紫斑牡丹花粉破壁工藝優(yōu)化及其金屬元素測定

王新娣，石曉峰*，李 運，沈 薇，劉東彥，范 彬，馬趣環(huán)

(1.甘肅省醫(yī)學(xué)科學(xué)研究院，甘肅蘭州 730050；2.蘭州市食品藥品檢驗檢測研究院，甘肅蘭州 730030)

紫斑牡丹(Paeoniarockii)是毛茛科芍藥屬多年生木本植物，因花瓣基部有一個明顯的紫斑而得名[1]，其主要分布于四川北部、甘肅南部、陜西秦嶺中段以西，是我國中西部地區(qū)的特有中藥材和花中珍品[2]。紫斑牡丹花粉中富含有多種營養(yǎng)素、維生素和礦物質(zhì)，還含有大量天然活性物質(zhì)，如黃酮類化合物、酶、激素、核酸和有機酸等[3]，由于花粉壁具有異常耐酸耐堿耐腐蝕的堅硬外壁，阻礙了人體對花粉活性成分消化吸收，同時也阻止了花粉的高值化利用。因此，研究紫斑牡丹花粉破壁工藝對紫斑牡丹花粉綜合利用開發(fā)具有重要的意義。

目前花粉的破壁方法主要有生物法、化學(xué)法、物理法和復(fù)合法。曹紅剛等[4]用酵母、靈芝、杏鮑菇、羊肚菌4種真菌發(fā)酵油菜蜂花粉，其破壁率為 66.53%～79.10%。林瑾等[5]采用NaOH和H2O2預(yù)處理玫瑰蜂花粉，使其外壁破壞，再使用纖維素酶、黃瓜提取液和稀鹽酸溶液處理玫瑰蜂花粉，其破壁率達到99%。余勃[6]應(yīng)用微粉碎對茶花粉進行破壁處理，花粉破壁率達100%。何余堂等[7]采用溫差法、超聲波法、酶法和混合法4種方法對玉米花粉進行破壁處理，其破壁率分別為超聲波法31.2%、溫差法46.3%、酶法80.4%、混合法98.6%。上述諸多花粉破壁的方法各有優(yōu)缺點，有的方法設(shè)備成本投資較大，花粉破壁率高；有的方法成本低，花粉破壁率也低；有的方法引入其他化學(xué)溶劑，使樣品污染的可能性增大；有些方法處理周期長，導(dǎo)致花粉容易變質(zhì)。在諸多的花粉破壁方法中，究竟哪一種更適合紫斑牡丹花粉，且營養(yǎng)成分損失小，破壁率高，還需要進行更多的試驗驗證。因此，該研究選投資成本低的溫差破壁法，響應(yīng)面試驗優(yōu)化牡丹花粉溫差破壁工藝，以破壁率為評價指標對紫斑牡丹花粉進行破壁，并測定和分析牡丹花粉中金屬含量變化，為紫斑牡丹花粉的綜合利用和開發(fā)奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑紫斑牡丹花粉，蘭州新區(qū)中川牡丹園提供，儲存于冰箱-18 ℃；99.99%氬氣，上海通輝特種氣體有限公司；99.99% 氦氣，上海通輝特種氣體有限公司；Mn、Zn、Pb、Cr、Cd、As 標準儲備液，美國安捷倫科技股份有限公司;濃硝酸，色譜純，德國默克化工技術(shù)有限公司。

1.2 主要儀器與設(shè)備MDF-C2156VAN低溫冷凍存儲箱，日本三洋公司； BCD-237HF可變溫冰箱，青島Haier 集團；DW-86L626超低溫保存箱，青島Haier 集團；BH-2日本電子顯微鏡，OLYMPUS公司；AE260萬分之一電子天平，瑞士Mettle Toledo 公司；PT-10 pH計，德國Sartorius公司；DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌浴，鄭州長城科工貿(mào)有限公司；Agilent 7900型電感耦合等離子體質(zhì)譜儀，美國安捷倫科技股份有限公司；UltraCLAVELV微波消解儀，意大利麥爾斯通有限公司；Milli-Q IQ7000超純水系統(tǒng)，密理博中國有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1牡丹花粉的預(yù)處理。將牡丹花粉均勻鋪在白色瓷盤上面，厚度不超過0.5 cm，蓋上一塊白布，低溫烘干，直至花粉中水分降至5%以下，過7號篩除雜，得到精選的牡丹花粉。

