅱ兩類，Class Ⅱ又分為CIN 亞家族（對(duì)應(yīng)茄子基序2）和CYC/TB1 亞家族（對(duì)應(yīng)茄子基序3）；其中這兩個(gè)亞家族含有TCP 蛋白序列數(shù)目不同，CIN 亞家族含有的蛋白序列最多（圖1、表2）。

圖2 茄子TCP 家族基因結(jié)構(gòu)及保守基序Fig.2 Gene structure and conserved motifs of TCP family genes in eggplant

表2 MEME 對(duì)茄子TCP 蛋白中的基序分析Table 2 Motif analysis of TCP protein in eggplant by MEME

2.4 茄子TCP 基因家族在非生物脅迫、生物脅迫及激素處理下的表達(dá)

為檢測(cè)茄子TCP 基因?qū)γ{迫和激素處理的應(yīng)答反應(yīng)，本文利用Q-PCR 分析了28 個(gè)SmTCP基因（SmTCP5、SmTCP10、SmTCP32在樣品中表達(dá)量過(guò)低、SmTCP12在全部樣品中沒(méi)有表達(dá)數(shù)據(jù)可能為假基因），在低溫（4 ℃）、高溫（42 ℃）、鹽、重金屬鎘、青枯菌脅迫處理（圖3～圖7）以及ABA 和SA 的處理下的表達(dá)模式（圖8、圖9）。結(jié)果顯示，在非生物脅迫處理的0～8 h，茄子TCP家族的表達(dá)均出現(xiàn)一些不同的趨勢(shì)，其中高溫處理相對(duì)于低溫處理對(duì)茄子TCP 家族表達(dá)影響更大（圖3）。在低溫處理?xiàng)l件下，大多數(shù)TCP 家族成員表達(dá)量并未出現(xiàn)明顯變化，僅存在部分成員存在短暫升高后趨于正常的趨勢(shì)（SmTCP4、SmTCP16、SmTCP21、SmTCP22、SmTCP24、SmTCP27、SmTCP29、SmTCP31）。

圖3 茄子TCP 家族成員在低溫脅迫下的表達(dá)分析Fig.3 Expression analysis of TCP family members in eggplant under low temperature stress

如圖4 所示，在高溫處理下多數(shù)成員呈現(xiàn)表達(dá)量持續(xù)增加的趨勢(shì)（SmTCP1、SmTCP3、SmTCP4、SmTCP6、SmTCP7、SmTCP8、SmTCP11、SmTCP19、SmTCP20、SmTCP21、SmTCP24、SmTCP31），還有部分成員表達(dá)量呈先升高后降低的趨勢(shì)（SmTCP2、SmTCP22、SmTCP26、SmTCP27、SmTCP29）。

圖4 茄子TCP 家族成員在高溫脅迫下的表達(dá)分析Fig.4 Expression analysis of TCP family members in eggplant under high temperature stress

與冷、熱處理不同的是，鹽處理與重金屬鎘處理后的茄子TCP 家族成員表達(dá)趨勢(shì)較為相近。如圖5 所示，鹽處理下，SmTCP1、SmTCP2、SmTCP4、SmTCP6、SmTCP8、SmTCP9、SmTCP13、SmTCP21、SmTCP22、SmTCP23、SmTCP26、SmTCP28、SmTCP29在0～8 h 內(nèi)表現(xiàn)出先增加后減少的趨勢(shì)，SmTCP3、SmTCP11、SmTCP24、SmTCP25、SmTCP27、SmTCP30則表現(xiàn)出持續(xù)上調(diào)的趨勢(shì)。

圖5 茄子TCP 家族成員在鹽脅迫下的表達(dá)分析Fig.5 Expression analysis of TCP family members in eggplant under salt stress

如圖6 所示，鎘處理下，SmTCP1、SmTCP4、SmTCP9、SmTCP13、SmTCP23、SmTCP26、SmTCP28、SmTCP29的相對(duì)處理表達(dá)量在0～8 h 內(nèi)表現(xiàn)出先增加后減少的趨勢(shì)，SmTCP3、SmTCP6、SmTCP11、SmTCP15、SmTCP24、SmTCP25、SmTCP30表現(xiàn)出持續(xù)上調(diào)的趨勢(shì)。

