FOXP3與乳腺癌病理特征和預(yù)后的相關(guān)性研究

姜林宏， 李蕾， 鐘山亮， 王丹丹， 張建， 唐金海， 張鶴達(dá)

乳腺癌已經(jīng)成為全球女性發(fā)病率最高的惡性腫瘤，占女性惡性腫瘤總發(fā)病率的30%，且總死亡率僅次于肺癌，占女性惡性腫瘤總死亡率的15%。此外，乳腺癌發(fā)病率仍以每年約0.5%的速度繼續(xù)增長(zhǎng)[1]。目前手術(shù)、化療、放療，靶向治療等提高了乳腺癌的生存率，但是我們對(duì)乳腺癌發(fā)病機(jī)制和途徑的認(rèn)知仍有很大不足，需要不斷尋找乳腺癌新的治療靶標(biāo)。

叉頭樣轉(zhuǎn)錄因子(forkhead box protein 3，F(xiàn)OXP3)，是叉頭樣轉(zhuǎn)錄因子家族中的一員，被認(rèn)為是調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg細(xì)胞)最特異性的標(biāo)志[2-3]。Treg細(xì)胞是CD4+T細(xì)胞的免疫抑制亞群，具有保護(hù)性作用，其主要通過抑制T效應(yīng)細(xì)胞的功能來促進(jìn)腫瘤的生長(zhǎng)[4]。PD1可以通過促進(jìn)FOXP3的表達(dá)增加Treg細(xì)胞的穩(wěn)定性[5]。此外，文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)FOXP3在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起著重要的作用，如FOXP3作為wnt/β-catenin信號(hào)通路的共激活因子，促進(jìn)β-catenin-TCF4復(fù)合物的形成，同時(shí)激活EMT相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子，進(jìn)而誘導(dǎo)EMT信號(hào)通路，從而促進(jìn)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的增殖和侵襲轉(zhuǎn)移[6]；FOXP3可以與LINC00885的啟動(dòng)子特異性地相互作用，誘導(dǎo)LINC00885的轉(zhuǎn)錄，進(jìn)而激活EMT信號(hào)通路，從而增加子宮頸癌細(xì)胞的增殖和侵襲[7]。此外，在乳腺癌中，高劑量的花萼菌素可降低FOXP3的表達(dá)，進(jìn)而減少VEGF 和 MMP-9的表達(dá)，從而抑制乳腺癌細(xì)胞的遷移和侵襲[8]；此外，F(xiàn)OXPS可以與VEGF啟動(dòng)子相互作用，抑制其轉(zhuǎn)錄，從而下調(diào)VEGF的表達(dá)抑制乳腺癌的血管生成[9]。然而目前關(guān)于FOXP3在乳腺癌中的研究較少，本研究分析FOXP3在乳腺癌中的表達(dá)及預(yù)后，并通過免疫組化進(jìn)一步分析FOXP3在乳腺癌中的表達(dá)，為乳腺癌的診斷及治療提供更多有利的依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 UALCAN數(shù)據(jù)分析 UALCAN (http://ualcan.path.uab.edu/)是一個(gè)分析TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中RNA-seq和臨床資料在線數(shù)據(jù)庫(kù)，通過腫瘤數(shù)據(jù)庫(kù)UALCAN分析FOXP3在乳腺癌和癌旁組織中的表達(dá)，及其在不同乳腺癌分子分型及分期中的表達(dá)情況[10]。

1.2 Kaplan-Meier生存分析 Kaplan-Meier(http://kmplot.com/analysis/)是一個(gè)基于GEO、EGA和TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)Meta分析腫瘤預(yù)后的數(shù)據(jù)庫(kù)。將乳腺癌患者以FOXP3 mRNA表達(dá)的中位數(shù)為界分為高表達(dá)和低表達(dá)組，根據(jù)Kaplan-Meier在線分析FOXP3 mRNA的表達(dá)與乳腺癌預(yù)后的關(guān)系。

1.3 TIMER分析 TIMER (https://cistrome.shinyapps.io/timer/)是一個(gè)評(píng)估腫瘤浸潤(rùn)性免疫細(xì)胞及其臨床意義的在線數(shù)據(jù)庫(kù)，利用該數(shù)據(jù)庫(kù)分析乳腺癌中FOXP3與腫瘤浸潤(rùn)性免疫細(xì)胞的關(guān)系，包括B細(xì)胞、CD4+T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞。