1.3.2破壁率的測定。分別精密稱取未經(jīng)破壁處理花粉和破壁后花粉適量，制成相同濃度的混懸液，吸取相同體積混懸液，制片，在400倍電子顯微鏡下進行鏡檢，以未破壁花粉為對照。每個樣品重復(fù)制片3張，每片5個視野，觀察視野內(nèi)的細胞破碎情況，求平均值。根據(jù)公式破壁率=(1-A/B)×100%計算破壁率，式中，A為視野中未破壁的細胞數(shù)；B為視野中細胞總數(shù)。

1.3.3溫差破壁法的工藝優(yōu)選。將精選的紫斑牡丹花粉按溫差破壁工藝流程(紫斑牡丹花粉—低溫冷凍—高溫解凍—離心收集—低溫干燥—破壁花粉)進行操作，按“1.3.2”方法測定花粉破壁率，采用單因素和響應(yīng)面試驗優(yōu)選其破壁工藝。

1.3.4單因素試驗。以破壁率為指標，采用控制變量法考察冷凍溫度、液料比、冷凍時間、解凍時間、解凍溫度對紫斑牡丹花粉破壁率的影響。

1.3.5響應(yīng)面優(yōu)化試驗。以單因素試驗數(shù)據(jù)為基礎(chǔ)，以液料比、解凍時間、解凍溫度為響應(yīng)變量，破壁率為響應(yīng)值，利用DesignExpert 8.0.6軟件進行4因素3水平響應(yīng)面試驗優(yōu)化花粉破壁工藝，試驗因素與水平設(shè)計見表1。

1.3.6紫斑牡丹花粉中金屬元素的測定。

1.3.6.1供試品溶液的制備。 取花粉樣品于60 ℃干燥4 h，取約0.3 g，精密稱定，置于微波消解罐中，加65%硝酸3.0 mL、超純水1.0 mL，按表2程序進行消解。冷卻后取出消解管，將消化液轉(zhuǎn)移至50 mL容量瓶中，用少量超純水洗滌消解管3次，合并洗滌液至容量瓶中，用超純水定容至刻度，搖勻，作為供試品原液，備用[8-9]。同時同法制備空白對照及標準參考物質(zhì)。

表1 響應(yīng)面試驗因素和水平Table 1 Element and levels of RSM test

表2 微波消解程序Table 2 Procedures of microwave digestion

1.3.6.2儀器條件。采用氦氣碰撞反應(yīng)池模式，用調(diào)諧液對儀器質(zhì)量軸、分辨率、靈敏度、雙電荷、氧化物進行優(yōu)化。氬氣為載氣，氦氣為碰撞氣體，等離子體氣流速15.0 L/min，載氣流速1.17 L/min，霧化器為Barbinton，石英雙通道霧化室，射頻功率1 300 W，霧化室溫度2 ℃，碰撞模式為氦氣流量5.0 mL/min，蠕動泵轉(zhuǎn)數(shù)為30 r/min，采樣深度8.0 mm，測點數(shù)3，分析時間0.1 s，重復(fù)次數(shù)3，全定量分析模式。

1.3.6.3樣品的含量測定。紫斑牡丹花粉破壁前后10種金屬元素的測定按“1.3.6.1”和“1.3.6.2”方法，采用內(nèi)標法進行定量測定，每個樣品平行測定3次，計算各元素的平均含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 紫斑牡丹花粉破壁前后的顯微特征觀察未破壁紫斑牡丹花粉和破壁紫斑牡丹花粉分別置400倍電子顯微鏡下觀察，發(fā)現(xiàn)破壁前花粉絕大多數(shù)為單花粉，少數(shù)為復(fù)合花粉，均被一層完整的膜包裹；破壁的花粉其包裹的膜層完全破裂、內(nèi)容物散在(圖1)。