圖6 茄子TCP 家族成員在鎘脅迫下的表達(dá)分析Fig.6 Expression analysis of TCP family members in eggplant under cadmium stress

對(duì)茄子進(jìn)行青枯菌處理下TCP 家族成員表達(dá)的結(jié)果顯示（圖7），茄子TCP 家族在青枯菌處理下，SmTCP1、SmTCP9、SmTCP11、SmTCP17、SmTCP19、SmTCP24、SmTCP27、SmTCP30均存在較為明顯的上調(diào)，SmTCP2、SmTCP3、SmTCP4、SmTCP6、SmTCP7、SmTCP8、SmTCP16等則短暫下調(diào)后逐漸恢復(fù)正常，其余成員在青枯菌處理下表達(dá)并未受到較大波動(dòng)。

圖7 茄子TCP 家族成員在青枯菌處理下的表達(dá)分析Fig.7 Expression analysis of TCP family members in eggplant under Pseudomonas a solanacearum treatment

對(duì)茄子進(jìn)行激素（ABA 和SA）處理下TCP家族表達(dá)的結(jié)果顯示（圖8、圖9），茄子TCP家族整體表達(dá)變化并不如脅迫處理明顯。其中ABA 處理下SmTCP1、SmTCP3、SmTCP6、SmTCP7、SmTCP11、SmTCP19、SmTCP24、SmTCP27存在持續(xù)上調(diào)的表現(xiàn)，SmTCP13、SmTCP16持續(xù)下調(diào)。

圖8 茄子TCP 家族成員在ABA 處理?xiàng)l件下的表達(dá)分析Fig.8 Expression analysis of TCP family members in eggplant under ABA treatment

圖9 茄子TCP 家族成員在SA 處理?xiàng)l件下的表達(dá)分析Fig.9 Expression analysis of TCP family members in eggplant under SA treatment

與ABA 處理不同的是，SA 處理后的茄子TCP 家族表達(dá)量整體呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，其中僅SmTCP8、SmTCP17存在上調(diào)表現(xiàn)，SmTCP2、SmTCP20、SmTCP21、SmTCP22、SmTCP28、SmTCP29、SmTCP30則呈現(xiàn)持續(xù)下調(diào)。

2.5 茄子TCP 基因家族在不同器官的表達(dá)

對(duì)28 個(gè)SmTCP成員進(jìn)行組織表達(dá)分析發(fā)現(xiàn)，除SmTCP13在莖中沒(méi)有表達(dá)外，其他27 個(gè)SmTCP在根、莖、葉、花、果中均有表達(dá)，但在不同器官內(nèi)表達(dá)情況存在明顯差異。其中在根中SmTCP成員表達(dá)量明顯低于其他器官，僅SmTCP6、SmTCP11在根中表達(dá)較高，SmTCP1、SmTCP3、SmTCP6、SmTCP11、SmTCP16、SmTCP19、SmTCP21、SmTCP31在莖中的表達(dá)量較高，SmTCP1、SmTCP7、SmTCP9、SmTCP14、SmTCP15、SmTCP19、SmTCP20、SmTCP22、SmTCP24、SmTCP25、SmTCP27、SmTCP29、SmTCP30在葉中的表達(dá)量較高，SmTCP1、SmTCP3、SmTCP8、SmTCP16、SmTCP27在花中的表達(dá)量較高，SmTCP2、SmTCP4、SmTCP7、SmTCP13、SmTCP17、SmTCP18、SmTCP23、SmTCP26、SmTCP27、SmTCP28、SmTCP31在果中的表達(dá)量較高?？梢?jiàn)，SmTCPs在茄子的葉與果中表達(dá)量更高，這些基因可能與茄子葉片以及果實(shí)的發(fā)育相關(guān)。