1.4 免疫組化 選取鹽城市第一人民醫(yī)院病理科2014年至2016年存檔的手術(shù)切除或活檢的蠟塊標(biāo)本101例，經(jīng)3名有經(jīng)驗(yàn)的病理醫(yī)師確診。臨床資料完整；均為女性；年齡36～84歲，中位年齡54歲。本研究經(jīng)本院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)討論并通過，患者及家屬均簽署知情同意書。將乳腺癌組織依次采用二甲苯、梯度乙醇水化、PBS進(jìn)行脫蠟，檸檬酸緩沖液進(jìn)行抗原修復(fù)，PBS沖洗，內(nèi)源性過氧化物酶失活，滴加小鼠抗人PD-L1(DAKO，PD-L1試劑盒)、CD3、CD4、CD8、CD20、CD68多克隆抗體(CD系列是即用型抗體，邁新)，4 ℃冰箱過夜，滴加適量生物素標(biāo)記羊抗鼠二抗，室溫孵育30 min，PBS沖洗；然后滴加HRP標(biāo)記的鏈霉親和素，PBS沖洗，經(jīng)DAB顯色試劑盒顯色，蘇木素復(fù)染，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，封片，最后熒光倒置顯微鏡觀察PD-L1、CD3、CD4、CD8、CD20、CD68的表達(dá)。

1.5 統(tǒng)計(jì)分析 箱形圖以TPM值來評(píng)估組間基因表達(dá)水平的差異，兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，用log-rank檢驗(yàn)評(píng)價(jià)生存差異。采用Spearman相關(guān)檢驗(yàn)分析表達(dá)相關(guān)性。P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 FOXP3在乳腺癌組織中的表達(dá) 通過UALCAN數(shù)據(jù)庫(kù)分析，我們發(fā)現(xiàn)與癌旁組織相比，F(xiàn)OXP3在乳腺癌組織中表達(dá)高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)，圖1A；進(jìn)一步分析，在luminal型、HER2 陽性型和三陰性乳腺癌3種乳腺癌不同的分子分型中，F(xiàn)OXP3在腫瘤組織的表達(dá)均高于癌旁組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)，圖1B；在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的乳腺癌中，F(xiàn)OXP3在腫瘤組織的表達(dá)均高于癌旁組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)，圖1C、1D。

注：***為P<0.001圖1 FOXP3在癌旁及乳腺癌組織中的表達(dá) 1A：FOXP3在癌旁及乳腺癌組織中的表達(dá)；1B：FOXP3在癌旁及不同乳腺癌分型中的表達(dá)；1C：FOXP3在癌旁及不同級(jí)別乳腺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移中的表達(dá)；D：FOXP3在癌旁及不同分期乳腺癌轉(zhuǎn)移中的表達(dá)

2.2 FOXP3與免疫浸潤(rùn)細(xì)胞的關(guān)系 通過TIMER數(shù)據(jù)庫(kù)評(píng)估FOXP3表達(dá)系數(shù)和免疫細(xì)胞浸潤(rùn)之間的關(guān)系，結(jié)果顯示FOXP3與腫瘤純度(指腫瘤組織中腫瘤細(xì)胞所占的比例)、B細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞、CD4+T細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞的免疫浸潤(rùn)水平均有關(guān)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)，圖2。

圖2 FOXP3與腫瘤純度(2A)、B細(xì)胞(2B)、CD8+T細(xì)胞(2C)、CD4+T細(xì)胞(2D)、巨噬細(xì)胞(2E)、中性粒細(xì)胞(2F)和樹突狀細(xì)胞(2G)免疫浸潤(rùn)細(xì)胞的關(guān)系

2.3 乳腺癌患者中FOXP3的預(yù)后 通過Kaplan-Meier數(shù)據(jù)庫(kù)，評(píng)估FOXP3表達(dá)與乳腺癌預(yù)后的關(guān)系。FOXP3+以中位值作為臨界值分成低表達(dá)組(≤5%)和高表達(dá)組(>5%)。相比于FOXP3低表達(dá)組，F(xiàn)OXP3高表達(dá)組的總生存率(OS)降低(HR: 1.33,P=0.012)，圖3A。不同乳腺癌亞型中，僅在HER2陽性型乳腺癌患者中FOXP3的低表達(dá)組OS升高(HR:2.01,P=0.023)，圖3B。而在luminal型(HR:1.09,P=0.590)(圖3C)和三陰性乳腺癌(HR:0.78,P=0.53)(圖3D)中，F(xiàn)OXP3的表達(dá)與患者的OS無關(guān)，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