圖1 紫斑牡丹花粉破壁前(a)、后(b)的顯微結(jié)構(gòu)Fig.1 Microstructure of Paeonia rockii pollen before (a) and after (b) wall-breaking

2.2 單因素試驗

2.2.1冷凍溫度對紫斑牡丹花粉破壁率的影響。稱取精選牡丹花粉適量，4份，分別裝入塑料容器中，加蓋密封，置于冷凍裝置中分別于-10、-20、-75、-150 ℃冷凍24 h，取出，迅速加入20倍的95 ℃沸水，搖勻，置50 ℃水浴中中速攪拌6 h，得到花粉混合溶液；然后在高速離心機中離心10 min，所獲固體物質(zhì)于15～25 ℃的條件下干燥，即得到破壁牡丹花粉成品，測定其破壁率，結(jié)果見圖2。由圖2可知，隨著冷凍溫度降低，破壁率在提高，當冷凍溫度為-150 ℃時，破壁率達到了最高值，由此確定冷凍溫度為-150 ℃，亦即溫差為245 ℃。

圖2 冷凍溫度對紫斑牡丹花粉破壁率的影響Fig.2 Effect of freezing temperature on wall-broken rate of Paeonia rocki pollen

2.2.2液料比對紫斑牡丹花粉破壁率的影響。稱取精選牡丹花粉適量，6份，分別裝入塑料容器中，加蓋密封，置于冷凍裝置中于-150 ℃冷凍24 h，取出，迅速加入不同液料比(5∶1、10∶1、15∶1、20∶1、25∶1、30∶1)的95 ℃沸水，其他步驟同“2.2.1”方法操作，結(jié)果見圖3。由圖3可知，隨著液料比的增加破壁率不斷增加，當液料比為20∶1時，破壁率達到最大，之后隨液料比增加破壁率下降，究其原因可能是水量的多少會影響攪拌的力度。由此將液料比定為15∶1～25∶1。

圖3 液料比對紫斑牡丹花粉破壁率的影響Fig.3 Effect of liquid-solid ratio on wall-broken rate of Paeonia rockii pollen

2.2.3冷凍時間對紫斑牡丹花粉破壁率的影響。稱取精選牡丹花粉適量，5份，分別裝入塑料容器中，加蓋密封，置于冷凍裝置中于-150 ℃冷凍不同時間(12、24、48、72、96 h)，取出，迅速加入20∶1的95 ℃沸水，其他步驟同“2.2.1”方法操作，結(jié)果見圖4。由圖4可知，冷凍12～24 h時，破壁率有較為明顯的上升趨勢，冷凍超過24 h后對破壁率影響不大，考慮到時間和效率的問題，將冷凍時間固定為24 h。

圖4 冷凍時間對紫斑牡丹花粉破壁率的影響Fig.4 Effect of freezing time on wall-broken rate of Paeonia rockii pollen

2.2.4解凍時間對紫斑牡丹花粉破壁率的影響。稱取精選牡丹花粉適量，5份，分別裝入塑料容器中，加蓋密封，置于冷凍裝置中于-150 ℃冷凍24 h，取出，迅速加入20倍的95 ℃沸水，搖勻，置50 ℃水浴中中速攪拌，分別解凍2、4、6、8、10 h，其他步驟同“2.2.1”方法操作，結(jié)果見圖5。由圖5可知，破壁率隨著解凍時間的延長而增加，當超過6 h時破壁率基本呈平緩趨勢，故將解凍時間固定為6 h左右。

圖5 解凍時間對紫斑牡丹花粉破壁率的影響Fig.5 Effect of defreeze time on the wall-broken rate of Paeonia rockii pollen

