外周血LGR5、ALDH1對(duì)非小細(xì)胞肺癌化療患者預(yù)后的預(yù)測(cè)價(jià)值及模型構(gòu)建

王慧， 崔方博， 陳媛媛

肺癌是全球范圍內(nèi)常見的惡性腫瘤之一，發(fā)病率及死亡率居世界前列，其中85%為非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)，多數(shù)患者在就診時(shí)已為晚期，失去最佳手術(shù)時(shí)機(jī)[1-2]。針對(duì)此類患者多采取化療、放療及生物治療等綜合治療方案，但即使是采取多種綜合治療方案，肺癌5年生存期仍較低[3]。尋找簡(jiǎn)單方便的血清生化標(biāo)志物在對(duì)NSCLC化療患者預(yù)后的預(yù)測(cè)具有重要臨床意義。富含亮氨酸的G蛋白偶聯(lián)受體5(leucine-rich repeat containing G protein-coupled receptor 5，LGR5)是一種結(jié)直腸癌干細(xì)胞表面標(biāo)志分子之一，與腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)增殖、侵襲有關(guān)[4-5]。乙醛脫氫酶l(acetaldehyde dehy-drogenase1，ALDHl)是乙醛脫氫酶家族成員之一，可催化細(xì)胞內(nèi)乙醛氧化為乙酸的一種細(xì)胞溶質(zhì)酶，廣泛參與正常組織的發(fā)育及機(jī)體內(nèi)環(huán)境維持[6]。腫瘤干細(xì)胞往往導(dǎo)致腫瘤治療效果不佳，有研究表明[7]，NSCLC細(xì)胞株中可分離出干細(xì)胞樣腫瘤細(xì)胞，ALDHl表達(dá)與患者預(yù)后情況有關(guān)。目前臨床關(guān)于外周血LGR5、ALDH1在經(jīng)化療后NSCLC患者的預(yù)后預(yù)測(cè)的研究較少，鑒于此，本研究擬分析肺癌患者外周血LGR5、ALDH1對(duì)NSCLC化療患者預(yù)后的預(yù)測(cè)價(jià)值及模型構(gòu)建?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

選取馬鞍山市人民醫(yī)院2019年6月至2021年6月收治的50例NSCLC患者。納入標(biāo)準(zhǔn)：①經(jīng)細(xì)胞學(xué)或組織學(xué)證實(shí)為非小細(xì)胞肺癌；②入組前未經(jīng)過(guò)放化療及免疫治療等抗腫瘤治療；③化療方案為含鉑類基礎(chǔ)的聯(lián)合化療，每2個(gè)化療周期復(fù)查1次，以評(píng)估化療效果；④無(wú)血液及肝性疾病者；⑤所有患者對(duì)于本研究均知情同意。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并其他惡性腫瘤；②合并肺部感染及全身感染者；③合并自身免疫性疾病或其他重要器官功能不全者。本研究已通過(guò)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 方法

1.2.1 檢測(cè)兩組外周血LGR5、ALDHl水平 分別在入院第2天收集NSCLC患者的空腹靜脈血5 ml，檢測(cè)患者外周血LGR5、ALDHl水平。LGR5檢測(cè)：在血液標(biāo)本中加入乙二胺四乙酸100 μl抗凝，隨后將200 μl紅細(xì)胞裂解液，收集上清液，采用蛋白質(zhì)定量試劑盒(上海富雨生物科技有限公司)檢測(cè)蛋白濃度，十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDA-PAGE)，垂直電泳分離，待膠凝固后，拔去梳子，采用電泳緩沖液清洗上樣孔，上樣量為30 μg/孔，將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯膜，再采用含5%脫脂牛奶的Tris-HCI緩沖鹽溶液及Tween溶液制成的封閉液室溫封閉聚偏二氟乙烯膜1 h。加入抗體溶液為5%脫脂奶粉的LGR5單克隆抗體(上海群己生物科技有限公司)室溫孵育4 h，采用TTBS洗滌，隨后加入二抗(采用封閉液稀釋后)，室溫下孵育聚偏二氟乙烯膜1.5 h，采用TTBS洗滌，顯色，定量采用Image Quant TL軟件進(jìn)行。ALDHl檢測(cè)：采用酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)患者ALDHl水平。酶聯(lián)免疫吸附試劑盒由上海恒遠(yuǎn)生化試劑有限公司提供。

1.2.2 資料收集 收集患者的性別、年齡、吸煙史、病理類型、TNM分期、腫瘤大小、腫瘤分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況等基本資料。