圖3 不同乳腺癌亞型中FOXP3高表達(dá)、低表達(dá)患者的Kaplan-Meier生存曲線 3A：乳腺癌患者中FOXP3高表達(dá)、低表達(dá)患者總生存率的生存曲線對(duì)比；3B：HER2陽性型乳腺癌患者中FOXP3高表達(dá)、低表達(dá)患者總生存率的生存曲線對(duì)比；3C：luminal型乳腺癌患者中FOXP3高表達(dá)、低表達(dá)患者總生存率的生存曲線對(duì)比；3D：三陰性乳腺癌患者中FOXP3高表達(dá)、低表達(dá)患者總生存率的生存曲線對(duì)比

2.4 FOXP3+與乳腺癌臨床病理特征的關(guān)系 對(duì)72例乳腺癌患者進(jìn)行免疫組化分析，以FOXP3+表達(dá)的中位值作為臨界值分成低表達(dá)組(≤5%)和高表達(dá)組(>5%)，發(fā)現(xiàn)FOXP3+表達(dá)水平與乳腺癌腫瘤大小無關(guān)，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，但FOXP3+表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、TNM分期有關(guān)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表1。

表1 FOXP3+低表達(dá)、高表達(dá)與乳腺癌臨床病理特征的關(guān)系

2.5 FOXP3+與免疫細(xì)胞標(biāo)記因子的關(guān)系 對(duì)免疫細(xì)胞標(biāo)記因子進(jìn)行免疫組化分析，免疫細(xì)胞標(biāo)記因子均以各自表達(dá)的中位值為臨界值進(jìn)行分組，分為CD20低表達(dá)組(≤5%)和高表達(dá)組(>5%)；CD68低表達(dá)組(≤10%)和高表達(dá)組(>10%)；CD3低表達(dá)組(≤20%)和高表達(dá)組(>20%)；CD4低表達(dá)組(≤10%)和高表達(dá)組(>10%)；CD8低表達(dá)組(≤20%)和高表達(dá)組(>20%))。發(fā)現(xiàn)CD20+的免疫細(xì)胞與乳腺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和TNM分期有關(guān)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，而其他免疫細(xì)胞標(biāo)記因子(PD-L1、CD68、CD3、CD4和 CD8)與乳腺癌TNM分期無關(guān)，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，表2。FOXP3+表達(dá)水平與CD3+，CD20+，CD68+免疫細(xì)胞標(biāo)記因子有關(guān)(P<0.05)，表3。