2.2.5解凍溫度對紫斑牡丹花粉破壁率的影響。稱取精選牡丹花粉適量，5份，分別裝入塑料容器中，加蓋密封，置于冷凍裝置中于-150 ℃冷凍24 h，取出，迅速加入20倍的95 ℃沸水，搖勻，分別置不同溫度(18、28、38、48、58 ℃)水浴中中速攪拌，分別解凍6 h，其他步驟同“2.2.1”方法操作，結(jié)果見圖6。由圖6可知，解凍時溫度在18～28 ℃，花粉的破壁率較大，當溫度大于28 ℃時花粉破壁率呈明顯下降趨勢，而18～28 ℃基本是室溫水平，故從降低耗能的角度考慮，解凍溫度控制在18～28 ℃最佳。

圖6 解凍溫度對紫斑牡丹花粉破壁率的影響Fig.6 Effect of defreeze temperature on the wall-broken rate of Paeonia rockii pollen

2.3 響應(yīng)面優(yōu)化試驗

2.3.1試驗設(shè)計及結(jié)果。由單因素試驗篩選出的最佳溫差破壁工藝條件為冷凍溫度-150 ℃、冷凍時間24 h、液料比15∶1～25∶1、解凍時間6 h左右、解凍溫度18～28 ℃。固定冷凍溫度和冷凍時間，選擇影響溫差破壁工藝的因素液料比、解凍時間、解凍溫度，以花粉的破壁率(Y)為響應(yīng)值，根據(jù)Box-benhnken試驗設(shè)計原理，設(shè)計3因素3水平試驗，然后按表1設(shè)計進行試驗，結(jié)果見表3。

表3 Box-Behnken 試驗設(shè)計及試驗結(jié)果Table 3 Design and results of Box-Behnken experiments

2.3.2模型的建立及顯著性檢驗。利用 DesignExpert 8.0.6軟件對表3數(shù)據(jù)進行回歸分析，得到花粉的破壁率(Y)對液料比(A)、解凍時間(B)、解凍溫度(C)的二元多項回歸模型為Y=-159.307 08+13.209 8A+41.111 863B-1.445 40C-0.099 5AB+0.013 3AC+0.076 6BC-0.331 03A2-2.915 81B2+3.067 5C2。通過對回歸模型進行方差分析(表4)，可以看出模型的F=43.74(P< 0.000 1)，模型方程具有極顯著性；失擬項P=0.056 0，說明未知因素對試驗結(jié)果影響不顯著；回歸決定系數(shù)(R2)為0.982 5，說明 98.25%的響應(yīng)值變化來源于所選因素；修正回歸決定系數(shù)(Radi)為0.960 1，說明該模型能解釋 96.01%的響應(yīng)值變化；預(yù)測值與試驗值具有高度相關(guān)性，說明該回歸方程對試驗擬合度較好，試驗結(jié)果可靠。由回歸方程和方差分析還可看出，一次項中B、C對破壁率具有極顯著影響，A對破壁率影響不顯著，交互項中AB、BC、AC對破壁率影響不顯著；二次項中A2、B2對破壁率有極顯著影響，而C2對破壁率影響不顯著，說明所得回歸方程能夠很好地預(yù)測花粉破壁率隨各響應(yīng)因子的變化而變化。

表4 方差分析Table 4 Analysis of variances

2.3.3響應(yīng)面分析。依回歸模型作出各因素對花粉破壁率影響的響應(yīng)面圖，考察響應(yīng)面的形狀，分析溫差破壁各因素對花粉破壁率的影響，結(jié)果見圖7。

交互作用的大小可由等高線的形狀來反映，若呈橢圓形，說明兩因素的交互作用顯著，若呈圓形則相反，而響應(yīng)面曲線較陡也說明兩因素交互作用顯著。由圖7可知，BC有一定的交互作用。

2.3.4最佳破壁工藝條件的確定和驗證試驗。通過DesignExpert 8.0.6軟件對回歸方程進行求解，得到牡丹花粉溫差破壁的最佳工藝條件:冷凍溫度-150 ℃、冷凍時間24 h、液料比19.27∶1、解凍時間6.96 h、解凍溫度20 ℃，其理論破壁率為93.11%?？紤]到實際操作的簡便性和可操作性，調(diào)整工藝條件為冷凍溫度-150 ℃、冷凍時間24 h、液料比20∶1、解凍時間7 h、解凍溫度20 ℃。在此最優(yōu)破壁條件下進行3次平行驗證試驗，得到牡丹花粉的平均破壁率為 92.82%，與理論值間誤差較小，說明利用響應(yīng)面優(yōu)化得到的條件準確、可行。