3 討論

自1999 年Cubus 首次提出TCP 家族以來(lái)，隨著相關(guān)研究的開(kāi)展，目前TCP 轉(zhuǎn)錄因子已經(jīng)在多種植物中完成鑒定。本研究通過(guò)對(duì)茄子全基因組數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行檢索，共鑒定出32 個(gè)茄子TCP 基因家族成員，進(jìn)一步對(duì)茄子TCP 蛋白的理化性質(zhì)分析發(fā)現(xiàn)，氨基酸數(shù)量最少的為SmTCP3，由111個(gè)氨基酸組成；氨基酸數(shù)量最多的為SmTCP20、由850 個(gè)氨基酸組成。茄子TCP 蛋白平均氨基酸數(shù)量為315，19 位家族成員等電點(diǎn)大于7，13 位成員等電點(diǎn)小于7，證明茄子TCP 蛋白中堿性氨基酸數(shù)量多于酸性氨基酸。通過(guò)擬南芥、番茄、茄子TCP 轉(zhuǎn)錄因子家族基因的進(jìn)化樹(shù)分析，發(fā)現(xiàn)茄子與番茄的TCP基因序列相似性較高，茄子與番茄TCP 成員中有14 個(gè)聚類分支，而茄子與擬南芥中只出現(xiàn) 5 個(gè)聚類分支。番茄中的SlTCP26與茄子的SmTCP5及SmTCP26聚類在同一分支，Wei 等［25］發(fā)現(xiàn)SlTCP26基因在調(diào)控番茄的分支中具有必不可少的作用，該基因與ABA 與IAA參與的側(cè)枝分枝相關(guān)?？梢?jiàn)茄子中的SmTCP5和SmTCP26與IAA 與ABA 的信號(hào)途徑之間可能存在關(guān)聯(lián)。

圖10 SmTCPs 基因在茄子器官中的表達(dá)分析Fig.10 Expression analysis of SmTCPs genes in various organs of eggplant

TCP 轉(zhuǎn)錄因子在植物的生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中，起重要調(diào)控作用，不僅與植物生長(zhǎng)相關(guān)，還影響器官發(fā)育、環(huán)境適應(yīng)性的形態(tài)建成等。葉片是植物進(jìn)行光合作用的主要場(chǎng)所，由莖尖分生組織生成，擬南芥中的AtTCP3能夠直接調(diào)控miR164、AS1等基因的表達(dá)，從而抑制莖分生組織的形成，擬南芥中CIN 類TCP 在產(chǎn)生不同葉片形態(tài)的信號(hào)通路中發(fā)揮重要作用，且該類基因在調(diào)控葉片形狀的功能上高度冗余［26-27］。TCP 家族不僅參與葉片器官的發(fā)育，在花、側(cè)枝的發(fā)育中也發(fā)揮作用，在金魚草中CYC基因能夠調(diào)控花器官的對(duì)稱性發(fā)育，CYC突變體的金魚草花朵會(huì)產(chǎn)生半幅射狀的花朵［28］。在豌豆中TCP 轉(zhuǎn)錄因子PsBRC1能夠作用于獨(dú)腳金內(nèi)酯下游控制枝條的分支［29］。在自然環(huán)境中，隨著環(huán)境改變，植物需要通過(guò)改變自身的形態(tài)從而適應(yīng)環(huán)境，例如避蔭反應(yīng)、熱形態(tài)建成等從而順利地完成整個(gè)生活史［30］。在陰暗條件下，擬南芥中AtTCP5、AtTCP13、AtTCP17能夠通過(guò)直接介導(dǎo)光敏色素相互作用因子（PIFs）和生長(zhǎng)素合成基因的表達(dá)促進(jìn)下胚軸伸長(zhǎng)，其三重突變體在陰暗條件下的下胚軸伸長(zhǎng)長(zhǎng)度明顯降低［31］。AtTCP2能夠響應(yīng)藍(lán)光，正向調(diào)控?cái)M南芥HY5（ELONGATED HYPOCOTYL 5）/HYH（HY5-HOMOLOG）表達(dá)，并且AtTCP2能夠與擬南芥隱色素蛋白（cryptochrome,CRY）互作，影響植物的光形態(tài)建成［32］。在高溫下，AtTCP5、AtTCP13、AtTCP17通過(guò)與PIF4 互作，促進(jìn)擬南芥的熱形態(tài)建成［15-16］。本研究表明，各處理中茄子TCP 基因在熱脅迫、鹽脅迫及ABA處理下各成員響應(yīng)較為明顯，考慮到已有的報(bào)道中TCP 家族在脅迫響應(yīng)中的形態(tài)建成作用，推測(cè)TCP 家族成員可能參與茄子應(yīng)對(duì)不良環(huán)境的形態(tài)改變。器官組織表達(dá)結(jié)果顯示，在茄子葉片與果實(shí)中SmTCP表達(dá)量較其他組織更高，聯(lián)系已報(bào)道TCP 家族在植物葉片發(fā)育中的重要作用，SmTCP可能參與茄子葉片以及果實(shí)的發(fā)育。