1.2.3 療效評(píng)價(jià) 參考實(shí)體瘤療效評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)1.1版[8]，對(duì)患者的臨床療效進(jìn)行評(píng)估：疾病穩(wěn)定(stable ddisease，SD)、疾病進(jìn)展(progressive disease，PD)、部分緩解(partial response，PR)、完全緩解(complete response，CR)。

1.2.4 隨訪 通過(guò)電話或門診方式對(duì)受試對(duì)象進(jìn)行隨訪，隨訪內(nèi)容為病情復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移及死亡等，隨訪至2022年6月30日，記錄患者總生存時(shí)間(overall survival，OS)。OS定義為開始化療時(shí)間至全因死亡或隨訪截止時(shí)間，以月為單位進(jìn)行計(jì)算[9]。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 外周血LGR5、ALDHl臨界值的判斷及對(duì)NSCLC化療患者的預(yù)后預(yù)測(cè)價(jià)值

隨訪至2022年6月30日，中位隨訪時(shí)間25個(gè)月，死亡28例(56.00%)。根據(jù)ROC曲線圖結(jié)果顯示，外周血LGR5及ALDHl最佳截?cái)嘀捣謩e為0.65 μg/L、7.26 μg/L，外周血LGR5、ALDHl及二者聯(lián)合曲線下面積(AUC)分別為0.721、0.758、0.836，靈敏度分別為71.43%、64.29%、86.31%，特異度分別為62.65%、73.46%、82.33%。AUC比較結(jié)果顯示，二者聯(lián)合預(yù)測(cè)優(yōu)于單一指標(biāo)預(yù)測(cè)(P<0.05)。見圖1及表1。

圖1 外周血LGR5、ALDHl預(yù)測(cè)NSCLC化療患者的預(yù)后價(jià)值ROC曲線圖

表1 外周血LGR5、ALDHl對(duì)NSCLC化療患者的預(yù)后預(yù)測(cè)價(jià)值比較

2.2 NSCLC組患者外周血LGR5、ALDHl與患者臨床特征的關(guān)系

以外周血LGR5、ALDHl最佳截?cái)嘀祵⒒颊哌M(jìn)行分組，其中LGR5≥0.65表示為高LGR5組，LGR5<0.65 μg/L表示為低LGR5組；ALDHl≥7.26 μg/L表示為高ALDHl組，ALDHl<7.26 μg/L表示為低ALDHl組。結(jié)果顯示，低LGR5組和高LGR5組的病理類型、TNM分期、腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、療效，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，而年齡、性別、吸煙史、腫瘤分化程度，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。低ALDHl組和高ALDHl組的病理類型、TNM分期、腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，年齡、性別、吸煙史、腫瘤分化程度及療效，差異則無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

表2 NSCLC組患者外周血LGR5、ALDHl與患者臨床特征的關(guān)系[例(%)]

2.3 NSCLC組患者外周血LGR5、ALDHl與患者生存時(shí)間的關(guān)系

生存曲線圖結(jié)果顯示，高LGR5組、低LGR5組中位OS分別為：10個(gè)月(95%CI：7.62～12.33)、15個(gè)月(95%CI：8.25～18.69)，組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，高ALDHl組、低ALDHl組中位OS分別為9個(gè)月(95%CI：5.78～11.75)、13個(gè)月(95%CI：8.10～17.64)，組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖2。

圖2 NSCLC患者外周血LGR5、ALDHl與患者生存時(shí)間的關(guān)系

2.4 影響NSCLC化療患者預(yù)后的因素

Cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型分析結(jié)果顯示，高LGR5與低LGR5患者相比，HR為2.324(95%CI:1.175～5.085)(P<0.05)，高ALDHl與低ALDHl患者相比，HR為2.258(95%CI:1.235～4.625)(P<0.05)。校正混雜因素(年齡、性別、吸煙史等)后，高LGR5與低LGR5患者相比，校正HR為2.236(95%CI:1.123～5.054)(P<0.05)，高ALDHl與低ALDHl患者相比，校正HR為2.210(95%CI:1.102～4.837)(P<0.05)，表示外周血LGR5及ALDHl均是影響NSCLC化療患者預(yù)后的危險(xiǎn)因素。見表3。根據(jù)Cox多因素分析篩選出來(lái)的6項(xiàng)指標(biāo)為，建立Cox生存預(yù)測(cè)方程得到：h(t，X)=h0(t)exp(0.457X1+0.562X2+0.485X3+0.574X4+0.712X5+0.479X6)，因此預(yù)后指數(shù)(PI)=0.457X1+0.562X2+0.485X3+0.574X4+0.712X5+0.479X6，χ2=98.75(P<0.01)，其中X1為L(zhǎng)GR5，X2為ALDH1，X3為病理類型，X4為TNM分期，X5為腫瘤大小，X6為淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，PI指數(shù)越大，患者風(fēng)險(xiǎn)越大，預(yù)后越差。