表2 免疫細(xì)胞標(biāo)記因子表達(dá)水平與乳腺癌臨床病理特征的關(guān)系

表3 FOXP3+表達(dá)水平與免疫細(xì)胞標(biāo)記因子的關(guān)系

3 討論

FOXP3 基因位于Xp11.23，由11個(gè)外顯子組成，可編碼1個(gè)由431個(gè)氨基酸組成的蛋白質(zhì)[11-12]。研究發(fā)現(xiàn)FOXP3具有腫瘤生物學(xué)功能，參與腫瘤的進(jìn)展，如FOXP3在舌鱗狀細(xì)胞癌中高表達(dá)，且與舌鱗狀細(xì)胞癌的病理分化和較差的患者生存率相關(guān)[13]。在上皮性卵巢癌中，F(xiàn)OXP3過表達(dá)可通過降低Ki-67和細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶(CDKs)的表達(dá)減少細(xì)胞增殖，同時(shí)FOXP3也可以下調(diào)MMP2和尿激酶型纖溶酶原激活物(uPA)抑制細(xì)胞遷移侵襲，另外FOXP3還可能部分通過抑制mTOR和 NF-kB信號(hào)通路抑制細(xì)胞的增殖和侵襲[14]。本研究發(fā)現(xiàn)，與癌旁組織相比，F(xiàn)OXP3在乳腺癌組織中表達(dá)更高，且在不同的乳腺癌分子分型中，F(xiàn)OXP3在luminal型、HER2 陽性型和三陰性乳腺癌3種乳腺癌分子分型的癌組織中的表達(dá)比在癌旁組織表達(dá)高，同時(shí)FOXP3在發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的乳腺癌組織中表達(dá)高，以上數(shù)據(jù)提示FOXP3可能與乳腺癌發(fā)生、發(fā)展有關(guān)。通過生存分析發(fā)現(xiàn)FOXP3的低表達(dá)與總生存率相關(guān)，然而在不同的乳腺癌分子分型中進(jìn)一步分析，發(fā)現(xiàn)僅在HER2陽性的患者中，F(xiàn)OXP3低表達(dá)者總生存率高，提示著FOXP3高表達(dá)不僅與乳腺癌不良預(yù)后有關(guān)，而且在HER2過表達(dá)時(shí)，F(xiàn)OXP3的激活可能促進(jìn)了腫瘤發(fā)生侵襲轉(zhuǎn)移或者免疫逃逸或者FOXP3與HER2有協(xié)同作用，這需要后續(xù)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證。既往研究表明FOXP3在調(diào)節(jié)Treg細(xì)胞的分化和發(fā)育中發(fā)揮著不可或缺的作用，并在腫瘤微環(huán)境中發(fā)揮重要作用[15]。Treg細(xì)胞是一類負(fù)免疫調(diào)控的T細(xì)胞，其可以阻止其他T細(xì)胞的活化，躲避免疫系統(tǒng)對(duì)腫瘤細(xì)胞的監(jiān)視，從而形成有效的免疫逃逸[16]。例如來源于腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞抑制免疫反應(yīng)的CD8+、FOXP3+ 、Treg細(xì)胞能夠抑制初始T細(xì)胞的增殖，從而導(dǎo)致前列腺癌的免疫抑制[17]；肝癌細(xì)胞中的FOXP3 + Treg可以通過抑制CD8+CTL 的增殖使免疫抑制增強(qiáng)，促進(jìn)腫瘤進(jìn)展[18]。為探究FOXP3在乳腺癌中與免疫浸潤(rùn)的關(guān)系，我們通過免疫化學(xué)標(biāo)記發(fā)現(xiàn)FOXP3+與腫瘤純度、B細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞、CD4+T細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞的免疫浸潤(rùn)水平均相關(guān)。CD68是巨噬細(xì)胞最可靠的標(biāo)記，CD3、CD4、CD8、PDL1主要存在于T細(xì)胞表面，CD20是在除漿細(xì)胞外的B細(xì)胞表面，均參與細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)。因此我們通過不同免疫細(xì)胞化學(xué)標(biāo)志物進(jìn)一步研究了FOXP3與免疫細(xì)胞標(biāo)記因子在乳腺癌中的表達(dá)。研究發(fā)現(xiàn)FOXP3+與乳腺癌腫瘤大小無關(guān)，但與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和TNM分期有相關(guān)性。而鐘戀君等[19]發(fā)現(xiàn)在三陰性乳腺癌中FOXP3與組織學(xué)分級(jí)呈正相關(guān)性，與患者腫瘤直徑、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移均無關(guān)，這可能與乳腺癌分子分型有關(guān)。同時(shí)我們進(jìn)一步分析PD-L1、CD3、CD4、CD8、CD20、CD68免疫細(xì)胞標(biāo)記因子在乳腺癌中的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)CD20+與乳腺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和TNM分期有關(guān)，而PD-L1、CD3+、CD4+、CD8+、CD68+卻與乳腺癌腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及TNM分期無關(guān)。而其他研究顯示CD4+，CD8+與三陰性乳腺癌腫塊大小呈負(fù)相關(guān)[19]，PD-L1與三陰性乳腺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，脈管癌栓呈正相關(guān)[20]，CD8+與三陰性乳腺癌組織學(xué)分級(jí)呈正相關(guān)[21]，CD68陽性的腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，較差的組織學(xué)分級(jí)相關(guān)[22]，這些結(jié)果差異可能與研究標(biāo)本中乳腺癌分型有關(guān)，需要后續(xù)研究進(jìn)一步驗(yàn)證。本研究發(fā)現(xiàn)FOXP3+與CD3+，CD20+，CD68+有關(guān)，提示FOXP3+可能通過影響腫瘤細(xì)胞的抗原呈提，抑制T細(xì)胞殺傷能力，從而達(dá)到腫瘤細(xì)胞的免疫逃逸。

綜上所述，F(xiàn)OXP3在乳腺癌組織中高表達(dá)，且與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及分期相關(guān)，同時(shí)FOXP3+與CD3+，CD20+，CD68+免疫浸潤(rùn)細(xì)胞相關(guān)，有望成為乳腺癌新的標(biāo)志物，但是目前研究尚缺乏分子機(jī)制的探索，F(xiàn)OXP3生物學(xué)功能及相關(guān)的免疫逃逸機(jī)制有待更深入的探究，這將為乳腺癌的臨床治療提供新途徑。