植物在多種脅迫反應(yīng)下，會(huì)產(chǎn)生花青素作為保護(hù)色素［33］，例如強(qiáng)光條件下，花青素能夠保護(hù)細(xì)胞避免受損，在強(qiáng)光照射下，擬南芥AtTCP15及相關(guān)Class Ⅰ類TCP 能夠調(diào)節(jié)花青素的積累。此外，AtTCP15的TCP 結(jié)構(gòu)域中20 號(hào)半胱氨酸在氧化脅迫條件下能夠發(fā)生氧化，暗示TCP 蛋白可能參與ROS 介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程［34］。在高溫環(huán)境下，植物莖部伸長(zhǎng)從而適應(yīng)熱環(huán)境，這種反應(yīng)與PIF4、生長(zhǎng)素、熱形態(tài)建成之間存在緊密的聯(lián)系［35］，SAUR（Small auxin up-regulated RNA）是一類生長(zhǎng)素早期響應(yīng)基因，生長(zhǎng)素的升高會(huì)引起擬南芥下胚軸中SAUR 靶基因的表達(dá)，促進(jìn)下胚軸的伸長(zhǎng)［36］。正常溫度下，擬南芥AtTCP14、AtTCP15突變體中，SAUR19 亞家族中的SARU20、SAUR21表達(dá)不受影響，但在高溫環(huán)境下，突變體中該基因的表達(dá)會(huì)下調(diào)且下胚軸伸長(zhǎng)長(zhǎng)度會(huì)明顯短于野生型，證明SAUR基因在高溫環(huán)境下的響應(yīng)依賴AtTCP14與AtTCP15的表達(dá)［37］。綜合前文中提到Class ⅡTCP 中的AtTCP5、AtTCP13、AtTCP17與PIF4 發(fā)生互作，增強(qiáng)其轉(zhuǎn)錄活性促進(jìn)擬南芥的熱形態(tài)建成，表明TCP 是植物的熱形態(tài)建成過(guò)程中重要的調(diào)控因子。然而到目前為止，有關(guān)TCP 轉(zhuǎn)錄因子的研究仍然處于初始階段，大多數(shù)成員的功能尚不清晰。盡管越來(lái)越多的證據(jù)顯示，TCP 家族在植物應(yīng)對(duì)環(huán)境變化、生物脅迫等方面存在重要作用，但TCP家族成員高度冗余的特性也增加了相關(guān)研究進(jìn)一步開(kāi)展的難度［38-39］。

4 結(jié)論

本研究發(fā)現(xiàn)，茄子TCP 蛋白的蛋白序列信息、二級(jí)結(jié)構(gòu)存在較大差別，茄子32 個(gè)TCP 家族成員廣泛而非均勻分布于茄子的12 條染色體上；親緣關(guān)系相近的番茄和茄子具有更多的聚類分支；本研究中，茄子TCP 家族能夠響應(yīng)4 種非生物脅迫及青枯菌脅迫。尤其在高溫處理下，Class Ⅰ類TCP 中多數(shù) 成員包 括SmTCP1、SmTCP3、SmTCP4、SmTCP6、SmTCP7、SmTCP11、SmTCP15、SmTCP18SmTCP21、SmTCP27、SmTCP31均存在較為明顯的上調(diào)，因此茄子Class Ⅰ類TCP 在高溫及相關(guān)脅迫響應(yīng)中可能具有重要作用。激素處理下，茄子TCP 對(duì)ABA 處理存在一定上調(diào)響應(yīng)，SA 處理下則整體出現(xiàn)下調(diào)表現(xiàn)。不同器官與組織間SmTCP表達(dá)量存在較大區(qū)別，整體而言SmTCP在葉片與果實(shí)中的表達(dá)量較高。但截至目前，有關(guān)TCP 轉(zhuǎn)錄因子與植物耐逆性方面的研究仍然處于起步階段。研究發(fā)現(xiàn)有關(guān)TCP 家族在脅迫處理下的表現(xiàn)暗示TCP 家族與植物逆境響應(yīng)之間存在密切聯(lián)系，研究結(jié)果為進(jìn)一步探究茄子TCP 基因的生物學(xué)功能及茄子的分子生物育種具有一定參考作用。