表3 影響NSCLC化療患者預(yù)后的因素

3 討論

腫瘤干細(xì)胞具有自我更新及分化能力，對(duì)放化療具有一定抵抗力，可引起腫瘤進(jìn)展及復(fù)發(fā)[10]。因此，靶向定位及殺傷腫瘤干細(xì)胞可能成為肺癌治療的一種新思路。隨著分子核醫(yī)學(xué)的發(fā)展及其在腫瘤治療中的應(yīng)用，探索分析NSCLC的腫瘤干細(xì)胞特異性標(biāo)志物，對(duì)臨床了解腫瘤轉(zhuǎn)歸及患者預(yù)后具有重要作用。LGR5在人體正常組織中表達(dá)具有局限性，但其在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤、胃腸道、卵巢及肝臟等腫瘤組織中，LGR5存在表達(dá)程度不同的改變[11-12]。Cox多因素分析結(jié)果顯示，外周血LGR5、ALDHl均為NSCLC化療患者預(yù)后的危險(xiǎn)因素。表示LGR5在NSCLC的發(fā)生及發(fā)展中亦具有重要作用。多項(xiàng)研究顯示，LGR5可在多種腫瘤組織中呈現(xiàn)高表達(dá)[13-14]。Chen等[15]研究中表示，LGR5在肝細(xì)胞癌組織中表達(dá)水平較高，且可能與肝細(xì)胞癌患者預(yù)后不良有關(guān)，故推測(cè)LGR5可能是肝細(xì)胞癌臨床治療中的潛在靶向指標(biāo)。ALDHl不僅可調(diào)節(jié)醛類代謝，還在細(xì)胞分化增殖及轉(zhuǎn)移中具有關(guān)鍵性作用。在不同的實(shí)體瘤環(huán)境下，表達(dá)ALDHl的癌細(xì)胞可因其自身的自我更新及高克隆等特性表現(xiàn)出腫瘤干細(xì)胞特性[16-17]。一項(xiàng)Meta分析顯示[18]，ALDHl可作為結(jié)直腸癌、乳腺癌及頭頸部腫瘤預(yù)后患者的一項(xiàng)生物標(biāo)志物。本研究中發(fā)現(xiàn)LGR5與病理類型、TNM分期、腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、療效相關(guān)，ALDHl與病理類型、TNM分期、腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)，低LGR5與低ALDHl組OS較高LGR5與高ALDHl更長(zhǎng)，表明外周血LGR5、ALDH1與NSCLC化療患者預(yù)后有關(guān)。

Wnt信號(hào)通路作用于人體生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中，參與至人體胚胎發(fā)育干細(xì)胞分化增殖及腫瘤形成[19]。LGR5是一種Wnt信號(hào)通路中的靶向基因，當(dāng)此通路被異常激活時(shí)，LGR5水平可能影響癌組織中上皮細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)變。本研究中亦得到低水平LGR5患者生存時(shí)間更長(zhǎng)這一結(jié)論，再次表明LGR5與NSCLC化療患者預(yù)后相關(guān)。分析原因可能是過(guò)度表達(dá)的LGR5增強(qiáng)了腫瘤干細(xì)胞的活性，加速腫瘤干細(xì)胞的多向分化及自我更新，可能加速了腫瘤細(xì)胞由起始部位向周圍正常組織侵襲的過(guò)程，促使細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化加快，預(yù)后較差。

綜上，外周血LGR5、ALDHl可作為有效預(yù)測(cè)NSCLC化療患者預(yù)后的指標(biāo)，其表達(dá)與患者預(yù)后不良有關(guān)，有望成為NSCLC靶向治療的新靶點(diǎn)。本次研究存在一定不足之處，由于本次獲取得外周血標(biāo)本較少，加之隨訪時(shí)間不長(zhǎng)，在進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理時(shí)可能結(jié)果會(huì)有偏倚性，后續(xù)還需開展大樣本及多中心的臨床研究以進(jìn)一步證實(shí)本次研究觀點(diǎn)。