2.4 紫斑牡丹花粉樣品中金屬元素測定取紫斑牡丹花粉按“1.3.6.1”方法制備供試品溶液, 依法測定，計算出供試品溶液質(zhì)量濃度，即得各元素的具體含量，結(jié)果見表5。從表5可以看出，紫斑牡丹花粉中金屬元素 Zn、Mg、 K、 Ca、Mn、 Fe、 Sr含量較高，參考《藥用植物及制劑進出口綠色行業(yè)標準》及《中華人民共和國藥典》中對中藥材(飲片)中重金屬及砷鹽限量指標(Pb≤5.0 mg/kg、Cd≤0.3 mg/kg、As≤2.0 mg/kg)，紫斑牡丹花粉中有毒金屬元素Pb、Cd、As含量低于檢出限。

3 討論與結(jié)論

花粉的細胞壁由內(nèi)壁和外壁組成，外壁主要成分是孢粉素，是一種高分子氧化聚合物，使得花粉外壁非常堅硬，即使人體在消化過程中未能完全破壞外壁。花粉破壁不可避免地破壞了其營養(yǎng)成分，特別是酶類物質(zhì)，而且花粉破壁后不易保存[10]。紫斑牡丹花粉是否應(yīng)該破壁將在后續(xù)的試驗中求證。

圖7 液料比、解凍時間、解凍溫度對花粉破壁率的等高線和響應(yīng)面Fig.7 Contour line and surface plot of liquid-solid ratio,defreeze time and defreeze temperature on the wall-broken rate of Paeonia rockii pollen

表5 紫斑牡丹花粉破壁前后10種金屬元素的含量比較(n=3)

該試驗以牡丹花粉破壁率為指標，采用單因素試驗對影響溫差破壁的因素(冷凍溫度、冷凍時間、液料比、解凍時間、解凍溫度)進行了遴選，在此基礎(chǔ)上通過固定冷凍溫度和冷凍時間，選擇影響溫差破壁工藝的因素(液料比、解凍時間、解凍溫度)，根據(jù)Box-benhnken試驗設(shè)計原理，優(yōu)化得到牡丹花粉溫差破壁的最佳工藝，即精選牡丹花粉裝入塑料容器中，加蓋密封，置于冷凍裝置中于-150 ℃冷凍24 h，取出，迅速加入20倍的95 ℃沸水，搖勻，置20 ℃水浴中中速攪拌7 h，得到花粉混合溶液；然后在高速離心機中離心10 min，所獲固體物質(zhì)于15～25 ℃的條件下干燥，即得到破壁牡丹花粉成品，經(jīng)驗證該工藝的平均破壁率為 92.82%，說明工藝合理可行。

該試驗利用ICP-MS法對產(chǎn)自甘肅蘭州的紫斑牡丹花粉中10種元素進行了定量分析，結(jié)果顯示，紫斑牡丹花粉中宏量元素K、Mg、Ca的含量分別為13 649.5、2 441.3、743.7 μg/g；其他微量金屬元素中含量較高的為Zn、Fe、Mn，其含量分別為114.29、73.34、66.79 μg/g；紫斑牡丹花粉中有毒金屬元素Pb、Cd、As含量低于檢出限，符合行業(yè)標準及藥典的要求。故紫斑牡丹花粉是一種無污染天然的保健食品。

通過對紫斑牡丹花粉破壁前后金屬元素的對比分析，發(fā)現(xiàn)固體顆粒中的Mn、Zn、Sr、Fe、K、Mg、Ca等金屬元素的含量均有所下降，這可能是紫斑牡丹花粉破壁后有大量的金屬元素從細胞壁內(nèi)釋放出來，一部分溶解于溶液中，從而造成破壁后固體顆粒中金屬元素含量減少，破壁后有利于微量元素和營養(yǎng)物質(zhì)的釋放。